CN100420741C - 黄花乌头发根及其获得方法 - Google Patents

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本发明公开了一种黄花乌头发根及其获得方法。本发明所提供的黄花乌头发根，是以黄花乌头器官为外植体材料，以发根农杆菌进行转染，经发根培养后得到的。本发明所获得的黄化乌头发根可以通过液体培养的方式进行繁殖，繁殖速度快，生产周期短(约40天左右)，不受自然条件的影响，可以实现工业集约化生产，克服了人工种植黄花乌头时所具有的繁殖速度慢、生长周期长、产量低、遗传稳定性差等缺陷；发根中药用成分——关附甲素含量高，具有广阔的应用前景和利用价值。

Description

黄花乌头发根及其获得方法
技术领域
本发明涉及黄花乌头发根及其获得方法。
背景技术
关附甲素是一种治疗心绞痛的特效药品，用量极微就有很好的疗效。目前，国内主要是从黄花乌头(Aconitum Coreanum(Levl.)Rapaics)根(关白附)内提取关附甲素供药用。但天然黄花乌头常受气候的影响，季节性强，病虫害等也会严重影响黄花乌头的产量和质量；黄花乌头生长周期长，需5年才能采收1次，受气候及病虫害影响大，质量不稳定；并且，其根头小，单产低，严重制约黄花乌头在生产上的应用。扩大黄花乌头的种植，必定与粮食种植争地，不符合我国土地资源的现状。
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar.)为根瘤菌科，革兰氏阴性菌，根据来源不同，发根农杆菌分为8196和A4两大类，前者是从苹果树上分离得到的，致毒力较弱，后者是从玫瑰植株上分离得到的，致毒力较强。A4型菌株导致的转化组织合成各种农杆碱(agropine)，因此，又通常称之为农杆碱型菌株。发根农杆菌感染植物细胞后产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根(hairy root)，简称为毛根或发根。发根农杆菌细胞内含有Ri质粒(root inducing plasmid)，其大小为200-800kb。Ri质粒上含有T-DNA，其能转化植物细胞，表现发根性状。Ri质粒具有普通的质粒的特点：是细菌染色体外的遗传物质，能独立复制，为闭合环状双链DNA，可自我复制并具有遗传的稳定性，在特殊环境中对细菌的生存起着重要的作用。它具有可转移性、可重组性、可整合性、可消除性等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄花乌头发根及其获得方法。
本发明所提供的黄花乌头发根，是以黄花乌头器官为外植体材料，以发根农杆菌进行转染，经发根培养后得到的。
该黄花乌头发根的获得方法，包括如下步骤：
1)外植体的获得：将黄花乌头器官经消毒后转移到1/2MS固体培养基上，于黑暗条件下预培养2-7天；
2)转化发根：将经过预培养的黄花乌头器官浸入发根农杆菌菌液中感染5-20分钟，吸净菌液后再接种于含抗生素的1/2MS固体培养基上，在22℃-25℃下经过30-50天培养，得到黄花乌头发根。
为了能提高所获得的黄花乌头发根的产量与质量，黄花乌头发根还经过去菌培养和扩大培养；所述去菌培养是将发根从外植体上切割，在含抗生素的1/2MS固体培养基上进行培养，每3-5天继代1次，进行3-5次；所述扩大培养是将经过去菌培养的发根在1/2MS或1/2B5液体培养基中，于黑暗条件、22℃-25℃下进行培养。
在培育转染过程中，步骤1)发根农杆菌菌液中菌液浓度高于1×106个/mL；所用的抗生素通常有头孢拉定、头孢氨苄青霉素、羧苄青霉素等；浓度为200mg/L-500mg/L。
在本发明中，黄花乌头的各种器官，如叶片、根、茎、叶柄、花丝或花瓣等，均可以作为外植体的材料。
本发明所获得的黄化乌头发根在普通的组织培养基中即能进行生长繁殖，可以通过液体培养的方式进行培养，繁殖速度快，生产周期短(约40天左右)，不受自然条件的影响，可以实现工业集约化生产，克服了人工种植黄花乌头时所具有的繁殖速度慢、生长周期长、产量低、遗传稳定性差等缺陷；发根中药用成分——关附甲素含量高，具有广阔的应用前景和利用价值。
附图说明
图1为本发明黄花乌头发根的照片。
具体实施方式
以黄花乌头叶片、根、茎、叶柄、花丝或花瓣等器官为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到黄花乌头外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，又称之为发根(hairy root)；每一个发根即为一个单克隆；经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起黄花乌头发根悬浮培养无性系。
实施例1、黄花乌头发根的培育与鉴定
一、黄花乌头发根的培育
1、材料
盆栽黄花乌头新鲜、健康的叶片，发根农杆菌A4。
2、转化
1)外植体的获得：取盆栽黄花乌头新鲜、健康的叶片，洗净；用0.1％的升汞灭菌10min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，然后吸干表面水分；再于超净台上将叶片切成0.5cm×1.0cm大小，转移到已灭菌的1/2MS固体培养基上(每瓶5片)；于黑暗条件下预培养3天。
2)发根农杆菌的培养：挑取发根农杆菌单菌落，接种于5mL液体YEB内，28℃黑暗条件下振荡培养过夜，于次日接种到50ml液体YEB中继培养4-6h后备用。
3)黄花乌头叶片与发根农杆菌共培养转化：将经过预培养的黄花乌头叶片浸入已培养好的发根农杆菌菌液(≥1×106个/mL)中，感染10min，然后，用无菌滤纸将菌液吸净，再接种于含抗生素的1/2MS固体培养基(所用的抗生素为头孢拉定；浓度为200mg/L)上，约经过30d培养即可生出发根。
3、培养
1)去菌培养：切割下由外植体上长出的发根，置于含抗生素的1/2MS固体培养基(所用的抗生素为头孢氨苄青霉素；浓度为300mg/L)上，进行去菌培养，每3-5d转继代1次，进行34次；
2)扩大培养：将无菌的发根1.0g移入盛有50mL 1/2MS液体培养基的100mL三角瓶内，于黑暗条件、22℃-25℃下，110rpm转速下悬浮培养，每30天传代一次，传代4次得到黄花乌头发根800g。
二、黄花乌头发根的鉴定
1、发根生长形态
所获得的黄花乌头发根照片如图1所示，表明：转化的黄花乌头发根无向地性，随机交叉‘无序’生长，多‘根毛’，多分枝，生长快，具有典型的转化发根特征。
2、黄花乌头发根生长曲线
该黄花乌头发根的生长曲线为一典型的S形曲线，培养30天可增殖20倍。
3、黄花乌头发根的次生代谢物质
经检测，本发明黄花乌头发根中关附甲素含量为0.38％，与从植物上所采集的黄花乌头根中关附甲素含量相当。
4、黄花乌头发根的培养基
可以1/2MS或1/2B5液体培养基作为黄花乌头发根的生长培养基，pH5.0-6.0。
在发根培养中，蔗糖的作用有二：一是作为碳源和能源，二是调节培养液渗透压。在培养基中，蔗糖浓度以1.0-3.0％(重量)为宜，低于1.0％或高于3.0％均对其生长不利。
本黄花乌头发根在无激素培养液内可生长，但在附加NAA等生长素后，生长更为快速，浓度以0.2mg/L为宜。
5、培养条件对黄花乌头发根生长的影响
在室内自然光下，光对黄花乌头发根生长表现较强的抑制作用，其生物量仅为黑暗培养条件下的1/3。
培养温度以在22-25℃为宜。
实施例2、黄花乌头发根的培育
取盆栽黄花乌头新鲜、健康的茎，洗净；用0.1％的升汞灭菌10min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，然后吸干表面水分；再于超净台上将叶片切成0.5cm×1.0cm大小，转移到已灭菌的1/2MS固体培养基上(每瓶5片)；于黑暗条件下预培养6d。
挑取发根农杆菌15834单菌落，接种于5mL液体YEB内，28℃黑暗条件下振荡培养过夜，于次日接种到50ml液体YEB中继培养4-6h后备用。
将经过预培养的黄花乌头茎浸入已培养好的发根农杆菌菌液中，感染20min，然后，用无菌滤纸将菌液吸净，再接种于含抗生素1/2MS固体培养基(所用的抗生素为羧苄青霉素；浓度为500mg/L)上，约经过50d培养生出发根。
切割下由外植体上长出的发根，置于含抗生素的1/2MS固体培养基(所用的抗生素为头孢拉定；浓度为400mg/L)上，进行去菌培养，每4d转继代1次，进行4次；
将无菌的发根1.0g移入盛有50mL 1/2B5液体培养基的100mL三角瓶内，于黑暗条件下，室温22℃-25℃，110rpm转速下悬浮培养，每30天传代一次，传代4次得到黄花乌头发根800g。
黄花乌头的其他器官可以采用与之相同的方法经过转染、培养得到黄花乌头发根。

Claims (10)

1. 一种黄花乌头发根，是以黄花乌头器官为外植体材料，以发根农杆菌进行转染，经发根培养后得到的。
2. 根据权利要求1所述的黄花乌头发根，其特征在于：所述黄花乌头器官为叶片、根、茎、叶柄、花丝或花瓣。
3. 根据权利要求2所述的黄花乌头发根，其特征在于：所述黄花乌头叶片在转染前还在1/2MS固体培养基上于黑暗条件下预培养2-7天。
4. 根据权利要求1或2或3所述的黄花乌头发根，其特征在于：所述发根培养是在含抗生素的1/2MS固体培养基上于22℃-25℃下经过30-50天培养生出发根。
5. 根据权利要求4所述的黄花乌头发根，其特征在于：所述抗生素选自头孢拉定、头孢氨苄青霉素或羧苄青霉素；浓度为200mg/L-500mg/L。
6. 一种获得黄花乌头发根的方法，包括如下步骤：
1)外植体的获得：将黄花乌头器官经消毒后转移到1/2MS固体培养基上，于黑暗条件下预培养2-7天；
2)转化发根：将经过预培养的黄花乌头器官浸入发根农杆菌菌液中感染5-20分钟，吸净菌液后再接种于含抗生素的1/2MS固体培养基上，在22℃-25℃下经过30-50天培养，得到黄花乌头发根。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述黄花乌头发根还经过去菌培养和扩大培养；所述去菌培养是将发根从外植体上切割，在含抗生素的1/2MS固体培养基上进行培养，每3-5天继代1次，进行3-5次；所述扩大培养是将经过去菌培养的发根在1/2MS或1/2B5液体培养基中，于黑暗条件、22℃-25℃下进行培养。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗生素选自头孢拉定、头孢氨苄青霉素或羧苄青霉素；浓度为200mg/L-500mg/L。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述黄花乌头器官为叶片、根、茎、叶柄、花丝或花瓣。
9. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤2)所述发根农杆菌菌液中菌液浓度高于1×106个/mL。
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黄花乌头植株再生系统的研究. 徐秀泉，1-61页，沈阳药科大学. 2003
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