CN102251004B

CN102251004B - 一种蜂王浆多肽的制备方法

Info

Publication number: CN102251004B
Application number: CN 201110187003
Authority: CN
Inventors: 冯成强; 孙平; 颜慧; 李虎臣
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2031-07-05
Also published as: CN102251004A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种蜂王浆多肽的制备方法。本方法通过从蜂王幼虫体内提取肠道酶，模拟蜂王体内酶解环境对蜂王浆进行酶解得到3～5kDa的蜂王浆多肽，制得的蜂王浆多肽能够用于制备Aβ抑制剂。

Description

一种蜂王浆多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种蜂王浆多肽及其用途。

背景技术

近年来，随着人类平均寿命的增加，老年人口的比例不断上升，我国人口老龄化日趋明显，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)作为老年期痴呆最常见的类型，已经引起全社会的广泛关注。阿尔茨海默病是一种以记忆力下降和认知功能障碍为特征的复杂的多因素慢性进行性精神衰退疾病，临床表现为进行性记忆和认知能力减退、语言障碍、精神运动异常等症状。患者早期以近记忆下降为主，疾病后期远记忆也受累及，日常生活受到影响，表现为学习新知识困难，工作主动性下降，承担新任务无法胜任，并随时间推移而加重，伴有语言障碍、计算障碍，视空间障碍，丧失日常技能，失去认知能力等。阿尔茨海默病发病隐匿，进行性加重，会给患者及其家人带来巨大的痛苦，严重阻碍着社会经济的健康稳定发展。如今，阿尔茨海默病已成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四大杀手，国际国内针对阿尔茨海默病的治疗还没有特效药物，且其综合治疗疗程长、显效慢。

国际国内学者对阿尔茨海默病的研究结果表明，阿尔茨海默病发病机制非常复杂，其确切病机目前尚不清楚，同大多数其他长期性疾病一样，阿尔茨海默病是由多因素导致的，由此形成了多种假说。但众多的研究证明，Aβ级联假说是目前阿尔茨海默病发病机理的主流学说，该假说指出Aβ的过度积累是AD发病的基础，而Aβ产生与清除的失衡是导致其过度累积的原因。

蜂王浆(Royal Jelly，RJ)又名蜂皇浆，俗称蜂王乳，是6-18日龄青年工蜂的下咽头腺和上颚腺等腺体所分泌的特殊物质。蜂王浆呈乳白色或淡黄色，半透明，微黏稠，有特殊香味，味酸、涩、辛、微甜，主要为蜂王的终身食物及工蜂幼虫孵化后的前三天食物，具有免疫调节、抗菌、抗炎、抗肿瘤、调节血压、降低血糖和促进细胞生长等功能。

研究发现，蜂王浆对包括阿尔茨海默病在内的神经性疾病有良好的改善作用，蜂王浆中的某些物质具有提高神经系统的传递功能、增强对大脑的营养功能、增加特定神经营养因子的表达量、促进大脑细胞的神经生长、促进大脑中神经干细胞向神经元、星状细胞和胶质细胞的分化，改善小鼠的认知功能障碍，提高大鼠的学习记忆指数等作用。因此，蜂王浆能够成为改善阿尔茨海默病等神经性障碍疾病的发生和发展的潜在药物来源。

我国是世界上最大的蜂王浆生产国，产量占世界的90％以上，但其多以原料性的产品出口，缺乏深加工产品，从而导致产品价格较低，所获利润较少，因此，对蜂王浆进行深加工，可以有效提高我国蜂王浆的品质，增加出口创汇。

新鲜蜂王浆含有多种生物活性物质，但贮存不当极易发生腐烂变质，失去原有的生物活性和营养价值。研究表明，蜂王浆的变质主要是其所含的蛋白质发生变化，从而导致一系列的化学反应促使其变质，因此蜂王浆中的蛋白质对蜂王浆发挥整体功效起着极其关键的作用。蜂王浆中所含的蛋白质对温度十分敏感，在贮存过程中部分蛋白质易发生降解，并且在不同的温度条件下，不同蛋白质的降解速率不一样。贮存温度越高、时间越长，蜂王浆越容易发生美拉德反应(Maillard reaction)，变性速率越快。目前有研究发现，在蜂王浆的保健功效中起着举足轻重作用的水溶性蛋白质，降解产物会发生聚合，从而使水不溶性蛋白增加。研究者发现，通过酶水解得到的蜂王浆多肽不但存储要求降低，而且酶解后的蛋白质具有不易变质，更利于体内的代谢吸收，所含成分具有更理想的药理功能，更有助于阐明蜂王浆的作用机制。但迄今为止，对蜂王浆酶解后多肽的研究较少，且酶解的方法大多数通过胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等外源酶来进行，不适合蜂王浆蛋白的水解，较难筛选得到对人体真正有效的生物活性多肽。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种蜂王浆多肽及其用途。该蜂王浆多肽通过从蜂王幼虫体内提取肠道酶，模拟蜂王体内酶解环境对蜂王浆进行酶解，得到的蜂王浆多肽生物活性更好，能够用于制备Aβ抑制剂。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种蜂王浆多肽的制备方法，包括：

步骤1：将2～3日龄的蜂王幼虫，用0.9％的生理盐水洗涤后，取出所述蜂王幼虫的肠道，加入pH值为7.0～7.2的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液研磨成匀浆，在18000～25000g，4℃条件下离心20～30min，收集第一次离心后的中层液体，然后在18000～25000g，4℃条件下离心20～30min，收集第二次离心后的中层液体，得到肠道酶液；

步骤2：在蜂王浆中，加入pH值为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在18000～25000g，4℃条件下离心20～30min，(除去不溶性成分)收集上清液，经截留分子量为8000～14000的透析袋在pH值为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液中冰浴透析42～72h，(每隔12h更换一次透析液)收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王浆蛋白液；

步骤3：以mg/mL计，将步骤1所得的肠道酶液与步骤2所得的水溶性蜂王浆蛋白液按照蛋白浓度比为30～35∶80～90混合，在pH值为8.3～8.7，温度为34～39℃的条件下酶解22～26h，得到水溶性蜂王浆蛋白酶解液；

步骤4：将步骤3所述的水溶性蜂王浆蛋白酶解液冰浴停止酶解反应后，在8000～15000g，4℃条件下离心10～20min，收集上清液，用10μm微孔滤膜过滤后，收集滤液得到第一滤液，将所述第一滤液经5kDa的超滤膜过滤，收集滤液得到第二滤液，将所述第二滤液经3kDa的超滤膜过滤，收集截留物得到3～5kDa的蜂王浆多肽。

作为优选，步骤1或步骤2中磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L。

作为优选，步骤1中所述蜂王幼虫的肠道与磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液的质量体积比以g/mL计为1∶1～1∶2。

作为优选，步骤1中，匀浆或第一悬浮液的中层液体在20000g的条件下离心。

作为优选，步骤1中，匀浆或第一悬浮液的中层液体离心20min。

作为优选，步骤2中磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液与所述蜂王浆的体积比为2∶1～4∶1。

作为优选，步骤2中，离心力在20000g的条件下离心20min。

作为优选，步骤2中，透析时间为48h。

作为优选，以mg/mL计，步骤3中，所述肠道酶液与所述水溶性蜂王浆蛋白液的蛋白浓度比为32.5∶85。

优选地，步骤3中，所述肠道酶液的蛋白浓度为20～35mg/mL，所述水溶性蜂王浆蛋白液的蛋白浓度为25～45mg/mL，所述肠道酶液和所述水溶性蜂王浆蛋白液的质量比为1∶2.3～3.0。

作为优选，步骤3中酶解温度为37℃。

作为优选，步骤3中酶解pH值为8.5。

作为优选，步骤3中酶解时间为24h。

作为优选，步骤4中，离心条件为在10000g，4℃条件下离心10min。

本发明提供一种蜂王浆多肽的制备方法。该制备方法通过从蜂王幼虫体内提取肠道酶对蜂王浆进行酶解得到，能够模拟蜂王体内酶解环境，得到生物活性更好的蜂王浆多肽，能够用于制备Aβ抑制剂。

试验表明，不同浓度梯度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽处理组与25μMAβ_25-35模型组相比，随着蜂王浆蛋白多肽浓度的逐渐增大，细胞聚集成簇的现象逐渐减弱，生长逐渐均匀分布，胞体逐渐饱满，透光率逐渐增强，突触逐渐变多变长，细胞圆形化现象减弱，细胞培养液浑浊现象也变弱，总体细胞状态有明显改善。

四种浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽与25μMAβ_25-35共同作用24h后，也都能使细胞MTT的代谢率显著提高，与Aβ模型组差异明显(P＜0.05)，132μg/ml的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的保护效果最好。由此说明，随着3-5kDa蜂王浆蛋白多肽的浓度的增加，MTT的代谢率逐渐提高，呈现显著的浓度依赖性关系；3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能有效抑制25μM Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞的毒性作用，对Aβ_25-35导致的SH-SY5Y细胞损伤有明显的保护作用(P＜0.05)。

与Aβ_25-35模型组相比，三个浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽也均能使细胞培养液中的LDH释放量减少。当蜂王浆蛋白多肽浓度≥1/50初始浓度时，差异显著(P＜0.001)，且随着蜂王浆蛋白多肽浓度的增加，也表现出一定的浓度依赖性关系。与Aβ_25-35模型组相比，本组实验中132μg/ml的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能最大程度地抑制LDH的释放，抑制率在32％左右。

25μM的Aβ_25-35与不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同作用24h后，SH-SY5Y细胞的总体凋亡率也有所下降，且随着蜂王浆蛋白多肽浓度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率也逐渐减小，呈一定的浓度依赖性关系。当蜂王浆蛋白多肽浓度为132μg/ml时，早期凋亡率和晚期凋亡率从36.71±1.47％下降到20.54±0.60％(P＜0.001)。由此说明，不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽对Aβ_25-35诱导的细胞凋亡也有一定的抑制作用。

25μM的Aβ_25-35与不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同处理SH-SY5Y细胞24h后，ROS的产生量均有下降，且随着各自浓度的增加，ROS的产生量呈先降低后增加的趋势。对于3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽处理组，66μg/ml的剂量可以使ROS的产生量降到最低，从19.99±0.59降低到7.72±0.36(P＜0.001)，基本恢复到control组内ROS的产生水平。表明3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能够阻止Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞内活性氧自由基(ROS)的产生。剂量浓度在一定范围内时，随着蜂王浆蛋白多肽浓度的增加，ROS生成量呈减小的趋势；当蜂王浆蛋白多肽浓度继续增大时，ROS生成量又逐渐上升。

25μM的Aβ_25-35与不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax的表达量。当剂量浓度为33μg/ml、66μg/ml和132μg/ml时，可使Bax的表达量从control组的1.59±0.16倍分别降低到1.11±0.13倍、0.61±0.04倍和0.45±0.05倍，呈一定的浓度依赖性关系。对于Bcl-2蛋白的表达，25μM的Aβ_25-35处理24h后，表达量升高(P＜0.05)，但升高速率小于Bax；25μM的Aβ_25-35与浓度依次增高的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同作用24后，Bcl-2蛋白的表达量有依次减少的趋势，但蛋白表达量减少的速率同样远小于Bax。表明3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能够阻止Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞内Bax/Bcl-2值的升高，在某一浓度范围内均呈一定的浓度依赖性关系。3-5kDa的RJP的最适浓度为66μg/ml。3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽使Bax/Bcl-2值降低的原因主要为蜂王浆蛋白多肽能显著的抑制Aβ_25-35诱导SH-SY5Y细胞内Bax表达量的升高。

综合上述试验结果，本发明提供的3～5kDa的蜂王浆蛋白多肽对Aβ_25-35诱导SH-SY5Y细胞具有抑制活性，因此可以用于制备Aβ抑制剂，及制备治疗阿尔茨海默病相关药物。

附图说明

图1示本发明制得的肠道酶液和水溶性蜂王浆蛋白液的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1和泳道2为肠道酶液，泳道3和泳道4为水溶性蜂王浆蛋白液，泳道5为marker。

图2示酶解时间对酶解效果的影响，其中，泳道1为水溶性蜂王浆蛋白液，泳道2至9分别为酶解时间2h、4h、6h、8h、10h、15h、20h、25h，泳道10为marker。

图3示图2内泳道1至9各条带峰面积。

图4示酶解pH值对酶解效果的影响，其中，泳道1为水溶性蜂王浆蛋白液，泳道2至7分别为pH值5、6、6.5、7、7.5、8，泳道8为marker。

图5示图4内泳道1至7各条带峰面积。

图6示酶解液中蛋白随pH值变化情况，其中，泳道1为水溶性蜂王浆蛋白液，泳道2为本发明提供的肠道酶液，泳道3至7为由水溶性蜂王浆蛋白液和肠道酶液分别在pH值为8、8.1、8.3、8.5、8.7的条件下酶解后酶解液，泳道8为marker。

图7示图6内泳道1至7各条带峰面积。

图8示本发明提供的肠道酶液与水溶性蜂王浆蛋白液的最佳配比，其中，泳道1、8均为本发明提供的肠道酶液，泳道2、9为水溶性蜂王浆蛋白液，泳道3至6分别为肠道酶液与水溶性蜂王浆蛋白液体积比例是1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，泳道10至13分别为肠道酶液与水溶性蜂王浆蛋白液体积比例是1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，泳道7、14均为marker。

图9示在最佳酶解条件下，酶解反应前后对比图，其中，反应体系总体积为10mL，泳道1至8为反应前图谱，泳道10至17为反应后图谱；泳道1、10分别含0.5mL肠道酶液与0.5mL水溶性蜂王浆蛋白液；泳道2、11分别含0.5mL肠道酶液与1mL水溶性蜂王浆蛋白液；泳道3、12分别含1mL肠道酶液与1mL水溶性蜂王浆蛋白液；泳道4、13分别含1mL肠道酶液与2mL水溶性蜂王浆蛋白液；泳道5、14分别含1.5mL肠道酶液与1.5mL水溶性蜂王浆蛋白液；泳道6、15分别含1.5mL肠道酶液与3mL水溶性蜂王浆蛋白液；泳道7、16分别含2mL肠道酶液与2mL水溶性蜂王浆蛋白液；泳道8、17分别含2mL肠道酶液与4mL水溶性蜂王浆蛋白液泳道9、18均为marker。

图10示3～5kDa的蜂王浆多肽液相分析色谱图，其中，实线为280nm下的色谱图，虚线为214nm下的色谱图。

图11示3～5kDa的蜂王浆多肽对Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，其中，图11(a)为Control组，图11(b)为25μmol/L Aβ_25-35组，图11(c)为25μmol/L Aβ_25-35+13.2μg/mL蜂王浆多肽组，图11(d)为25μmol/LAβ_25-35+33μg/mL蜂王浆多肽组，图11(e)为25μmol/L Aβ_25-35+66μg/mL蜂王浆多肽组，图11(f)为25μmol/LAβ_25-35+132μg/mL蜂王浆多肽组。

图12示3～5kDa的蜂王浆多肽对Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用。

图13示3～5kDa的蜂王浆多肽对Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞LDH释放量的影响。

图14示Annexin V/PI双染法检测3～5kDa的蜂王浆多肽对Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞的影响，其中，图14(a)为control组，图14(b)为Aβ模型组，图14(c)为Aβ+33μg/mL 3～5kDa的蜂王浆多肽，图14(d)为Aβ+66μg/mL 3～5kDa的蜂王浆多肽，图14(e)为Aβ+132μg/mL 3～5kDa的蜂王浆多肽。

图15示Annexin V/PI双染法检测3～5kDa的蜂王浆多肽对Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞的影响结果总结。

图16示3～5kDa的蜂王浆多肽对活性氧自由基的影响。

图17示western blotting检测3～5kDa的蜂王浆多肽对SH-SY5Y细胞内Bax和Bcl-2蛋白表达水平的影响。

图18示3～5kDa的蜂王浆多肽对SH-SY5Y细胞内Bax/Bcl-2比值的影响，其中，斜线柱形代表Bax/Bcl-2的值，白色柱形代表Bax的表达量，黑色柱形代表Bcl-2的表达量。

具体实施方式

本发明公开了一种蜂王浆多肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的蜂王浆多肽中各项试剂均可由市场购得。蜂王浆和蜂王幼虫均购自北京市门头沟区军庄镇孟悟村养蜂专业户，经50次试验表明，蜂王浆中蛋白含量无显著差异，从蜂王幼虫体内提取的肠道酶的蛋白含量也无显著差异。SH-SY5Y细胞(北京师范大学资源学院资源生态与中药资源研究所细胞库)。Prestained Protein Ladder(美国Fermentas)，D-MEM/F12培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)、胰酶(美国R&D)、青霉素/链霉素(美国Gibco公司)，Aβ_25-35(纯度98.4％，杭州中肽生化有限公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，美国Amresco公司)，Cellstar细胞培养板(德国Greiner公司)，乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)，2’，7’-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA，美国Sigma公司)，Polyvinylidene Fluoride Membrane(PVDF膜)(美国Roche)，小鼠抗人Bcl-2多抗体、兔抗人Bax多克隆抗体、小鼠抗人β-actin多克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体、HRP标记小鼠抗兔IgG多克隆抗体、ECL显色试剂(Santa Cruz公司)，其他试剂为国产分析纯。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

取新鲜2～3日龄的蜂王幼虫，用等渗的冰冷的0.9％生理盐水洗涤干净后过滤，逐个解剖并收集虫体的全部肠道。加入与虫体肠道质量体积比(g/mL)为1∶1的pH值为7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释之后，用电动匀浆器在冰浴条件下研磨成匀浆。在20000×g，4℃下离心20min，离心后悬浮液分为三层，即漂浮物上层(脂类成分)、悬浮溶液中层、沉淀下层，回收中层。将中层再次在20000×g，4℃下离心20min，取中层由此得到黄色透明的肠道酶液，保存在-20℃冰箱中。

取部分肠道酶液，用BCA法检测蛋白浓度，得肠道酶液的蛋白浓度为31.9mg/mL。SDS-PAGE电泳检测结果，见图1。

将1倍体积的蜂王浆与2倍体积的pH值为7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液混合，制备蜂王浆稀释溶液。将上述蜂王浆稀释溶液在20000×g，4℃下离心20min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH值为7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中冰浴下透析48h，每隔12h更换一次透析液。取透析袋中液体，即为高纯度的水溶性蜂王浆蛋白，保存在-20℃冰箱中。取部分水溶性蜂王浆蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，得水溶性蜂王浆蛋白的蛋白浓度为42.7mg/mL。SDS-PAGE电泳检测结果，见图1。

肠道酶与蜂王浆酶解条件的确定：对酶解的pH值、酶解时间进行摸索，结果见图2至图9。确定最佳酶解条件为：在pH值为8.3～8.7，温度为34～39℃的条件下酶解22～26h。

按照10mL反应体系中添加4mL蛋白浓度为42.7mg/mL的水溶性蜂王浆蛋白、2mL蛋白浓度为31.9mg/mL的肠道酶液和4mL缓冲液的比例关系，配制2000mL的反应体系。并将体系的pH值调整到8.5，37℃下经行24h的反应。反应24h后，冰浴、停止反应。反应液在10000×g，4℃下离心10min，除去不溶性成分，得到1900mL上清液。用10μm微孔滤膜过滤，收集滤液，再依次用分子量大小为5kDa和3kDa的膜过滤系统过滤，得到200mL 3～5kDa的滤液。将滤液冷冻干燥，再用蒸馏水溶解，0.22μm的薄膜过滤，得到酶解后3～5kDa的蜂王浆多肽。经BCA方法检测后，得到酶解后蜂王浆蛋白多肽的蛋白浓度为3.30mg/mL。

实施例2

取新鲜2～3日龄的蜂王幼虫，用等渗的冰冷的0.9％生理盐水洗涤干净后过滤，逐个解剖并收集虫体的全部肠道。加入与虫体肠道质量体积比(g/mL)为1∶1的pH值为7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释之后，用电动匀浆器在冰浴条件下研磨成匀浆。在18000×g，4℃下离心30min，离心后悬浮液分为三层，即漂浮物上层(脂类成分)、悬浮溶液中层、沉淀下层，回收中层。将中层再次在18000×g，4℃下离心30min，取中层由此得到黄色透明的肠道酶液，保存在-20℃冰箱中。

取部分肠道酶液，用BCA法检测蛋白浓度，得肠道酶液的蛋白浓度为35mg/mL。

将1倍体积的蜂王浆与4倍体积的pH＝7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液混合，制备蜂王浆稀释溶液。将上述蜂王浆稀释溶液在18000×g，4℃下离心30min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH值为7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中冰浴下透析42h，每隔12h更换一次透析液。取透析袋中液体，即为高纯度的水溶性蜂王浆蛋白，保存在-20℃冰箱中。取部分水溶性蜂王浆蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，得水溶性蜂王浆蛋白的蛋白浓度为26.8mg/mL。

按照10mL反应体系中添加6mL蛋白浓度为26.8mg/mL的水溶性蜂王浆蛋白、2mL蛋白浓度为35mg/mL的肠道酶液和2mL缓冲液的比例关系，配制2000mL的反应体系。并将体系的pH值调整到8.3，39℃下经行26h的反应。反应26h后，冰浴、停止反应。反应液在8000×g，4℃下离心20min，除去不溶性成分，得到1860mL上清液。用10μm微孔滤膜过滤，收集滤液，再依次用分子量大小为5kDa和3kDa的膜过滤系统过滤，得到180mL 3～5kDa的滤液。将滤液冷冻干燥，再用蒸馏水溶解，0.22μm的薄膜过滤，得到酶解后3～5kDa的蜂王浆多肽。经BCA方法检测后，得到酶解后蜂王浆蛋白多肽的蛋白浓度为3.17mg/mL。

实施例3

取新鲜2～3日龄的蜂王幼虫，用等渗的冰冷的0.9％生理盐水洗涤干净后过滤，逐个解剖并收集虫体的全部肠道。加入与虫体肠道质量体积比(g/mL)为1∶1.5的pH值为7.2的50mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释之后，用电动匀浆器在冰浴条件下研磨成匀浆。在25000×g，4℃下离心24min，离心后悬浮液分为三层，即漂浮物上层(脂类成分)、悬浮溶液中层、沉淀下层，回收中层。将中层再次在25000×g，4℃下离心24min，取中层由此得到黄色透明的肠道酶液，保存在-20℃冰箱中。

取部分肠道酶液，用BCA法检测蛋白浓度，得肠道酶液的蛋白浓度为25.5mg/mL。

将1倍体积的蜂王浆与3倍体积的pH＝7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液混合，制备蜂王浆稀释溶液。将上述蜂王浆稀释溶液在25000×g，4℃下离心24min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH＝7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中冰浴下透析72h，每隔12h更换一次透析液。取透析袋中液体，即为高纯度的水溶性蜂王浆蛋白，保存在-20℃冰箱中。取部分水溶性蜂王浆蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，得水溶性蜂王浆蛋白的蛋白浓度为32.5mg/mL。

按照10mL反应体系中添加4mL蛋白浓度为32.5mg/mL的水溶性蜂王浆蛋白、1.7mL蛋白浓度为25.5mg/mL的肠道酶液和4.3mL缓冲液的比例关系，配制2000mL的反应体系。并将体系的pH值调整到8.7，34℃下经行22h的反应。反应22h后，冰浴、停止反应。反应液在15000×g，4℃下离心14min，除去不溶性成分，得到1930mL上清液。用10μm微孔滤膜过滤，收集滤液，再依次用分子量大小为5kDa和3kDa的膜过滤系统过滤，得到220mL 3～5kDa的滤液。将滤液冷冻干燥，再用蒸馏水溶解，0.22μm的薄膜过滤，得到酶解后3～5kDa的蜂王浆多肽。经BCA方法检测后，得到酶解后蜂王浆蛋白多肽的蛋白浓度为3.68mg/mL。

实施例4

取新鲜2～3日龄的蜂王幼虫，用等渗的冰冷的0.9％生理盐水洗涤干净后过滤，逐个解剖并收集虫体的全部肠道。加入与虫体肠道质量体积比(g/mL)为1∶2的pH值为7.2的50mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释之后，用电动匀浆器在冰浴条件下研磨成匀浆。在25000×g，4℃下离心24min，离心后悬浮液分为三层，即漂浮物上层(脂类成分)、悬浮溶液中层、沉淀下层，回收中层。将中层再次在25000×g，4℃下离心24min，取中层由此得到黄色透明的肠道酶液，保存在-20℃冰箱中。

取部分肠道酶液，用BCA法检测蛋白浓度，得肠道酶液的蛋白浓度为20.2mg/mL。

将1倍体积的蜂王浆与3倍体积的pH＝7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液混合，制备蜂王浆稀释溶液。将上述蜂王浆稀释溶液在25000×g，4℃下离心24min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH＝7的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中冰浴下透析56h，每隔12h更换一次透析液。取透析袋中液体，即为高纯度的水溶性蜂王浆蛋白，保存在-20℃冰箱中。取部分水溶性蜂王浆蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，得水溶性蜂王浆蛋白的蛋白浓度为32.5mg/mL。

按照10mL反应体系中添加4mL蛋白浓度为32.5mg/mL的水溶性蜂王浆蛋白、2.5mL蛋白浓度为20.2mg/mL的肠道酶液和3.5mL缓冲液的比例关系，配制2000mL的反应体系。并将体系的pH值调整到8.7，34℃下经行22h的反应。反应22h后，冰浴、停止反应。反应液在15000×g，4℃下离心14min，除去不溶性成分，得到1930mL上清液。用10μm微孔滤膜过滤，收集滤液，再依次用分子量大小为5kDa和3kDa的膜过滤系统过滤，得到220mL 3-5kDa的滤液。将滤液冷冻干燥，再用蒸馏水溶解，0.22μm的薄膜过滤，得到酶解后3-5kDa的蜂王浆多肽。经BCA方法检测后，得到酶解后蜂王浆蛋白多肽的蛋白浓度为3.42mg/mL。

实施例5

各取1mL实施例1至4制得的3～5kDa的蜂王浆蛋白多肽旋转挥干，用0.06％TFA的水溶解到1mL，12000rpm离心10min，取上清。梯度洗脱条件如下：平衡缓冲液(A)：0.06％TFA，洗脱缓冲液(B)：0.05％TFA的乙腈；梯度：0～100％B over 6column volumes(CV)；流速：1mL/min；进样体积：500μL；检测波长：280nm/214nm。检测结果如图10所示。

实施例6

D-MEM/F12基本培养基：将D-MEM/F12培养基溶于三蒸水中，混合均匀，用NaHCO₃将培养基的pH值调为7.2，经0.22μM的微孔滤膜过滤，分装后，4℃保存。

D-MEM/F12完全培养基：在D-MEM/F12基本培养基中添加10％的胎牛血清，1％的各10万μ/L的青霉素/链霉素，混合均匀，4℃保存。

在超净台上，将1mg Aβ_25-35完全溶于928μl灭菌三蒸水，配制成1mmol/L的母液，-20℃保存，用前37℃老化72h，分装后-20℃保存待用。

SH-SY5Y细胞用含体积分数为10％的FBS，1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基，于37℃，5％的CO₂培养箱中培养，每2天进行1次传代。取对数生长期细胞经行实验。将细胞分为3组。正常对照组：完全培养基培养24h后换为无血清DMEM/F12培养基；Aβ_25-35模型组：加入25μmol/L的Aβ_25-35；蜂王浆蛋白多肽保护组：实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽(不同浓度)预孵育4h后，加入25μmol/L的Aβ_25-35。

MTT测定细胞存活率：取对数生长期SH-SY5Y细胞，以3×10⁴cells/ml的密度，200μl/well接种到96孔培养板，37℃，5％的CO₂培养箱中培养，24h后吸弃旧培养基，正常对照组和Aβ_25-35模型组分别加入100μl无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组加入100μl含实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽(不同浓度)的无血清DMEM/F12培养基。预孵育4h后，正常对照组换加100μl无血清DMEM/F12培养基，Aβ_25-35模型组换加100μl 25μmol/L的Aβ_25-35的无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组换加100μl同时含25μmol/L Aβ_25-35和不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。分别设置6个复孔。药物作用24h后，每孔加入5mg/ml的MTT(pH＝7.0PBS配制)11μl，4h后，弃培养基，加入DMSO 150μl/well，黑暗下轻轻震荡10min，酶标仪492nm和630nm下读吸光度(OD)值。

细胞存活率(％)＝(实验组OD_492-630-blank组OD_492-630)/(control组OD_492-630-blank组OD_492-630)×100％。倒置显微镜观察结果见图11。MTT比色法结果见图12。

由倒置显微镜的结果显示：control组的SH-SY5Y细胞均匀分布生长，生长良好，胞体丰满，透光率好，突触明显且伸展良好，大部分细胞呈梭形、三角形或多边形，细胞培养液澄清透明。25μM Aβ_25-35处理的24h后，SH-SY5Y细胞分布不均匀，聚集成簇生长，细胞形态不均一，胞体收缩，透光率下降，突触减少或消失，细胞圆形化严重；细胞有悬浮且细胞培养液有浑浊现象。不同浓度梯度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽处理组与25μM Aβ_25-35模型组相比，随着蜂王浆蛋白多肽浓度的逐渐增大，细胞聚集成簇的现象逐渐减弱，生长逐渐均匀分布，胞体逐渐饱满，透光率逐渐增强，突触逐渐变多变长，细胞圆形化现象减弱，细胞培养液浑浊现象也变弱，总体细胞状态有明显改善。

由MTT比色法检测的结果显示：25μM Aβ_25-35处理SH-SY5Y细胞24h后，能导致细胞的MTT代谢率明显下降。说明25μMAβ_25-35能显著地降低细胞线粒体的活力，从而对细胞造成显著地损伤，形成对细胞明显的毒性。四种浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽与25μMAβ_25-35共同作用24h后，也都能使细胞MTT的代谢率显著提高，与Aβ模型组差异明显(P＜0.05)，132μg/ml的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的保护效果最好。由此说明，随着3-5kDa蜂王浆蛋白多肽的浓度的增加，MTT的代谢率逐渐提高，呈现显著的浓度依赖性关系；3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能有效抑制25μM Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞的毒性作用，对Aβ_25-35导致的SH-SY5Y细胞损伤有明显的保护作用(P＜0.05)。

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)释放的检测：取对数生长期的SH-SY5Y细胞，调整细胞密度为3×10⁴cells/ml，200μl/well接种到96孔培养板，37℃，5％的CO₂培养箱中培养，24h后吸弃旧培养基，正常对照组和Aβ_25-35模型组每孔分别加入100μl无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组加入100μl含不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。4h后，正常对照组换加100μl无血清DMEM/F12培养基，Aβ_25-35模型组换加100μl 25μmol/L的Aβ_25-35的无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组换加100μl同时含25μmol/LAβ_25-35和不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。分别设置4个复孔。药物作用24h后吸取上清，每孔取0.02ml立即经行LDH浓度检测。按照LDH试剂盒操作步骤做空白管、标准管、测定管和对照管，并分别添加相应溶液并混匀，室温放置3min，440nm蒸馏水调零，1cm光径测定各管的吸光度。按照如下公式计算培养液中LDH活力：

(2mmol/L)×样品测试前稀释倍数×1000。结果见图13。

由图可知：control组的细胞培养液中释放的LDH量很低，两组实验中LDH活性分别为22.87±3.76U/L和38.17±6.52U/L。25μM Aβ_25-35处理SH-SY5Y细胞24h后，培养液中释放的LDH量显著增加(P＜0.001)，说明25μM Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞的膜结构造成了一定的损伤，使细胞质中的部分LDH透过损伤的细胞膜释放到培养液中。与Aβ_25-35模型组相比，三个浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽也均能使细胞培养液中的LDH释放量减少。当蜂王浆蛋白多肽浓度≥1/50初始浓度时，差异显著(P＜0.001)，且随着蜂王浆蛋白多肽浓度的增加，也表现出一定的浓度依赖性关系。与Aβ_25-35模型组相比，本组实验中132μg/ml的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能最大程度地抑制LDH的释放，抑制率在32％左右。

Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率：取对数生长期的SH-SY5Y细胞，调整细胞密度为8.5×10⁴cells/ml，2ml/well接种到6孔培养板，37℃，5％的CO₂培养箱中培养24h，24h后吸弃旧培养基，正常对照组和Aβ_25-35模型组每孔分别加入2ml无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组加入2ml含不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。4h后，正常对照组换加2ml无血清DMEM/F12培养基，Aβ_25-35模型组换加2ml 25μmol/L的Aβ_25-35的无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组换加2ml同时含25μmol/L Aβ_25-35和不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。药物作用24h后，吸出培养基于EP管中保存，用不含EDTA的胰酶消化30s，后用1ml含2％血清的冷PBS轻轻吹打，然后和上一步吸出的培养基混匀，4℃下1000r/min离心10min，弃上清。加入1ml含2％血清的冷PBS，轻轻震荡使细胞重悬，4℃下1000r/m离心10min，弃上清。重复上一步一次，再将细胞重悬于500μl稀释好的1×binding buffer中，转移到流式上样管，加入25μl Annexin V-FITC(终浓度为0.5μg/ml)。常温避光15min或4℃避光30min，加入5μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI，终浓度0.5-1.0μg/ml)，混匀，用FACS Calibar流式细胞仪(美国Becton Dickinson)，选择激发波长488nm，发射波长530nm检测。采用Cell-Quest数据处理软件，获取10000个细胞分析。结果见图14，结果总结见图15。

由图可知：control组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率较小，只占细胞总数的5.32±0.98％-6.88±0.37％。25μM的Aβ_25-35处理24h后，SH-SY5Y细胞出现明显的凋亡，早期凋亡率和晚期凋亡率占细胞数的26.39±2.24％-36.71±1.47％，表现在流式图上为第四象限和第一象限细胞数明显增多(P＜0.001)。25μM的Aβ_25-35与不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同作用24h后，SH-SY5Y细胞的总体凋亡率也有所下降，且随着蜂王浆蛋白多肽浓度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率也逐渐减小，呈一定的浓度依赖性关系。当蜂王浆蛋白多肽浓度为132μg/ml时，早期凋亡率和晚期凋亡率从36.71±1.47％下降到20.54±0.60％(P＜0.001)。由此说明，不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽对Aβ_25-35诱导的细胞凋亡也有一定的抑制作用。

活性氧自由基(ROS)的产生量用DCFH-DA探针方法测定：取对数生长期的SH-SY5Y细胞，调整细胞密度为8.5×10⁴cells/ml，2ml/well接种到6孔培养板，37℃，5％的CO₂培养箱中培养，24h后吸弃旧培养基，正常对照组和Aβ_25-35模型组每孔分别加入2ml无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组加入2ml含不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。4h后，正常对照组换加2ml无血清DMEM/F12培养基，Aβ_25-35模型组换加2ml 25μmol/L的Aβ_25-35的无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组换加2ml同时含25μmol/L Aβ_25-35和不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。药物处理24h后，吸弃旧培养基，用无血清培养基洗一遍，每孔加2ml 1∶1000配制的含DCFH-DA(终浓度20μmol/L)的无血清培养基，37℃，5％的CO₂培养箱中20min，每隔5min轻轻摇晃一下。无血清培养基洗三遍后，胰酶消化30s，用含2％血清的PBS吹打细胞重悬。使用FACS Vantage SE流式细胞仪(美国Becton Dickinson)，选择激发波长488nm，发射波长525nm检测。结果见图16。

由图可知，25μM的Aβ_25-35处理24h可以使SH-SY5Y细胞中的ROS显著升高(P＜0.001)，荧光强度从6.27±0.60升高到19.99±0.59。25μM的Aβ_25-35与不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同处理SH-SY5Y细胞24h后，ROS的产生量均有下降，且随着各自浓度的增加，ROS的产生量呈先降低后增加的趋势。对于3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽处理组，66μg/ml的剂量可以使ROS的产生量降到最低，从19.99±0.59降低到7.72±0.36(P＜0.001)，基本恢复到control组内ROS的产生水平。表明3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能够阻止Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞内活性氧自由基(ROS)的产生。剂量浓度在一定范围内时，随着蜂王浆蛋白多肽浓度的增加，ROS生成量呈减小的趋势；当蜂王浆蛋白多肽浓度继续增大时，ROS生成量又逐渐上升。

western blotting检测Bcl-2和Bax的表达量：选用一抗为鼠源的Bcl-2和Bax抗体，用western blotting的方法检测SH-SY5Y不同处理组中Bcl-2和Bax的表达量。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，调整细胞密度为8.5×10⁴cells/ml，2ml/well接种到6孔培养板，37℃，5％的CO₂培养箱中培养，24h后吸弃旧培养基，正常对照组和Aβ_25-35模型组每孔分别加入2ml无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组加入2ml含不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。4h后，正常对照组换加2ml无血清DMEM/F12培养基，Aβ_25-35模型组换加2ml25μmol/L的Aβ_25-35的无血清DMEM/F12培养基，蜂王浆蛋白多肽保护组换加2ml同时含25μmol/L Aβ_25-35和不同浓度实施例1至4制得的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽的无血清DMEM/F12培养基。药物处理24h后，冷的PBS洗两遍，收取细胞，并用lysis buffer(10％甘油，50mM pH＝6.8的Tris-HCl，2％β-巯基乙醇，0.02％溴酚蓝，2％或5％的SDS)在100℃下裂解10min，冰浴5min，vortex混匀轻甩后，上样或-80℃冻存备用。

选用15％的SDS-PAGE分离胶，10μl/孔上样，按100V 20min，160V 1.5h的方法电泳分离。0.5％的脱脂奶粉封闭2h，相应浓度的一抗4℃反应过夜，二抗常温下反应1.5h。ECL发过检测系统检测Bcl-2和Bax的表达量，UMAX1120扫描仪扫描，ImageJ软件定量分析。结果见图17、图18。

由图可知，25μM的Aβ_25-35处理24h后，SH-SY5Y细胞中Bax/Bcl-2的值显著增加(P＜0.01)，变为control组的1.34±0.06倍，而25μM的Aβ_25-35与不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax/Bcl-2的值，且剂量浓度在33-132μg/ml之间时，随着浓度的增加有逐渐减小的趋势；浓度为66μg/ml时，减少到最低水平，为control组的0.69±0.03倍(P＜0.001)。当浓度为132μg/ml时，Bax/Bcl-2的值又有轻微增加的趋势。25μM的Aβ_25-35处理24h后，SH-SY5Y细胞中Bax蛋白的表达量显著地增加(P＜0.001)，而25μM的Aβ_25-35与不同浓度的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax的表达量。当剂量浓度为33μg/ml、66μg/ml和132μg/ml时，可使Bax的表达量从control组的1.59±0.16倍分别降低到1.11±0.13倍、0.61±0.04倍和0.45±0.05倍，呈一定的浓度依赖性关系。对于Bcl-2蛋白的表达，25μM的Aβ_25-35处理24h后，表达量升高(P＜0.05)，但升高速率小于Bax；25μM的Aβ_25-35与浓度依次增高的3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽共同作用24后，Bcl-2蛋白的表达量有依次减少的趋势，但蛋白表达量减少的速率同样远小于Bax。表明3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽能够阻止Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞内Bax/Bcl-2值的升高，在某一浓度范围内均呈一定的浓度依赖性关系。3-5kDa的RJP的最适浓度为66μg/ml。3-5kDa的蜂王浆蛋白多肽使Bax/Bcl-2值降低的原因主要为蜂王浆蛋白多肽能显著的抑制Aβ_25-35诱导SH-SY5Y细胞内Bax表达量的升高。

上述全部数据采用SPSS13.0统计软件经行统计分析，数据用

表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验，P＜0.05时认为差异显著。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种蜂王浆多肽的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：将2～3日龄的蜂王幼虫肠道，加入pH值为7.0～7.2的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液研磨成匀浆，在18000～25000g，4℃条件下离心20～30min，收集第一次离心后的中层液体，然后在18000～25000g，4℃条件下离心20～30min，收集第二次离心后的中层液体，得到肠道酶液；

步骤2：在蜂王浆中，加入pH值为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在18000～25000g，4℃条件下离心20～30min，收集上清液，经截留分子量为8000～14000Da的透析袋在pH值为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液中冰浴透析42～72h，收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王浆蛋白液；

步骤3：以mg/mL计，将步骤1所得的肠道酶液与步骤2所得的水溶性蜂王浆蛋白液按照蛋白浓度比为30～35：80～90混合，在pH值为8.3～8.7，温度为34～39℃的条件下酶解22～26h，得到水溶性蜂王浆蛋白酶解液；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1或步骤2中磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述蜂王幼虫的肠道与磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液的质量体积比以g/mL计为1:1～1:2。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液与所述蜂王浆的体积比为2:1～4:1。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以mg/mL计，步骤3中，所述肠道酶液与所述水溶性蜂王浆蛋白液的蛋白浓度比为32.5:85。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中酶解温度为37℃。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中酶解pH值为8.5。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中酶解时间为24h。