CN1690219A - 源自蜂王浆的降压肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白分解物，其具有血管紧张素转化酶抑制作用，通过用胰蛋白酶处理蜂王浆原材料而得到。

Description

源自蜂王浆的降压肽

技术领域

本发明涉及源自蜂王浆的蛋白分解物及其制造方法，以及含有该蛋白分解物的食品、经口摄取用制剂。本发明的蛋白分解物具有血管紧张素转化酶抑制作用、血管舒缓激肽诱发肠管收缩反应增强作用，对高血压的预防或治疗有效。

背景技术

高血压症是一种没有自觉症状，如果置之不理的话则二次引发心脏病、脑血管病等重大疾病的疾病。高血压的治疗和预防是一个重大的课题。已知血管紧张素转化酶(以下称为ACE)与高血压症关系密切，通过抑制ACE可以预防或治疗高血压。

另一方面，高血压的预防或治疗需要长时间摄取，因此，具有极低的副作用也是一个重要的因素，要求开发预防高血压的食品。据说蜂王浆是蜜蜂为了养育女王峰而从头部的下咽头腺和大颚腺分泌出的一种乳白色的胶状(ゼリ一状)物质，作为人的食品摄取的历史很久，具有滋养、强壮、改善体质等各种作用。对该蛋白质的酶分解物进行了研究，也已经知道了具有ACE抑制活性的源自蜂王浆的肽(特许第3068656号；特开2002-145899；特许文献3：特开2002-338594；Journalof Nutritional Biochemistry 13(2002)，80-86页；診断と新薬，第39卷，第2号，2002年，85-90页；日本食品科学工業会誌，第50卷，第10号457-462页(2003)；日本食品科学工業会誌，第50卷，第6号286-288页(2003)；日本食品科学工業会誌，第50卷，第7号310-315页(2003)；日本食品科学工業会誌，第51卷，第1号34-37页(2004))。

但是，从通过蜂王浆原材料的水解得到的量和ACE抑制活性的强度、速效性(即効性)、副作用、作用的持续时间、摄取的形状、保存稳定性的平衡的观点考虑，这些肽在工业化方面还有改善的余地。

发明内容

本发明的目的在于提供没有副作用、具有高血压预防作用的蛋白分解物、其制造方法、含有该蛋白分解物的食品以及经口摄取用制剂。

本发明的另一个目的在于提供一种具有速效性、效果持续性及保存稳定性的ACE抑制物质、含有该抑制物质的高血压预防或治疗剂。

本发明者对上述问题进行了反复地研究，结果发现，将生蜂王浆、干燥蜂王浆进行乙醇沉淀，利用蛋白分解酶、例如胰蛋白酶将得到的变性蛋白质等的蜂王浆材料水解，由此得到可以预防高血压的蛋白分解物。

另外，本发明的蛋白分解物具有强的ACE抑制作用，具有比从ACE抑制作用预测的更强的高血压预防或治疗作用，推测该作用的一部分是基于具有降压作用的血管舒缓激肽的分解抑制作用。

该蛋白分解物过敏症等副作用小，是一种源自蜂王浆的安全食品，对正常高值血压或轻度高血压等的血压高的人，具有特别有用的降压作用或高血压预防作用，特别适合用作特定保健用食品等的食品。

对正常高值高血压和轻度高血压的人给用本发明的蛋白分解物，表明具有显著的血压降低作用，并且摄取结束后，血压缓慢上升，没有超过摄取前值的反弹，脉搏、体重BMI、血液检查、尿检查无异常，没有干咳、皮肤症状、消化器官症状等可能与蜂王浆分解物具有因果关系的副作用，是一种安全性高的食品。

本发明提供以下发明。

1.一种具有血管紧张素转化酶抑制作用的蛋白分解物，利用胰蛋白酶处理蜂王浆材料而得到。

2.如上述1所述的蛋白分解物，其中蜂王浆材料是蜂王浆的醇变性蛋白质。

3.一种蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，其中，用下式

100×(相对于Gly(1摩尔)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相对于Gly(1摩尔)的蜂王浆材料的Lys(mol))

表示的以Gly为基准时Lys的酶分解后的残存率(摩尔比)为蜂王浆材料的70％以下。

4.一种蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，其中，用下式

(相对于Lys(1摩尔)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相对于Lys(1摩尔)的蜂王浆材料的Leu(mol))

表示的以Lys为基准时Leu的含有比例(摩尔比)为蜂王浆材料的1.3倍以上。

5.如上述3或4所述的蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，实质上(実質的に)不含有(1)无机盐类，和(2)酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中选择的至少一种。

6.如上述5所述的蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)游离酸性氨基酸、及游离碱性氨基酸。

7.如上述6所述的蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)酸性游离氨基酸(Asp，Glu)、碱性游离氨基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羟基的游离氨基酸(Thr，Ser)、游离Ala和游离Gly。

8.如上述3～5任何一项中所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量为35重量％以下，在40℃、2个月的加速试验条件下其实质上(実質的に)不变色。

9.如上述3～6任何一项中所述的蛋白分解物，其中，利用凝胶透过柱分析实质上(実質的に)未发现分子量10000以上的成分，分子量为约200～约1500的范围内具有最大的峰，具有分子量为约200～约300的尖峰。

10.如上述3～6任何一项中所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在约700～约6000的范围内。

11.如上述1～10任何一项中所述的蛋白分解物，其中，使前述蛋白分解物通过具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)时，由下式表示的相关成分(関与成分)含量(％)为35％以上，优选40％以上。

·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性

粒度分布；30μm

细孔径；250

官能团；没有

适用pH范围：全区域。

·相关成分含量(％)＝A₁/A_T×100

T₁：色氨酸的保留时间

T₂：10-羟基-δ-2-癸烯酸(デセン酸)的保留时间

A₁：从在T₁的洗脱位置(溶出位置)检测的峰之后到在T₂的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和

A_T：所有的峰面积的总和。

12.如上述11所述的蛋白分解物，其中，前述相关成分含量为58±5％。

13.如上述1～12任何一项所述的蛋白分解物，其中，含有以下9种肽中的至少一种：

Glu-Trp-Lys；

His-Pro-Ala-Leu；

Thr-Phe；

Ser-Pro-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Thr-Pro-Phe；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu；

14.如上述1～11任何一项所述的蛋白分解物，其中，在使前述蛋白分解物通过具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，用水(级分1，2)、20％甲醇(级分3)、40％甲醇(级分4)、60％甲醇(级分5)、80％乙醇(级分6)、100％乙醇(级分7)洗脱时的级分中，含有级分3～6。

15.如上述14所述的蛋白分解物，其中，在级分3中含有

Glu-Trp-Lys；

His-Pro-Ala-Leu和

Thr-Phe

组成的组中的至少一种肽，在级分4中含有

Thr-Phe；

Ser-Pro-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Thr-Pro-Phe；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu

组成的组中的至少一种肽。

16.一种高血压的预防或治疗剂，其以上述1～15任何一项中所述的蛋白分解物为有效成分。

17.一种食品，其含有上述1～15任何一项中所述的蛋白分解物。

18.如上述17所述的食品，其为高血压预防用食品。

19.一种经口摄取用制剂，其含有上述1～15任何一项中所述的蛋白分解物。

20.一种高血压的预防或治疗剂，其中，含有从下述7种肽中选择的至少一种肽作为有效成分：

Glu-Trp-Lys；

His-Pro-Ala-Leu；

Thr-Phe；

Ser-Pro-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Thr-Pro-Phe；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu。

21.一种食品，其含有上述20所述的蛋白分解物。

22.如上述21所述的食品，其为高血压预防用食品。

23.一种经口摄取用制剂，其含有上述20中所述的至少一种肽。

24.如上述19所述的制剂，其为明确的食品和/或含有辅助物(サプリメント)的食品形态。

25.一种血管紧张素转化酶抑制剂，其以上述1～15中的任何一项所述的蛋白分解物为有效成分。

26.如上述1～15中任何一项中所述的蛋白分解物的制造方法，其特征在于，用胰蛋白酶处理蜂王浆材料。

27.如上述26所述的方法，其特征在于，用合成吸附剂处理用胰蛋白酶处理得到的蛋白分解物，除去(1)无机盐类、和(2)酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中选择的至少一种。

28.如上述26所述的方法，其特征在于，将用胰蛋白酶处理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去无机盐和水溶性氨基酸，然后用含水醇洗脱。

29.如上述28所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性：

粒度分布：＞250μm(含有90％以上的粒径大于250μm的粒子)

细孔径；400

官能团；没有

适用pH范围：全区域。

30.一种新型肽，含有以下5种肽中的任何一种：

His-Pro-Ala-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr。

本发明的源自蜂王浆材料的蛋白分解物通过经口摄取显示强的ACE抑制作用，对高血压的预防或治疗有效。另外，使用胰蛋白酶作为酶，与使用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶时相比可以提高每单位重量的ACE抑制活性及蛋白分解物的收率，可以有效地利用蜂王浆材料。

本发明的蛋白分解物，其中可以作为抗原的分子量2万以上的蛋白质含量降低，优选的蛋白分解物中几乎不含有或者完全不含有可以作为抗原的分子量1万以上的蛋白质。因此，本发明的蛋白分解物可以强力地抑制过敏反应，几乎没有发现过敏反应。

而且，本发明和蛋白分解物是一种安全的物质，服用后在进行脉搏、体重、BMI、血液检查、尿检查时没有异常，没有干咳、皮肤症状、消化器官症状等副作用。

进行了脱盐操作的本发明的蛋白分解物中，可以作为升压物质的盐类，特别是氯化钠的含量非常低。另外通过脱盐操作，使游离氨基酸呀糖分等其它的成分的含量降低，使吸湿性或美拉德反应(メイラ一ド反応)等的化学反应得到抑制，可以得到稳定性更高的蛋白分解物。

通过长期摄取本发明的蛋白分解物，可以使血压缓慢而且持续地降低，对于正常血压的试验者可以预防高血压、及高血压引起的各种疾病。

本发明的蛋白分解物因为作用持续时间长(8～12小时)，血压缓慢地降低，因此在服用了该蛋白分解物时，一天的血压变动小，容易控制血压。例如如果早晨服用，在活动时间中使血压降低，睡觉时不使血压降低，因此，具有血压高的人服用时的理想的作用方式。另外，服用中止后血压缓慢地上升，没有观察到超过服用前的血压的反弹。

本发明的蛋白分解物对诱变性(変異原性)试验及抗原性试验得到阴性的结果，血压变动少，或者几乎不影响脉搏数、体重，是一种安全性好的材料。

本发明的蛋白分解物适合具有高血压症的危险因子(遗传性、环境因素等)的正常高值血压或轻度高血压的人或高血压患者摄取。

附图说明

图1显示实施例1的ACE抑制活性的测定结果。

图2显示将Gly设为1摩尔时的相对氨基酸组成。

图3显示将Lys设为1摩尔时的相对氨基酸组成。

图4显示GFC分析结果。

图5显示被试验物质的一次投喂时的收缩压的变化。

图6显示被试验物质投喂8周时、停药2周药时的收缩压的变化。

图7显示按照路线1进行分级的级分号1～7的图。

图8显示与相关成分含量相关的色谱图的实例。图8中“比较液”含有色氨酸、甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸及10羟基-δ-2-癸烯酸标准品。另外，检液是含有级分1～7的本发明的蛋白分解物。

图9显示实施例5的收缩压(全部被测者)的结果。

图10为显示分离和制备试样的流程图。

具体实施方式

本发明中，蜂王浆材料是指含有蜂王浆的蛋白质的材料，只要满足上述条件就可以，没有限制，例如有生蜂王浆、干燥蜂王浆、对蜂王浆进行乙醇沉淀、硫酸铵处理、加热处理等的蛋白改性处理得到的蛋白沉淀物(包括乙醇沉淀物)、或者含有通过提取、过滤、离心分离、色谱等各种方法对蜂王浆进行分级后的蛋白质的材料。

蜂王浆可以是任何一种，可以广泛使用用于养育女王蜂的蜜蜂分泌的那些蜂王浆。具体地说，蜂王浆是将蜜蜂中的工蜂从下咽头腺及大颚腺分泌的分泌物混合而成的乳白色的胶状物质。

源自蜂王浆的蛋白质级分(分画)可以适合使用将蜂王浆进行醇沉淀而得到的蛋白级分。特别优选使用在制造蜂王浆饮料时作为水不溶性蛋白质副产物而产生的蜂王浆的乙醇变性蛋白质。乙醇变性蛋白质可以是使用约50～约100体积％的乙醇，从蜂王浆中提取癸烯酸等的饮料用生理活性物质后的残渣的水溶解度小的蛋白质。

本发明的蜂王浆材料的酶分解物可以利用胰蛋白酶进行水解得到。胰蛋白酶有通过胰蛋白酶原的限定水解生成的活性α-胰蛋白酶和β胰蛋白酶，可以使用其中的任何一种。另外，也可以将凝血酶、血纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、尿激酶等基质特异性和催化剂结构相似的胰蛋白酶亲缘酶(類縁酵素)作为胰蛋白酶使用。而且，可以使用通过将胰蛋白酶(包含胰蛋白酶亲缘酶)的一种以上的氨基酸进行取代、附加、缺失、插入等改性的变异型酶。该变异型胰蛋白酶和胰蛋白酶亲缘酶也包含在本发明的蜂王浆材料的酶分解中使用的胰蛋白酶中。胰蛋白酶的来源例如有牛、猪、羊、人等哺乳动物。蜂王浆材料的水解中也可以使用从牛、猪等哺乳动物的胰脏提取的胰蛋白酶，也可以使用通过基因重组而得到胰蛋白酶。

用胰蛋白酶处理蜂王浆材料的条件例如优选可以通过在水性溶剂中在约15℃到约60℃，优选约20℃到约50℃，特别是37℃左右的温度下进行约1～约72小时，优选约3～约48小时来实施。胰蛋白酶的使用量例如相对于每100g蛋白质为约0.01～约3g，优选约0.05～约1g。胰蛋白酶可以使用游离的酶，也可以使用固定在载体上的酶。胰蛋白酶具体优选可以使用Roche Diagnotics制的来自牛的胰蛋白酶、Novozyme制的来自猪的胰蛋白酶。

酶反应液的pH为约6～约10，优选约7～约9。用胰蛋白酶水解蜂王浆材料时，因为pH慢慢地降低，因此优选使用碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾)、碱金属碳酸盐(例如碳酸钠、碳酸钾)、碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠、碳酸氢钾)等的碱，将pH保持在一定的范围。

反应液适合使用水，也可以在含有少量的乙醇等水混溶性有机溶剂的含水醇等水性溶剂中进行。

通过对酶分解物的反应液进行加热处理、以及根据需要进一步进行离心分离、过滤、提取、脱盐、冻干或喷雾干燥等后处理，可以得到本发明的蛋白分解物。例如，使用生蜂王浆或干燥蜂王浆作为蜂王浆材料的情况下，也可以除去源自蜂王浆的糖分(糖質)等成分。本发明的优选实施方式之一中，本发明的蜂王浆材料的蛋白分解物利用凝胶透过柱测定的分子量为约200～约7000，特别是约250～约6000，具有分子量约200～约300的尖峰，和在分子量约200～1500约范围内具有最大峰。从凝胶透过柱的测定结果推定的蛋白分解物的推定分子量为约700～约6000，优选约800～约5000。

本发明的另外优选的实施方式之一中，本发明的蜂王浆材料的蛋白分解物实质上(実質的に)不含有糖类、盐类、和酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中选择的至少一种。如前所述，胰蛋白酶处理蜂王浆材料时，随着蛋白水解的进行，反应液的pH降低，因此优选添加氢氧化钠等的碱，使反应液的pH维持在适合胰蛋白酶的pH为约6～约10，特别是约7～约9。这样添加的碱(例如氢氧化钠)，在酶反应后向反应液中添加酸(例如盐酸)，将pH调整为约3.5～约7，优选约4～约5.5时，将碱(例如氢氧化钠)变成对应的盐(例如氯化钠)。这时生成的大量的盐特别是氯化钠等的含有钠的盐时，钠是升压物质，因而优选除去。该脱盐可以通过例如使用脱盐柱进行，具体地，使用含有苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的疏水性的合成吸附剂(例如ダイヤイオンHP-20(三菱化学制)、セパビ一ズSP-70(三菱化学制)吸附蛋白分解物，用水清洗除去氯化钠等的盐，然后使用甲醇、乙醇、乙腈等适当的有机溶剂进行洗脱，由此可以得到脱盐的、实质上不含有无机盐类的蛋白分解物。当在脱盐中使用合成吸附剂时，例如难以吸附在疏水性的合成吸附剂上的Asp、Glu、Lys、Arg等的酸性或碱性游离氨基酸等和无机盐类一起除去，另一方面，Phe、Leu、Ile、Trp、Val等的容易吸附在疏水性的合成吸附剂上的游离氨基酸即使通过脱盐操作也难以除去。另外，Ser、Thr等的具有醇羟基的游离氨基酸、以及游离Ala，游离Gly等也难以吸附在疏水性的合成吸附剂上，因而和酸性或碱性的游离氨基酸同样地容易与无机盐类一起被除去。

本发明的第一实施方式中，在蜂王浆的蛋白分解物中产生比较多的游离Lys，但通过使用合成吸附剂柱进行脱盐处理其大部分被水洗除去，因而在用乙醇等洗脱而回收的分级的蛋白分解物中实质上不含有游离Lys。

本发明的另一实施方式中，在蜂王浆的蛋白分解物中也存在大量游离Ala，对于游离Ala，通过使用合成吸附剂柱进行脱盐处理将其大部分水洗除去，因而在用乙醇等洗脱回收的分级的蛋白分解物中实质上不含有游离Ala。

这里，所述的“实质上不含有游离氨基酸”是指该游离氨基酸的含量为约0.01μmol/10mg以下，优选为约0.001μmol/10mg以下，更优选为0.0001μmol/10mg以下。

在本说明书中，“酸性氨基酸”是指Glu和Asp，碱性氨基酸是指Lys、His、Arg，具有醇羟基的氨基酸是指Thr、Ser。

优选的实施方式之一中，本发明的蛋白分解物中的盐类(特别是氯化钠)的含量为1重量％以下，更优选0.2重量％以下，进一步优选0.1重量％以下，特别是检测限以下。

如上所述，通过脱盐处理使碱性游离氨基酸、酸性游离氨基酸、醇性游离氨基酸、游离Ala和游离Gly等的浓度降低，但是ACE抑制活性几乎或完全没有降低。一般认为这是因为碱性游离氨基酸、酸性游离氨基酸、醇性游离氨基酸、游离Ala和游离Gly等对ACE抑制活性的贡献率低。

本发明的优选的另外的一个实施方式中，本发明的蛋白分解物其中在以Gly为基准时Lys的残存率(以摩尔数比较)为蜂王浆材料的25～70％，30～60％，35～55％，40～50％以下，42～48％，或者44～46％。例如对于本发明的实施例得到的蛋白分解物，

酶分解前的蜂王浆材料(乙醇沉淀物)

相对于Gly(1摩尔)，Lys为(1.09摩尔)

酶分解物(用填充有合成吸附剂的柱脱盐后，回收的样品)

相对于Gly(1摩尔)，Lys为(0.49摩尔)

浓度降低，根据数学式1计算Lys的残存率，结果为：

100×(0.49/1.09)＝44.95％。

尽管根据蜂王浆材料、分解条件的不同多少有变动，但是在通过利用合成吸附剂吸附蛋白分解物进行脱盐时，很明显游离Lys的含有浓度和原来的(相もと )分解物相比降低了。

本发明的优选的其它的一个实施方式中，本发明的蛋白分解物其中在以Lys为基准时Leu的含有比例(摩尔比)为蜂王浆材料的约1.3～约3.5倍，例如为约1.5～约3倍，约1.7～约2.7倍或约2～约2.5倍。例如对于本发明的实施例得到的蛋白分解物，酶分解前的蜂王浆材料(乙醇沉淀物)

相对于Lys(1摩尔)，Leu为(1.08摩尔)

酶分解物(用填充有合成吸附剂的柱脱盐后，回收的样品)

相对于Lys(1摩尔)，Leu为(2.49摩尔)

因此，当根据数学式1计算Lys的残存率(摩尔基准)时，结果为：

2.49/1.08＝约2.3倍

在本发明的蛋白分解物中，比未分解的分子量高的蛋白质、胰蛋白酶等残留时，根据需要可以利用超滤等除去。

本发明的优选的其它的一个实施方式中，优选本发明的蛋白分解物中源自蜂王浆的糖分含量低。糖分含量只要不影响蛋白分解物的品质就可以，没有特别限定。通常为35重量％以下，优选30重量％以下，更优选25重量％以下。糖分例如有：葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖等单糖或二糖。这些糖分在保存时和蛋白分解物缓慢反应(例如メイラ一ド反応

)，从而使蛋白分解物变成褐色，或导致吸湿性升高，因此希望尽可能地除去。

本发明的蛋白分解物可以通过在酶处理后优选进行脱盐处理来制造，进一步通过柱等处理收集ACE抑制活性更强的级分也可以。并且，根据需要通过反复进行同样的提纯，可以分离具有ACE抑制作用的肽，分离或浓缩该生理活性肽，用作具有ACE抑制作用的蛋白分解物。

对于ACE抑制肽而言，例如，将本发明的蛋白分解物施加至合成吸附剂或凝胶过滤剂、分子筛、反相色谱等中，利用水、甲醇、乙醇、或其混合液这样的适当洗脱液进行洗脱，分离成各种级分，对ACE抑制活性强的级分利用通常的制备型HPLC等方法分离肽，通过结构鉴定，由此可以分离ACE抑制活性强的肽。

本发明的优选的一个实施方式中，将蜂王浆材料进行胰蛋白酶处理，使处理后的蛋白分解物吸附在作为合成吸附剂之一的HP-20柱上，根据下述路线1，可以分级成7个级分。

另外，本说明书中，有时将级分简写为Fr或P。例如级分4可以写作Fr4或P4。

路线1

蜂王浆蛋白水解液855ml(相当于冻干物50g)

↓

加载到ダイヤイオンHP20(柱尺寸：φ11cm×20cm、容量：约1.9L)上

↓洗涤液：使用水3260mL

↓洗脱液：20％、40％、60％、80％、100％MeOH

↓·20％甲醇使用2460mL

↓·40％甲醇使用2340mL

↓·60％甲醇使用2720mL

↓·80％甲醇使用2300mL

↓·100％甲醇使用3200mL

洗涤液及各洗脱液

↓使用蒸发器(40℃)浓缩

各浓缩液

↓

冻干

水洗涤级分：级分1和2

20％甲醇洗脱级分：级分3

40％甲醇洗脱级分：级分4

60％甲醇洗脱级分：级分5

80％甲醇洗脱级分：级分6

100％甲醇洗脱级分：级分7

将根据上述路线1分级的级分No.1～7的收率和ACE抑制率表示在以下表1中，将级分1～7的图示于图7。

表1

级分No.	产量(g)**	收率(％)	ACE抑制率(％)
				1(水洗脱级分)	16.70	33.4	10.9
2(水洗脱级分)	3.64	7.3	64.5
				3(20％甲醇洗脱级分)	5.38	10.8	51.0
4(40％甲醇洗脱级分)	8.34	16.7	57.6
				5(60％甲醇洗脱级分)	11.58	23.2	55.9
6(80％甲醇洗脱级分)	4.84	9.7	45.6
				8(100％甲醇洗脱级分)	0.19	0.4	66.1

^*：各级分的试样溶液的反应液浓度为0.5mg/mL。抑制率的测定根据后述的实施例1所述的方法进行。

优选含有上述的级分中的级分3～6的制品。也可以含有级分7，但因为级分7的收率少，所以含有级分3～6的蛋白分解物具有充分的降压作用。另外，级分1，2尽管可以显示ACE抑制作用，但是因为含有氨基酸和无机盐类(例如NaCl)，所以不需要包含在本发明的蛋白分解物中。

本发明的蛋白分解物，当通过具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(商品名：三菱化学公司制MCI-GEL，CHP55Y)的柱(4.6mmφ×150mm)时，由下述式表示的相关成分含量(％)为35％以上，优选40％以上，更优选50％以上，进一步优选50～70％，特别优选58±5％、最优选58±3％。

·相关成分含量(％)＝A₁/A_T×100

T₁：色氨酸的保留时间

T₂：10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间

A₁：从在T₁的洗脱位置检测的峰之后到在T₂的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和

A_T所有的峰面积的总和。

·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性

粒度分布；30μm

细孔径；250

官能团；没有

适用pH范围：全区域

柱(4.6mmφ×150mm)

在上述A1中，主要含有级分4和级分5。

蜂王浆蛋白水解物(检测样)的相关成分含量的测定例如可以在以下的条件(试验方法)下进行。

试验方法

称量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)溶解，做成50mL。用薄膜过滤器(0.45μL)过滤该溶液，将滤液作为检液(検液)。

或者，称量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)10ml及磷酸缓冲液(pH8.0)¹⁾10mL进行溶解，再添加水15ml和稀醋酸²⁾5mL充分地振荡，添加水做成50mL。用薄膜过滤器(0.45μL)过滤该溶液，将滤液作为检液。

另外，称量1mg色氨酸³⁾及甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸⁴⁾5mg，添加醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0)⁵⁾5mL进行溶解，再添加水，做成10mL，作为A液。

称量10-羟基-δ-癸烯酸标准品⁶⁾5mg，添加水/甲醇混合液(1∶1)0.5ml进行溶解。在该溶液中添加A液0.5ml，充分混合，作为比较液。

对于试液和比较液分别取50μL，在下述操作条件下进行液相色谱测定。将比较液的色氨酸及10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间设为T₁及T₂，测定从在试液的T₁的洗脱位置检测的峰之后到在T₂的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和A1及全部的峰面积的总和A_T，利用下式求得相关成分含量。

相关成分含量(％)＝A₁/A_T×100

操作条件

检测器：紫外吸光光度计(测定波长：275nm)

柱：内径4.6mm，长度150mm的不锈钢管中填充了30μm的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物⁷⁾。

柱温：50℃附近的恒定温度

流动相A：水/甲醇混合液(199∶1)

B：甲醇/水混合液(19∶1)

流速^*：1ml/min

梯度条件

0分    →    10分    B.CONC 8％         保持

10分   →    12分    B.CONC 8％→50％   直线

12分   →    22分    B.CONC 50％        保持

22分   →    30分    B.CONC 50％→90％  直线

30分   →    45分    B.CONC 90％        保持

45.01分→    55分    B.CONC 8％         保持

面积测定范围：10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间的约1.5倍的范围

^*对于流速和梯度条件，进行适当地调整，以满足下述系统适合性。

系统适合性

系统的性能：对于比较液50μL，在上述的操作条件下进行液相色谱测定，按照色氨酸、甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸、10-羟基-δ-2-癸烯酸的顺序洗脱，色氨酸和甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸的分离度为3以上，甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸和10-羟基-δ-2-癸烯酸的分离度为5以上。

注：

1)磷酸缓冲液(pH8.0)：按照日本食品添加物标准(食品添加物公定書)进行配制。

2)稀醋酸：按照日本食品添加物标准进行配制。

3)L-色氨酸：使用C₁₁H₁₂N₂O₂，和光纯药工业株式会社公司制的试剂特级或同等品质的产品。

4)甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸：使用C₁₇H₂₅N₃O₅，フルカ(リ一デル？デ？ハ一ン)公司制的含量98％以上或同等品质的产品。

5)醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0)：将醋酸钠三水合物5.44g溶解在水900ml中，滴加醋酸(100)，将pH调整为4.0之后，添加水稀释到1000ml。

6)10-羟基-δ-2-癸烯酸标准品：使用(E)-10-羟基-δ-2-癸烯酸标准品(C₁₀H₁₈O₃)，和光纯药工业株式会社公司制的或同等品质的产品。

(7)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物：使用三菱化学公司制的MCI-GEL CHP55Y或同等品质的产品。

与相关成分含量有关的色谱图如图8所示。

下面，对级分3～6的相关成分(肽)的分离和其鉴定按如下进行。

(a)大口径柱进行的分级

HPLC条件

柱：TSK-gel ODS 120T 55mmφ×300mm东ソ一

柱：TSK-gel ODS 120T 45mmφ×300mm东ソ一

流动相：水/乙腈混合液/0.05％TFA

流量：42mL/min

柱温：室温

检测波长：220nm

^*：乙腈浓度7～25％、50％(洗出)

(b)中口径柱进行的分级

HLPC条件

柱：COSMOSIL-5C18-AR II 20mmφ×250mmナカライテスク

和/或COSMOSIL-5C18-AR II 10mmφ×250mmナカライテスク

流动相：水/甲醇混合液/0.05％TFA

流量：8mL/min或2mL/min

柱温：40℃

检测波长：220nm

^*：甲醇浓度

等度(イソクラテイツク)方式2～35％、50％(洗出)

梯度方式                  A液0％(0.05％TFA)、B液50％

(c)各制备液(分取液)的纯度的确认

<HLPC条件>

检测器：紫外分光光度计(测定波长：220nm)

柱：COSMOSIL-5C18-AR II 4.6mmφ×250mmナカライテスク

流动相：水/甲醇混合液/0.05％TFA

流量：0.4mL/min

柱温：40℃

^*：甲醇浓度2～40％

(d)分离制备的试样(级分数)

参见图10。

(e)ACE抑制率的测定

对于纯度85％以上的级分的295个检测样测定ACE抑制率。

另外，纯度为85％以下的样品也测定一部分。

ACE抑制率的测定方法

试料溶液(反应液中浓度：0.1mg/mL)  25μL

↓ACE溶液(来自兔肺的血管紧张素I转化酶：25mU/mL)50μL预温育(プレインキユベ一ト)37℃-5min

↓底物溶液(马尿酰-L-组氨酰-L-亮氨酸：12.5mM)50μL温育(インキユベ一ト)37℃-60min

↓盐酸(9→200)125μL

↓内标液(m-马尿酸：0.625mM)100μL

↓乙酸乙酯750μL

↓涡流混合机10秒×2

离心分离(2000rpm，5min)

↓

有机层500μL

↓在60℃、氮气气流下干燥

↓流动相500μL

↓用涡流混合机溶解

将20μL注入HPLC

<HLPC条件>

检测器：紫外分光光度计(测定波长：228nm)

柱：L-column ODS 4.6mmφ×150m，化学物质评价研究机构

流动相：0.01M磷酸缓冲液(pH3.0)/乙腈混合液(17∶3)

流量：1.0mL/min

柱温：40℃

注射量：20μL

(f)构成氨基酸的测定

对于分离量为2mg以上或ACE抑制率为20％以上的级分166检测样，在酸水解之后测定氨基酸浓度，求得构成氨基酸。

构成氨基酸的测定方法

<酸水解法-1：不含色氨酸的分离肽>

试料溶液(1mg/ml 50％甲醇溶液)50μL

↓使用Pico-Tag(Waters)在减压条件下干燥(室温)

残留物

↓+6mol/L盐酸溶液(含有1％苯酚)0.2mL(放入小反应瓶中)

↓使用Pico-Tag法水解(110℃、22小时)

↓冷却后

↓使用Pico-Tag(Waters)在减压条件下干燥(室温)

残留物

↓+0.02mol/L盐酸试液0.25mL(稀释5倍)

20μL/氨基酸分析

<酸水解法-2：不含色氨酸的分离肽>

试料溶液(1mg/ml 50％甲醇溶液)50μL

↓使用Pico-Tag(Waters)在减压条件下干燥固化(室温)

残留物

↓+4mol/L甲磺酸溶液(含有0.2％的色胺)20μL

↓+水0.2mol/L(放入小反应瓶中)

↓利用Pico-Tag法水解(110℃、22小时)

↓冷却后

↓+4mol/L氢氧化钾溶液22μL

↓使用Pico-Tag在减压条件下干燥固化(室温)

残留物

↓+0.05mol/L盐酸试液0.25mL(稀释5倍)

20μL/氨基酸分析

<氨基酸分析条件>

(利用茚三酮反应的合成后标记(ポストラベル)法)

装置：L-8500形日立高速氨基酸分析计

柱：4.6mmID×80mm日立カスタムイオン交换树脂(#2622SC，Lot No.K99272)(Na型、高分离分析、梯度法)

缓冲液：日立高速氨基酸分析计用缓冲液L-8500PH-KIT(三菱化学或和光纯药公司制)

V1：PH-1(PH-1500mL中添加乙醇(99.5)65mL和水，做成1000mL)

V2：PH-2

V3：PH-3(未使用)

V4：PH-4

V5：PH-RG

反应液：茚三酮试液-L8500组(セツト)(光纯药公司制)

流量：缓冲液0.26mL/min

反应液0.30mL/min

注射量：20μL

测定波长：570nm(Pro：440nm)

(g)氨基酸序列的测定

基于ACE抑制率和构成氨基酸的测定结果，对ACE抑制率比较高、氨基酸的构成比较明确、构成氨基酸数为2～6个的分离物18个检测样利用LC-MS/MS法进行氨基酸序列的解析。

利用LC-MS/MS法进行构造解析的操作条件

试料溶液的配制法

分别在超纯乙腈(1∶1)400μL中溶解，用0.01％甲酸溶液/乙腈(1∶1)稀释至约100μg/mL及约25μg/mL的浓度。

HPLC条件

使用仪器：1100Series(Agilent Technologies)

柱：Cadenza CD-C18，3μm，2mmφ×50mm

流动相：A液0.01％甲酸溶液

：B液0.01％甲酸溶液/乙腈(10∶90)

0.01M磷酸缓冲液(pH3.0)/乙腈混合液(17∶3)

洗脱条件：0～8min    B液8％

8～12min  B液90％

12～13min B液8％

流量：0.1mL/min

柱温：40℃

注射量：5μL

MS和MS/MS的操作条件

使用仪器：API4000(Applied Biosystems/MDS Sciex)

柱：Turbo ion spray(正，positive)

喷雾器气体：18psi

气帘气体(カ一テンガス)：10psi

离子喷雾电压：5500V

喷嘴电压：适当设定

测定质量范围：适当测定

碰撞气体：Level 4(氮气)

碰撞气体能量：适当设定

产品离子测定范围：适当设定

测定结果

在上述(d)显示的1548个检测样中，以简易测定的HPLC纯度为基准，对295个检测样测定ACE抑制活性，以该结果为基准，对166个检测样进行氨基酸分析，测定其组成。另外，对于氨基酸序列而言，测定18个检测样，可以鉴定RJ蛋白水解物中含有的9种肽的结构。

表2

HP-20粗级分No.	分离成分数	ACE抑制率	构成氨基酸	氨基酸序列	氨基酸序列鉴定数
						Fr.3	404	83	68	4	3
Fr.4	818	172	72	14	6
						Fr.5	270	34	22	0	0
Fr.6	56	6	4	0	0
						合计	1548	295	166	18	9

具体地，对ACE抑制活性率比较高、氨基酸构成比较明确、构成氨基酸数为2～6的18个检测样，利用LC/MS/MS进行氨基酸序列的解析。

结果，可以鉴定结构的是9个检测样(I～IX)，从HP-20的粗级分的Fr3部分可以鉴定3种肽，从Fr4部分可以鉴定6种肽。

将它们的结构式及从ACE抑制率的测定结果求得的ACE抑制活性IC50值示于下述的表3中。

表3

氨基酸序列	ACE抑制活性IC50值
			mg/mL	μM
	Glu-Trp-Lys	0.10			220
His-Pro-Ala-Leu			0.09	200
	Thr-Phe	0.08			290
Ser-Pro-Leu			0.19	590
	Asn-Leu-Tyr	0.60			1460
Leu-Ser-Tyr			0.39	1030
	Thr-Pro-Phe	0.44			1210
Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr			0.11	170
	Tyr-Ser-Pro-Leu	0.15			310

本发明的蛋白分解物(含有作为有效成分或相关成分的鉴定的前述7种肽。以下相同)可以调整到等电点的pH后，作为游离(自由)的蛋白质分解物使用，或者从等电点调整至酸性或碱性的pH之后，通过冻干、喷雾干燥等除去溶剂，或者添加乙醇等的溶剂使其沉淀等方法，由此可以得到酸加成盐(盐酸盐等无机酸盐或富马酸盐等有机酸盐)或碱盐(例如Na，K等的碱金属盐)的形式。碱盐优选尽可能抑制作为升压物质的钠的含量的那些。这样的蛋白分解物可以在溶液形态下使用，通常优选以固体物质，例如结晶、非晶形或粉末的形态分离，使用。

本发明的蛋白分解物本身可以作为食品使用，或单独使用，或和适当的无毒经口摄取用载体、稀释剂或成形剂一起做成片剂(未包衣片、糖衣片、泡腾片、薄膜包衣片、咀嚼片等)、胶囊剂、锭剂、粉末剂、细粒剂、颗粒剂、液剂、悬浊液、乳浊液、糊剂、霜液、注射剂(包括添加到氨基酸输液、电解质输液等的输液中的情况)、或者可以做成肠溶性的片剂、胶囊剂、颗粒剂等缓释型制剂等的食品用或医药用制剂。前述制剂中的蛋白分解物的含量可以适当的选择，一般是0.01～100重量％范围。

另外，通过添加配合本发明的蛋白分解物(蜂王浆酶分解物)可以配制的食品的具体形态例如有：饮料类(清凉饮料(咖啡、可可饮料、果汁、矿物质饮料、茶饮料、绿茶、红茶、乌龙茶等)、乳饮料、乳酸菌饮料、酸乳饮料、碳酸饮料、酒类(日本米酒、洋酒、果酒、蜂蜜酒等)等)、涂在面包上的软质食品(スプレツド)(乳蛋糕乳脂、加糖奶油浆、花生浆、巧克力浆、涂抹干酪等)、糊状物(果泥、蔬菜泥、芝麻糊、海藻糊等)、洋点心(巧克力、油炸圈饼、馅饼、奶油面包、手指形小蛋糕、松饼、华夫饼干、口香糖、胶姆糖、果冻、糖果、曲奇饼、克力架、饼干、方便点心、蛋糕、布丁等)、日式点心(饴糖、日本脆饼干、油炸糖点心、米雪、米粉团、牡丹饼、年糕饼、豆饼、饼、馅、馒头、蛋糕、豆沙水果凉粉、羊羹等)、冰果(冰激淋、冰棍、果子露冰激淋、刨冰等)、杀菌罐头食品(咖喱、牛肉饭、中华饭、杂饭、稀粥、调料、汤、肉沙司、半冰沙司、肉球、汉堡、杂烩类、红小豆米饭、烤鸡肉串、蒸鸡蛋羹等)、速食食品(方便面、速食乌冬面、速食荞麦面、速食炒面、速食意大利实心面、速食混沌面、速食年糕小豆汤、调料精、粉末汤精、果汁粉混料、混合热糕点(ホツトケ一キミツクス)等)、瓶装食品及罐装食品、胶状食品(果冻、琼脂、陶罐装食品(テリ一ヌ)、胶状饮料等)、调料(食盐、天然盐、酱油、日本甜料酒、醋、砂糖、蜂蜜、味精、调料品、增香调料(旨味調味料)、复合调料、沙司、蛋黄酱、调味番茄酱(ケチヤツプ)、往振动添加的粉末食品(ふりかけ)、天麸罗料汁(天つゆ)、面汁(麺つゆ)、即食肉汤、中华清汤料、中华汤料(麻婆豆腐料、青椒肉丝料)、肉汤、烤肉佐料、冷火锅佐料、咖喱油糊(カレ一ル一)、炖菜用油糊(シチユ一のル一)等)、蜂产品(蜂蜜、蜂王浆、蜂胶、花粉团子(花粉だんご)、幼蜂等)、乳制品(牛奶、乳酪、酸奶、生奶油等)、经加工果实(果酱、橘皮果酱、糖水水果(シロツプ漬)、干果等)、经加工蔬菜(蔬菜酱等)、谷物类加工食品(面、意大利面条、面包、米粉等)、腌菜(咸菜、柰良泡菜、朝鲜泡菜、福神泡菜、腌葱、腌白菜、芥末腌菜、腌结缕草、少盐腌菜、腌渍品等)、腌菜料(即食腌菜原料、腌白菜原料等)、鱼肉制品(鱼糕、圆筒状鱼糕、鱼肉山芋饼等)、畜肉制品(火腿、红肠、腊肠、腊肉等)、好吃的食品(枪乌贼(さきするめ)、鳕鱼(さきタラ)、腌海胆(ウニの塩辛)、腌墨斗鱼、腌章鱼、冠鳞单棘纯的味醂干(カワハギみりんぼし)、河豚的啉醂干、熏墨斗鱼、腌海参肠等)、干物(带味海苔等)、日常食品类(拌菜、油炸食品、炒菜、烧菜、煮菜、醋拌食品等)、冷冻食品(炸虾、炸肉饼、春卷、炸猪排、烧麦、饺子、汉堡、章鱼团子、含豆酱的日本松饼(回転焼き)、肉包子、有馅馒头等)、油脂食品(色拉油、人造黄油、黄油)等。通过添加配合本发明的蜂王浆蛋白分解物可以配制的食品也可以作为保健食品、功能性食品、营养辅助补品、辅助品、特定保健用食品、病人用食品·病人用组合食品(厚生劳动省、特别用途食品的一种)或高龄者用食品(厚生劳动省、特别用途食品的一种)，这种情况下，也可以做成未包衣片、薄膜包衣片、糖衣片、颗粒、粉末、药片、胶囊(硬胶囊和软胶囊中的任何一种)、咀嚼类、糖浆类、药水类等。添加配合有本发明的蜂王浆酶分解物的食品的配制可以使用公知的方法。

含有本发明的蛋白分解物的特定保健用食品等对血压正常高值血压(收缩压为130～139mmHg，舒张压为85～89mmHg)以及轻度高血压(收缩压为140～159mmHg或者舒张压为90～99mmHg)的两类人均具有预防高血压的效果。

本发明的蛋白质分解物具有理想的特性：对轻度高血压及正常高值血压的被测者具有特别明显的降压效果，但是，对正常或低血压的被测者的血压几乎没有影响，或者只有轻微的作用。

本发明的蛋白质分解物经口摄取可以直接被口腔粘膜或胃肠管吸收，或者，在胃肠管中水解而被吸收之后，显示强的持续的ACE抑制作用，为了预防高血压症、缓和高血压倾向或调节血压，可以继续摄取，可以用作预防高血压的功能性食品、特别是保健用食品等。为了该目的使用本发明的蛋白分解物或制剂时，一般来说体重60kg的成人一天经口摄取10mg～10g、优选0.1～5g、更优选0.5～3g、特别优选0.5～1g。

另外也可以将本发明的蛋白质分解物与蜂王浆、蜂胶、蜂蜜、花粉、幼蜂等并用，或混合使用。

本发明的蛋白质分解物几乎或完全没有过敏反应等副作用，作用持续时间长、一天摄取一次(给药)可以显示充分的降压作用。而且，虽然具有速效性，但是没有血压快速降低、或大量饮用时血压大副度降低的问题，具有安全性高的降压作用。另外对人具有优良的降压作用。

具体实施方式

下面，使用实施例进一步详细地说明本发明。

实施例1

(1)蜂王浆原材料的蛋白分解物的配制

将1g干燥蜂王浆(蛋白质含量0.4g)溶解在10ml的蒸馏水中，调节pH为8后，相对蜂王浆原材料添加0.25重量％的胰蛋白酶(源自牛胰脏、Roche公司制)，温育24小时。对开始温育3小时、6小时、及24小时后的样品测定ACE抑制率。反应液的pH通过添加氢氧化钠使其维持在pH8左右。

使用胰凝乳蛋白酶(pH7)或胃蛋白酶(pH2)代替胰蛋白酶，同样温育24小时，对开始温育3小时、6小时、及24小时后的样品，按照下述(2)测定ACE抑制率。

(2)ACE抑制活性的测定

将如上所述得到的蛋白分解物4mg/mL(反应液浓度0.8mg/mL)25μl放入试管中，向其中添加源自兔肺的25mU/mL ACE溶液^*1·硼酸缓冲液(pH8.3)100μl，在37℃温育5分钟。添加12.5mM的马尿酰-L-组氨酰-L-亮氨酸(Hippuryl-L-histidyl-L-Leucine)(HHL、ペプチド研究公司制)^*2·硼酸缓冲液(pH8.3)50μl作为底物，在37℃温育60分钟。然后，添加0.5M盐酸溶液125μl使反应停止，添加0.625mM的m-甲基马尿酸乙腈溶液^*3100μl作为内标液，为了提取反应生成物的马尿酸添加乙酸乙酯750μl，之后，利用涡流混合机搅拌，离心分离(2000rpm，5min)。取其有机层0.5mL，在60℃氮气流下蒸发干燥固化，将残留物溶解在HPLC用流动相0.5mL中，做成试样溶液。

另外将硼酸缓冲液(pH8.3)^*4 25μl放置在试管中，向其中添加源自兔肺的25mU/mL ACE溶液^*1·硼酸缓冲液(pH8.3)^*4 50μl，在37℃温育5分钟后，以下和试样溶液进行同样的操作，做成标准溶液。另外，将硼酸缓冲液(pH 8.3)75μl放置在试管中，在37℃温育5分钟。然后，以下和试样溶液进行同样的操作，作为空白试验。对于试样溶液、标准溶液和空白试验液20μl在下述条件下利用HPLC方法进行测定。求得各自的马尿酸对m-甲基马尿酸的峰面积比。

<HPLC条件>

检测器：UV(测定波长：228nm)

柱：L-column ODS 4.6mm×150mm(财团法人化学物质评价研究机构制)

柱温：40℃

流动相：10mK KH2PO4(pH3.0)/乙腈＝17/3

流量：1.0mL/min

注射量：20μL

根据HPLC法得到的各自的马尿酸的峰面积对m-甲基马尿酸的峰面积的比，按照以下所示的式子计算抑制率(IC(％))。

抑制率(IC(％))＝{(Rs-Rt)/(Rt-Rb)}×100

Rs；试样溶液的马尿酸的峰面积对m-甲基马尿酸的峰面积的比

Rt；标准溶液的马尿酸的峰面积对m-甲基马尿酸的峰面积的比

Rb；空白试验液的马尿酸的峰面积对m-甲基马尿酸的峰面积的比

^*1：25mU/mL ACE溶液

在源自兔肺的血管紧张素I转化酶(シグマ公司制)0.25U或1U/小瓶(vial)中添加pH8.3硼酸缓冲液1mL、溶解(0.25U或1U/mL、冷冻保存)。

将该液用pH8.3硼酸缓冲液进行适当地稀释，配制25mU/mL溶液(用时配制)。

^*2：12.5mM的Hip-His-Leu(底物溶液)

在马尿酰-L-组氨酰-L-亮氨酸(HHL·H₂O、分子量447.8、ペプチド研究所制)中添加pH8.3硼酸缓冲液，在沸腾水浴中加热3分钟，溶解，配制12.5mM溶液。

{HHL·H₂O 5.5935g+pH8.3硼酸缓冲液1mL：12.5mM(用时配制)}

^*3：内标液(3→25000)

在m-甲基马尿酸(分子量：193.20)12mg中加入水/乙腈混合液(9：1)，溶解，作成100mL，作为内标液(冷藏保存)。

^*4：pH8.3硼酸缓冲液

A液：0.2M硼酸溶液(含有0.3M氯化钠)

硼酸12.4g+氯化钠17.5g+水→1000mL

B液：0.05M四硼酸钠溶液(含有0.3M氯化钠)

在A液中添加B液，将pH调整为8.3(冷藏保存)。

结果示于表4及图1。

表4

ACE抑制率(反应液中浓度：0.8mg/ml)

反应时间(hr)	蛋白分解酶
				胰蛋白酶	胃蛋白酶	胰凝乳蛋白酶
	0	0.0	0.0				0.0
3				49.1	34.3	25.2
	6	56.6	41.6				33.3
24				68.2	55.5	46.3

从上述结果可知，利用胰蛋白酶的水解物其ACE抑制活性最强。

另外，在温育24小时后的酶分解物中，通过SDS-PAGE分子量20000以上的蛋白质在本发明的蛋白分解物中几乎没有发现，但是胃蛋白酶分解物及胰凝乳蛋白酶分解物中作为谱带得到确认。

而且，使用COSMOSIL-5C18-AR-300(4.6×150mm)蛋白质分离用ワイドポアカラム作为柱通过HPLC法进行色谱分析时，发现蛋白分解物的生成肽量以胰蛋白酶为最多。

由上述结果确认了胰蛋白酶最优选。

实施例2

使用通过在生蜂王浆中添加乙醇而沉淀的蜂王浆的乙醇变性蛋白质代替1g干燥蜂王浆(蛋白质含量0.4g)，和实施例1同样进行24小时处理。求得该胰蛋白酶处理物的ACE抑制率，得到和实施例1的蜂王浆几乎同等的ACE抑制率。

将利用胰蛋白酶处理24小时的反应液调整为pH4.5，加载到合成吸附剂(セパビ一ズSP-70(三菱化学制))上，水洗，除去氯化钠和酸性或碱性的游离氨基酸以及糖类等之后，用乙醇洗脱，得到脱盐的本发明的蛋白分解物。

对于实施例1使用的干燥蜂王浆(干燥RJ)、实施例1得到的该脱盐前的胰蛋白酶分解物(脱盐前；干燥RJ-酶)、实施例2使用的蜂王浆的乙醇变性蛋白质(RJ变性)、该蛋白分解物(脱盐前(RJ-变性-酶)；及脱盐后，柱吸附后的洗净级分(1W)、柱吸附物的乙醇洗脱级分(1E)的氨基酸组成比，对于各样品的氨基酸组成而言，将甲磺酸分解后的分解物、或游离氨基酸进行薄膜过滤器过滤(孔径；0.45μm)过的滤液分别进行氨基酸浓度测定(日立L-8500型高速氨基酸分析计)，进行比较研究。结果示于表5，表6，表7，图2和图3。另外，表5和图2是将Gly设为1摩尔时的相对值，表6和图3是将Lys设为1摩尔时的相对值，表7分别显示游离氨基酸的测定值。从结果确认：利用柱处理，酸性或碱性的游离氨基酸、游离Ala、游离Gly被水洗除去，在柱吸附级分中较多地分布着游离的芳香族及脂肪族的氨基酸。

表5

酸水解后的氨基酸                                                           (摩尔比、对照；Gly)

氨基酸名	干燥的蜂王浆		蜂王浆变性蛋白
							酶反应前(干燥RJ)	酶反应后(干燥RJ-酶)	酶反应前(RJ变性)	柱处理前	柱处理后
	酶反应后(RJ变性-酶)	洗净级分(1W)	洗脱级分(1E)
				AspThrSerGluProGlyAlaValMetIleLeuTyrPheLysHisArg	3.030.731.241.430.6010.780.840.070.471.010.510.500.940.270.54	3.100.961.271.530.9010.790.930.040.651.160.620.571.190.330.65				3.650.901.301.480.8210.810.940.050.631.180.570.561.090.320.60	3.130.891.191.510.6510.870.970.090.701.170.640.600.980.340.58	3.600.951.121.640.4811.560.900.130.681.130.540.272.450.411.09	2.800.871.181.400.7010.641.010.060.711.230.680.710.490.270.40

表6

酸水解后的氨基酸                                                                   (摩尔比、对照；Lys)

氨基酸名	干燥的蜂王浆		蜂王浆变性蛋白
							酶反应前(干燥RJ)	酶反应后(干燥RJ-酶)	酶反应前(RJ变性)	柱处理前	柱处理后
	酶反应后(RJ变性-酶)	洗净级分(1W)	洗脱级分(1E)
				AspThrSerGluProGlyAlaValMetIleLeuTyrPheLysHisArg	3.210.771.321.520.641.060.820.890.070.501.070.540.5310.290.57	2.620.811.071.290.760.840.660.780.030.550.980.520.4810.280.55				3.340.831.191.350.750.920.750.860.050.581.080.520.5110.290.55	3.190.911.221.540.671.020.890.990.090.721.190.650.6110.340.60	1.470.390.460.670.200.410.640.370.050.280.460.220.1110.170.45	5.691.762.392.841.422.031.312.050.121.442.491.381.4310.560.81

表7

游离氨基酸                                                                                    (测定值；μmol/10mg)

氨基酸名	干燥的蜂王浆		蜂王浆变性蛋白
							酶反应前	酶反应后	酶反应前	柱处理前	柱处理后
	酶反应后	洗净级分	洗脱级分
				AspThrSerGluProGlyAlaValMetIleLeuTyrPheLysHisArg	0.03390.00000.00000.04970.17040.00000.00000.00000.00000.00000.00000.00000.00000.19530.00000.0110	0.02920.00830.00000.07860.55180.00000.06430.04410.01500.02010.04970.01280.00000.49370.02520.1035				0.03910.00000.00000.08590.58160.01440.01980.02800.00000.00000.00000.00000.00000.45400.00000.0358	0.09560.04390.02910.13780.24010.08670.67380.30800.06310.30450.62760.25810.30000.57000.13870.0000	0.17420.07610.04986.23930.40100.11061.14680.50890.10020.46800.91010.37910.16270.97220.26660.0000	0.00000.00000.00000.00000.01600.00000.00000.03950.00970.06770.20530.07310.45190.00000.00000.0000

另外，取进行24小时处理后的胰蛋白酶分解物25mg，添加流动相20mL，进行超声波处理，使之溶解，做成25mL，对于其10mL，进行下述的凝胶透过色谱(GFC)分析，测定分子量分布。

<GFC分析>

柱：TSKgel G2000SW_XL7.8mmI.D.×30cm

流动相：0.1％TFA/乙腈

流速：1.0mL/min

柱温：25℃

检测：UV(220nm)

将GFC分析结果示于表4。

实施例3：蜂王浆(RJ)蛋白水解物的相关成分的结构分析

取蜂王浆的乙醇变性蛋白100g，根据实施例1所述的方法，在pH8.0的条件下，利用胰蛋白酶在37℃下进行24小时酶分解。将反应液在沸腾水浴中加热30分钟，使酶失去活性之后，用盐酸调整至pH4.5，离心分离(10000rpm、20分钟)，将得到的上清液用薄膜过滤器过滤，得到RJ蛋白水解物1160mL。

将得到的RJ蛋白水解液按照上述路线使用ダイヤイオンHP20，用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇及甲醇(100％)洗脱，得到级分1(Fr1)～级分7(Fr7)。

然后，将由级分3～6鉴定的9个相关成分(肽)的分离和鉴定的详细情况列在下面：

蜂王浆蛋白水解物的相关成分的分离、鉴定

1.分离鉴定肽

HP20 Fr3级分

单离肽I：Glu-Trp-Lys(P30615-1)

单离肽II：His-Pro-Ala-Leu(P30615-3-7-3)

单离肽III：Thr-Phe(P30618-3-3)

HP20  Fr4级分

单离肽IV：Ser-Pro-Leu(P40408-3-2)

单离肽V：Asn-Leu-Tyr(P41219-2-1)

单离肽VI：Leu-Ser-Tyr(P41210-4-1-2)

单离肽VII：Thr-Pro-Phe(P41211-3)

单离肽VIII：Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr(P40323-3-4)

单离肽IX：Tyr-Ser-Pro-Leu(P40528-3-2)

2.相关成分鉴定用检测样的配制

(1)蜂王浆蛋白水解物的配制

在蜂王浆乙醇变性蛋白100g中添加1200mL水，边在37℃的水浴中搅拌边添加20％的氢氧化钠溶液，调节到pH8.0，添加胰蛋白酶250mg，用1mol/L氢氧化钠试液使其保持pH8.0，同时在37℃下酶分解24小时之后，在沸腾水浴中加热30分钟。在其中加入稀释的盐酸(1→2)调节到pH4.5，进行离心分离(10000rpm，20分钟)之后，将得到的上清液用薄膜过滤器过滤，得到蜂王浆蛋白水解液1160mL。(2)利用ダイヤイオンHP20进行粗分级

将蜂王浆蛋白水解液855mL装载在填充有作为合成吸附剂的ダイヤイオンHP20的玻璃柱(11cmφ×20cm，容量：约1.9L)中，按照水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇及100％甲醇的顺序洗脱，将水洗脱级分设定为级分(以下称Fr)1，2，将20％、40％、60％、80％及100％甲醇洗脱级分分别设定为Fr3，4，5，6及7。用蒸发器使各分级液浓缩后，冻干，将得到的Fr3级分(5.38g)，Fr4级分(8.34g)，Fr5级分(11.58g)及Fr6级分(4.84g)作为相关成分鉴定用的检测样。

3.蜂王浆蛋白水解物的相关肽(関与ペプチド)的分离、鉴定

(1)来自Fr3级分的相关肽的分离、鉴定

单离肽I：Glu-Trp-Lys(P30615-1)

对于利用HP20进行粗分级的Fr3级分，通过利用高效液相色谱法使用大口径的制备用ODS柱[柱：TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流动相：7％，15％，25％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量：42mL/mL，柱温：室温，检测波长：UV220nm。以下，称为HPLC]进行再分级。

对于Fr3级分约4g，分阶段地变换流动相[7％乙腈(含有0.05％TFA)：0～94分，15％乙腈(含有0.05％TFA)：94～121分，25％乙腈(含有0.05％TFA)：121～135分，50％乙腈(含有0.05％TFA)：135～]进行再分级，向保留时间为(以下称为Rt)为61.5～83.4分及98.0～112.4分得到的分级液中添加乙醇并浓缩，反复进行该操作至TFA臭味消失为止，之后用少量的水溶解残留物，冻干，得到P3(6)(级分3的第6峰)(0.471g)，及P3(8)(级分3的第8峰)(0.107G，供肽III的分离用)。

对于P3(6)(0.471g)，使用中口径的半制备用ODS柱[COSMOSIL5C18AR-II 20mmφ×250mm]，在流量：8mL/mL，柱温：40℃，检测波长：UV220nm的条件下，通过在流动相A中使用0.05％TFA，流动相B中使用50％甲醇(含有0.05％TFA)的浓度梯度法(0分：Bconc 0％→360分：Bconc75％)，制备分离Rt为57.6～77.1分及84.2～100.9分的峰部分，将得到的制备液分别进行浓缩、冻干，得到制备提纯物P30615-1(35.7mg)及P30615-3(107.0mg，供给肽II的分离)。

对得到的P30615-1，利用HPLC进行纯度分析，以及酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P30615-1的结构确定为Glu-Trp-Lys。

分离肽II：His-Pro-Ala-Leu(P30615-3-7-3)

对纯度低的先前的P30615-3(107.0mg)，再次使用中口径的半制备用ODS柱，将流动相从8％甲醇(含有0.05％TFA)变换为50％甲醇(含有0.05％TFA)(61.3分)，制备分离(分取)Rt为68.9分～70.2分的峰部分，进行浓缩、冻干，得到P30615-3-7(9.2mg)。

对于P30615-3-7(9.2mg)，再在使用口径小并且分离能力高的ODS柱的条件下[柱：COSMOSIL 5C18AR-II 10mmφ×250mm，流动相：8％甲醇(含有0.05％TFA)，流量：2mL/mL，柱温：40℃，检测波长：UV220nm]，对Rt为57.1～59.8分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到制备的提纯物P30615-3-7-3(0.7mg)。

对得到的P30615-3-7-3利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P30615-3-7-3的结构确定为His-Pro-Ala-Leu。

分离肽III：Thr-Phe(P30618-3-3)

对于通过大口径的ODS柱进行再分级得到的P3(8)(0.107g)，使用中口径半制备用ODS柱，在与分离肽I相同的条件下通过浓度梯度法，对Rt为82.6分～92.0分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到P30618-3(12.2mg)。

对P30618-3(12.2mg)，再使用口径小的ODS柱(内径10mm)，使用10％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，对Rt为39.7份～45.2份的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到P30618-3-3(3.7mg)。

对得到的P30618-3-3，利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P30618-3-3的结构确定为Thr-Phe。

(2)来自Fr4级分的相关肽的分离、鉴定

分离肽IV：Ser-Pro-Leu(P40408-3-2)

对于利用HP20进行粗分级的Fr4级分(8.34g)约5g，通过使用大口径的制备用ODS柱的高效液相色谱法[柱：TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流动相：10％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量：42mL/mL，柱温：室温，检测波长：UV220nm]进行再分级。

对于流动相为10％乙腈(含有0.05％TFA)，将Rt为52.1～83.5分以及118.9～179.0分的分级液进行浓缩、冻干，得到P4(2)(级分4的第2峰)(0.536g)和P4(4)(级分4的第2峰)(不进行冻干，浓缩干燥固化后，供给肽V～VIII的分离)。另外，在179分后将流动相变换为50％乙腈(含有0.05％TFA)，将Rt为179.0～205.0的分级液进行浓缩、冻干，得到P4(5)(2.162g，供给肽IX的分离)。

对于P4(2)(0.536g)，再次使用大口径的制备用ODS柱，将8％乙腈(含有0.05％TFA)作为流动相，将Rt为76.2～90.2分的分级液进行浓缩、冻干，得到P40121-13(91.4mg)。

对得到的P40121-13(91.4mg)，使用中口径的半制备用ODS柱，使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，对Rt为42.6～51.6分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到P40408-3(12.1mg)。

对得到的P40408-3(12.1mg)，再次使用中口径的半制备用ODS柱，通过在流动相A中使用0.05％TFA、在流动相B中使用50％甲醇(含有0.05％TFA)的浓度梯度法(0分：Bconc 0％→360分：Bconc100％)，对Rt为95.1～99.1分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到制备分离的提纯物P40408-3-2(1.2mg)。

对得到的P40408-3-2，利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P40408-3-2的结构确定为Ser-Pro-Leu。

分离肽V：Asn-Leu-Tyr(P41219-2-1)

对于使用大口径的制备用ODS柱进行再分级而得到的P4(4)，再次使用大口径的制备用ODS柱，使用10％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相进行再分级，对从Rt为63.0～82.7分、82.7～108.0分、108.0～126.5分、以及141.0～163.4分得到的各分级液进行浓缩、冻干，分别得到P41206-3(133.1mg，供给肽VIII的分离)、P41206-4(177.8mg)、P41206-5(74.2mg，供给肽VI的分离)、和P41206-7(41.7mg，供给肽VII的分离)。

对得到的P41206-4(177.8mg)100mg，使用中口径的制备用ODS柱，使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，对Rt为121.9～153.5分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到P41219-2(23.38mg)。

对得到的P41219-2-2(23.38mg)，再次在相同条件下进行制备分离、提纯操作，从Rt为118.3～142.9分的峰部分，得到P41219-2-1(12.3mg)。

对得到的P41219-2-1，利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P41219-2-1的结构确定为Asn-Leu-Tyr。

分离肽VI：Leu-Ser-Tyr(P41210-4-1-2)

对通过大口径制备用ODS柱进行二次再分级操作得到的P41206-5(74.2mg)，使用中口径的半制备用ODS柱，使用17％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，制备分离Rt为65.5分～80.7分的峰部分，并进行浓缩干燥固化，得到P41210-4(未进行冻干)。对得到的P41210-4再次在同一条件下进行制备分离、提纯操作，从Rt为63.5～85.3分的峰部分得到P41210-4-1(12.7mg)。

另外，对得到的P41210-4-1(12.7mg)，使用中口径的半制备用ODS柱，使用15％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，对Rt为92.0分～102.7分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到制备分离的提纯物P41210-4-1-2(5.18mg)。

对得到的P41210-4-1-2，利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P41210-4-1-2的结构确定为Leu-Ser-Tyr。

分离肽VII：Thr-Pro-Phe(P41211-3)

对通过大口径制备用ODS柱进行二次再分级操作得到的P41206-7(41.7mg)，使用中口径的半制备用ODS柱，使用15％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，对Rt为70.4分～88.6分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到P41211-3(5.8mg)。

对得到的P41211-3，利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P41211-3的结构确定为Thr-Pro-Phe。

分离肽VIII：Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr(P40323-3-4)

对通过大口径制备用ODS柱进行二次再分级操作得到的P41206-3(133.1mg)，使用中口径的半制备用ODS柱，使用13％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，对Rt为73.1分～84.8分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到P40323-3(10.5mg)。

另外，对得到的P40323-3(10.5mg)，使用ODS柱(内径10mm)，使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)作为流动相，对Rt为73.9分～77.1分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到制备分离的提纯物P40323-3-4(1.0mg)。

对得到的P40323-3-4，利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P40323-3-4的结构确定为Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr。

分离肽IX：Thr-Ser-Pro-Leu(P40528-3-2)

对通过大口径制备用ODS柱进行再分级操作得到的P4(5)(2.162g)，再次使用大口径的制备用ODS柱，使用15％乙腈(含有0.05％TFA)作为流动相，进行再分级，对Rt为60.0分～70.0分的分级液进行浓缩、冻干，得到P40413-5(75.8mg)。

对得到的P40413-5(75.8mg)，使用中口径的半制备用ODS柱，通过在流动相A中使用0.05％TFA，流动相B中使用50％甲醇(含有0.05％TFA)的浓度梯度法(0分：Bconc30％→360分：Bconc 100％)，对Rt为75.4～86.0分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到P40528-3(5.9mg)。

另外，对得到的P40528-3(5.9mg)，在流动相中使用22.5％甲醇(含有0.05％TFA)的单一溶剂，再次利用中口径的半制备用ODS柱，对Rt为43.4～46.4分的峰部分进行制备分离、提纯操作，得到制备分离的提纯物P40528-3-2(1.6mg)。

对得到的P40528-3-2利用HPLC进行纯度分析，并在酸水解后进行氨基酸分析，基于得到的构成氨基酸的比率利用LC/MS/MS进行结构分析，将P40528-3-2的结构确定为Tyr-Ser-Pro-Leu。

实施例4：蛋白质分解物的活体内试验(大鼠)

I.一次经口给用时的血压降低作用

1)被测物质

使用蜂王浆(RJ)的乙醇变性蛋白质为原料，与实施例2相同，配制用胰蛋白酶处理RJ乙醇变性蛋白后脱盐的分解物，供以下的试验用。

2)使用的动物

采购Crj：SHR(雄性、八周龄、日本チヤ一ルスリバ一)，检疫驯化饲养后，在九周龄(体重235-260g)时用于试验。大鼠在金属丝网5个串联笼(5連ケ一ジ)的1个隔间(1区画)中分别饲养，在调节为温度：23±2℃、湿度：30～70％、换气次数：12次以上/小时、照明时间：12小时(照明期：6:30～18:30)的环境的动物饲养室内饲养，使其自由地摄取固体饲料(CRF-1、オリエンタル酵母工业(株))及自来水。

3)试验方法

在试验时使用了一组六只SHR。RJ变性蛋白质水解物用注射用蒸馏水溶解，一次以10mL/kg的用量进行经口投喂。向对照组同样投喂注射用蒸馏水。将大鼠放入设定为40℃的保温箱内，进行十分钟的加温后，使用血压计(TK-370C、ニュ一ロサイエンス)，利用tail cuff法在清醒的状态下测定血压(收缩压、平均血压及舒张压)及心率数。血压的测定在投喂RJ变性蛋白水解物前和投喂4、8、12、16、20及24小时后进行。

4)统计处理

数据利用平均值±标准偏差表示。与对照组的显著性差异(有意差)的检定，利用一元配置进行分散分析，在确认显著性差异的情况下，在RJ变性蛋白水解物和对照组之间进行Dunnett型多重比较检定。另外，显著性水平(有意水準)设为5％(解析软件：StatView，SAS InstituteInc.制)。

5)结果

1、收缩压

图5中表示了投喂RJ变性蛋白水解物前和投喂4、8、12、16、20及24小时后测定的收缩压的变化。对照组及RJ变性蛋白水解物3g/kg组的投喂前的收缩压分别为226±6及225±7mmHg。对照组的收缩压到投喂24小时后显示大致恒定的值，并在217～229mmHg的范围内变化。RJ变性蛋白水解物3g/kg组的收缩压在投喂4～16小时后，在比对照组低10～20mmHg的值范围内变化，投喂8、12及16小时后的收缩压与对照组相比，明显地降低。

2、平均血压

测定投喂RJ变性蛋白水解物前和投喂4、8、12、16、20及24小时后测定的平均血压的变化。对照组及RJ变性蛋白水解物3g/kg组投喂前的平均血压分别为173±4及166±4mmHg。对照组的平均血压到投喂24小时后显示大致恒定的值，并在164～176mmHg的范围内变化。RJ变性蛋白水解物3g/kg组的平均血压在投喂8～20小时后，在比对照组低10～17mmHg的值的范围内变化，投喂16小时后的平均血压与对照组相比，明显地降低。

3、舒张压

测定投喂RJ变性蛋白水解物前和投喂4、8、12、16、20及24小时后测定的舒张压的变化。对照组及RJ变性蛋白水解物3g/kg组投喂前的舒张压分别为150±4及139±4mmHg。对照组的舒张压到投喂24小时后显示大致恒定的值，并在140～151mmHg的范围内变化。RJ变性蛋白水解物3g/kg组的舒张压在投喂8及12小时后，在比对照组低10～13mmHg的值的范围内变化，投喂8小时后的舒张压与对照组相比，明显地降低。

4、心率数

测定投喂RJ变性蛋白水解物前和投喂4、8、12、16、20及24小时后测定的心率数的变化。对照组及RJ变性蛋白水解物3g/kg组投喂前的心率数分别为468±15及445±6次/分。对照组及RJ变性蛋白水解物3g/kg组对心率数没有明显的影响。

II.连续经口投喂八周时的血压降低作用

1)被检物质

使用蜂王浆(RJ)乙醇变性蛋白质为原料，与实施例2相同，配制用胰蛋白酶处理RJ乙醇变性蛋白后脱盐的分解物，供以下的实验用。

2)使用的动物

采购Crj：SHR(雄性、八周龄、日本チヤ一ルスリバ一)检疫驯养后，在九周龄(体重235-260g)时进行试验。大鼠在金属丝网5个串联笼的1个隔间中分别饲养，在调节为温度：23±2℃、湿度：30～70％、换气次数：12次以上/小时、照明时间：12小时(照明期：6:30～18:30)的环境的动物饲养室内饲养，使其自由地摄取固体饲料(CRF-1、オリエンタル酵母工业(株))及自来水。

3)试验方法

在实验时使用了一组11只SHR。被检物质用注射用蒸馏水溶解，以一日一次20ml/kg的用量进行八周经口投喂。向对照组同样投喂注射用蒸馏水。将大鼠放入设定为40℃的保温箱内，进行十分钟的加温后，使用血压计(TK-370C、ニュ一ロサイエンス)，利用tail cuff法在清醒的状态下测定血压(收缩压、平均血压及舒张压)及心率数。在开始投喂被检物质前和开始投喂后每周测定一次、投喂八小时后进行测定。另外，在投喂期间结束1及2周后同样测定血压及心率数。每周测定一次体重。

实验组

1、对照组(投喂蒸馏水)

2、RJ乙醇变性蛋白水解物(3g/kg)

3、RJ乙醇变性蛋白(3g/kg)

4)统计处理

结果利用平均值±标准偏差表示。组间比较使用Dunnett型多重比较检定进行解析。以风险率(危険率)小于5％判定为显著。

5)结果

1.收缩压

图6中表示出了投喂被测物质八小时后每周进行一次测定的收缩压的变化。投喂蒸馏水的对照组的收缩压随试验期间的经过而上升，从投喂前到投喂4周后血压以约10mmHg/周的比例上升，以后直至试验期间结束，血压以约2～5mmHg/周的比例上升。RJ变性蛋白水解物3g/kg组的收缩压在投喂三周后为止以与对照组大致相同的变化显示血压上升，但在投喂四周后以后的期间，与对照组相比，显示抑制血压上升的图形。投喂5周后的收缩压为207±3mmHg，然后，直至投喂期间结束(投喂八周后)，在比对照组的收缩压低约10mmHg的值的范围内变化。在投喂7周后及八周后的收缩压分别为214±3mmHg、210±3mmHg，与对照组相比，明显的降低。投喂结束后，在停药一周后为217±3mmHg，停药二周后为221±2mmHg，渐渐恢复至与对照组相同水平的收缩压。

另外，RJ变性蛋白3g/kg组的收缩压以和投喂期间中对照组同样的变化发生变动。停药期间的收缩压也显示和对照组相同水平的血压。

2、平均血压

在投喂被测物八小时后每周一次测定平均血压的变化。对照组的平均血压随试验期间的经过而上升，在到投喂三周后为止，以约10mmHg/周的比例上升。投喂4周后的平均血压为158±4mmHg，以后直至投喂期间结束，血压以163～170mmHg的值变化。RJ变性蛋白水解物3g/kg组的平均血压在投喂2周后为止，显示与对照组相同的血压上升，但投喂3周后，与对照组相比，显示抑制血压上升的图形。投喂3周后的平均血压为153±2mmHg，其后，直至投喂期间结束，在比对照组的平均血压低约10mmHg的值的范围内变化。投喂7周后及八周后的平均血压分别为161±2mmHg及158±1mmHg，与对照组相比，明显降低。在投喂结束后的停药期间，停药一周后为165±2mmHg，停药二周后为164±3mmHg，渐渐恢复至与对照组相同水平的平均血压。RJ变性蛋白3g/kg组的平均血压为167±2mmHg，与对照组的平均血压的程度相同。停药期间的平均血压也显示与对照组同样的水平。

3、舒张压

在投喂被测物八小时后每周一次测定舒张压的变化。对照组的舒张压随试验时间的经过而上升，在到投喂三周后为止，血压以约10mmHg/周的比例上升。在到投喂3周后为止的舒张压为137±5mmHg，以后直至试验期间结束，以140～144mmHg的值变化。RJ变性蛋白水解物3g/kg组的舒张压在投喂3周后为止，显示与对照组相同的血压上升，但在投喂3周后以后的期间，与对照组相比，显示抑制血压上升的图形。投喂3周后的舒张压为132±3mmHg，以后直至投喂期间结束，在比对照组的舒张压低约10mmHg的值的范围内变化。投喂8周后的舒张压与对照组相比，明显地降低。在投喂结束后的停药期间，停药一周后为140±3mmHg，停药二周后为135±3mmHg，渐渐恢复至与对照组相同水平的舒张压。RJ变性蛋白3g/kg组的平均血压显示和对照组基本同样的血压变动图形。投喂结束后也和对照组具有相同水平的血压。

4、心率数、体重

在投喂被测物八小时后每周一次测定心率数和体重。在整个实验期间，各组的心率数和体重增加没有大的变动，RJ变性蛋白水解物和RJ变性蛋白对心率数和体重增加没有明显的影响。

实施例5：蛋白质分解物的活体内试验(人)

1)被测物质

和实施例2同样，得到RJ乙醇变性蛋白的胰蛋白酶分解物，按照上述路线1使其吸附在ダイヤイオンHP20后，水洗除去级分1和2，然后用80％乙醇洗脱，制备含有级分3～6的本发明的蛋白分解物，供以下实验用。

2)被验者

对相当于从正常高值血压到轻度高血压(血压值：收缩压130～159mmHg、舒张压85～99mmHg)的人67名，按照收缩压、舒张压、年龄、性别均匀地分成四组。在各组间，其年龄、血压、脉搏数、身高、体重、肥胖指数(BMI)方面，没有发现明显差别。

3)试验食物及摄取方法

使用在每一片中配合了含有级分3～6的上述蜂王浆蛋白分解物166.7mg设计的片剂(以下，称为试验食物)，和不配合蜂王浆蛋白分解物的片剂(以下称为空白对照剂(プラセボ))。

表8中显示各试验食物的营养成分表。

表8

试验食物的营养成分(每1片)

项目	含蜂王浆的片	空白对照剂
			热量(kcal)蛋白质(mg)脂质(mg)碳水化合物(mg)灰分(mg)酶处理的蜂王浆(mg)	0.90146.47.372.30.0166.7	0.910.05.2200.60.00.0

摄取进行4周，在摄取2周前和1周前、摄取开始日、摄取1周后、2周后、3周后和4周后、以及摄取结束1周后总共检查8次。

试验食物如表9所示与空白对照剂组合，蜂王浆蛋白分解物摄取量设定为0mg/天、500mg/天、1000mg/天及5000mg/天，在早晚饭后分别食用15片试验食物，总共1天摄取30片。

表9试验食物的摄取方法

组	早饭后	晚饭后	合计
				空白对照剂500mg/天1000mg/天5000mg/天	空白对照剂15片空白对照剂12片含有蜂王浆分解物的片3片空白对照剂9片含有蜂王浆分解物的片6片含有蜂王浆分解物的片15片	空白对照剂15片空白对照剂15片空白对照剂15片含有蜂王浆分解物的片15片	空白对照剂30片空白对照剂27片含有蜂王浆分解物的片3片空白对照剂24片含有蜂王浆分解物的片6片含有蜂王浆分解物的片30片

4)检查方法和统计处理

对所有的被测者一起测定血压、脉搏数、体重和身高，进行血液检查、尿检查、医学检查及问诊。数据用平均值数据±标准偏差表示。对于血压、脉搏数、体重、BMI的比较而言，进行Bonferroni多重比较检定。对收缩压的测定结果示于图9。

5)结果和考察

1、收缩压

4组间并行进行4周连续摄取试验，结果表明在1000mg/天的摄取组中，和摄取日比较，在摄取1周后和4周后收缩压明显降低，在5000mg/天摄取组中也发现摄取3周后和4周后收缩压明显降低。

从上述结果可知，本发明的蛋白分解物的降压作用与用量相关。

另外，在任何一组中，在摄取结束后试验食物组的收缩压缓慢地恢复，都没有发现过度超过摄取前值的反弹现象。

2、其它的检查项目

在尿检中，Na和K一天的预测排泄量没有发现变化，说明了本发明蛋白分解物的降压作用不受食盐摄取量的影响，而是与蛋白分解物有关。

有关各种血液检查、其它的尿检查(蛋白、潜血、尿胆素原)、体重和BMI的各检查项目，没有医学意义上的变动。

特别是被认为有害的现象(副作用)在任何摄取量都没有发现。由此表明本发明的蛋白分解物安全性高。

实施例6：蛋白质分解物对舒缓激肽收缩的影响(豚鼠(モルモツト)取出的回肠)

1)被测物质

和实施例2同样，得到RJ乙醇变性蛋白的胰蛋白酶分解物，按照上述路线1使其吸附在ダイヤイオンHP20后，水洗除去级分1和2，然后用80％乙醇洗脱，配制含有级分3～6的本发明的蛋白分解物，供以下实验用。

对照试剂的エナラプリル(ACE抑制剂)从SIGMA公司购买。级分3，4，5和エナラプリル溶液在注射用蒸馏水(大塚制药(株))溶解。由级分3～6构成的蜂王浆蛋白分解物(RJ-H)和级分6不溶于蒸馏水，因而溶解在硼酸缓冲液(pH8.3)中后使用。对于各被测物质，配制30mg/ml溶液作为原液，用注射用蒸馏水稀释，对预定浓度的溶液(最终浓度3，10，30，100，300μg/ml)进行试验。

2)试验材料

采购Harley系豚鼠(雄性、六周龄、日本エスエルシ一)，在屏障系统的环境下在调节为温度(23±2℃)、湿度(55±15％)、换气(次数：15次/小时以上)及照明(12时间照明：从上午7点到下午7点)的环境的动物饲养室内，通过自由摄取食物及水进行预饲养(驯化)，驯化结束后，豚鼠用乙醚麻醉，击打头部将其放血致死，取出肠管(回肠)，利用通常的方法制成长度约2cm的筒型标本。标本马上放置在加温至27℃的台罗德氏溶液(タイロ一ド液)中。另外，用作营养液的台罗德氏溶液的组成如下所述。

137mM NaCl，2.7mM KCl，1.8mM CaCl₂，1.1mM MgCl₂，0.4mMNaH₂PO₄，11.9mM NaHCO₃，5.5mM葡萄糖，

3)试验方法

在装满台罗德氏溶液(15ml)的马克纳斯管中悬垂标本，加载静止张力约1g，利用等渗性张力转换器(MODEL ME-4013，株式会社エム·イ一·コマ一シヤル，东京)，在记录器(MULTICORDER MC6625，GRAPHTEC，横滨)上记录肠管的运动。使用舒缓激肽(5ng/ml)作为收缩药，用单一浓度反复添加收缩药，使标本收缩，收缩反应近于稳定之后添加被检物质，2分钟后，添加收缩药测定张力。在27℃下进行试验，设定1组4个标本。相对于台罗德氏溶液15ml，被检物质及收缩药分别添加0.15ml(稀释100倍)。关于收缩高的计算，分别在记录纸上测定收缩药单独产生的收缩高和由添加被检物质时的收缩药产生的收缩高，用后者相对于前者(对照)的比率(增强率：％的对照)算出。

4)统计处理

测定结果利用平均值±标准偏差表示。使用从各被检物质的用量作用曲线(EXSAS：一次回归直线)看到直线性的4用量(10～300μg/ml或0.3～10μM)，求出使舒缓激肽收缩增强30％的浓度(AC30；30％增强)。结果示于表10。从下述结果可知，本发明的蛋白分解物具有舒缓激肽增强作用。

表10

试验化合物	N	AC30(μg/ml)
			RJ-H	4	94.3
P-3	4	78.2
			P-4	4	36.2
P-5	4	49.5
			P-6	4	67.8

以下说明含有本发明的蛋白质分解物的处方例。

处方例1(粒)

利用通常的方法，将下述原料混合，用打片仪器成型，制造了8mm直径的未包衣片。利用通常的方法使该未包衣片在食品上进行薄膜包衣，完成了粒状的健康食品。

(每1粒的组成)

表11

实施例2的胰蛋白酶分解物	150mg
		淀粉	90mg
蔗糖脂肪酸酯	10mg
		合计	250mg

处方2(饮用药水)

将下述材料放于水中充分搅拌之后，使总量为100ml。

(1瓶的组成)

表12

实施例1的胰蛋白酶分解物	1g
		柠檬果汁	20ml
蜂胶	0.3g
		维生素C	0.2g
蜂蜜	13g
		水	适量
合计	100ml

处方3(胶囊剂)

将下述材料均匀混合，通过60目的筛之后，将该全部粉末填充在2号明胶胶囊中。

(1个胶囊剂的组成)

表13

实施例2的胰蛋白酶分解物	100mg
		乳糖	100mg
硬脂酸镁	10mg
		合计	210mg

处方4(颗粒)

利用通常的方法，将下述材料制成颗粒状，做成棒状的铝分包(アルミ分包)包装。

(1个颗粒的组成)

表14

实施例2的胰蛋白酶分解物	300mg
		乳糖	1000mg
食物纤维	100mg
		蜂蜜粉末	20mg
维生素C	5mg
		合计	1425mg

处方5(沙司)

将下述材料充分混合，使用时充分搅拌，在沙拉或油炸食品中使用。

(1人量的组成)

表15

实施例1的胰蛋白酶分解物	500mg
		蛋黄酱	10g
法式芥末子酱(粒マスタ一ド)	3g
		蜂蜜	2g
芝麻粉(すりゴマ)	2g
		合计	18g

Claims (30)

1.一种具有血管紧张素转化酶抑制作用的蛋白分解物，通过用胰蛋白酶处理蜂王浆材料而得到。

2.如权利要求1所述的蛋白分解物，其中蜂王浆材料是蜂王浆的醇变性蛋白质。

3.一种蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，其中，用下式

100×(相对于Gly(1摩尔)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相对于Gly(1摩尔)的蜂王浆材料的Lys(mol))

表示的以Gly为基准时的Lys的酶分解后的残存率(摩尔比)为蜂王浆材料的70％以下。

4.一种蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，其中，用下式

(相对于Lys(1摩尔)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相对于Lys(1摩尔)的蜂王浆材料的Leu(mol))

表示的以Lys为基准时的Leu的含有比例(摩尔比)为蜂王浆材料的1.3倍以上。

5.如权利要求3或4所述的蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中选择的至少一种。

6.如权利要求5所述的蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)游离酸性氨基酸、及游离碱性氨基酸。

7.如权利要求6所述的蛋白分解物，其源自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)酸性游离氨基酸(Asp，Glu)、碱性游离氨基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羟基的游离氨基酸(Thr，Ser)、游离Ala和游离Gly。

8.如权利要求3～5任何一项中所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量为35重量％以下，在40℃、2个月的加速试验条件下其实质上不变色。

9.如权利要求3～6任何一项中所述的蛋白分解物，其中，利用凝胶透过柱分析实质上未发现分子量10000以上的成分，分子量为约200～约1500的范围内具有最大的峰，具有分子量为约200～约300的尖峰。

10.如权利要求3～6任何一项中所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在约700～约6000的范围内。

11.如权利要求1～10任何一项中所述的蛋白分解物，其中，使前述蛋白分解物通过具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)时，由下式表示的相关成分含量(％)为40％以上，

·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性

粒度分布；30μm

细孔径；250

官能团；没有

适用pH范围：全区域，

·相关成分含量(％)＝A₁/A_T×100

T₁：色氨酸的保留时间

T₂：10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间

A₁：从在T₁的洗脱位置检测的峰之后到在T₂的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和

A_T：所有的峰面积的总和。

12.如权利要求11所述的蛋白分解物，其中，前述相关成分含量为58±5％。

13.如权利要求1～12任何一项所述的蛋白分解物，其中，含有以下9种肽中的至少一种：

Glu-Trp-Lys；

His-Pro-Ala-Leu；

Thr-Phe；

Ser-Pro-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Thr-Pro-Phe；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu 。

14.如权利要求1～11任何一项所述的蛋白分解物，其中，在使前述蛋白分解物通过具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，用水(级分1，2)、20％甲醇(级分3)、40％甲醇(级分4)、60％甲醇(级分5)、80％乙醇(级分6)、100％乙醇(级分7)洗脱时的级分中，含有级分3～6：

粒度分布：＞250μm(含有90％以上粒径大于250μm的粒子)

细孔径；400

官能团；没有

适用pH范围：全区域。

15.如权利要求14所述的蛋白分解物，其中，在级分3中含有

Glu-Trp-Lys；

His-Pro-Ala-Leu和

Thr-Phe

组成的组中选择的至少一种肽，在级分4中含有

Thr-Phe；

Ser-Pro-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Thr-Pro-Phe；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu

组成的组中选择的至少一种肽。

16.一种高血压的预防或治疗剂，其以权利要求1～15任何一项中所述的蛋白分解物为有效成分。

17.一种食品，其含有权利要求1～15任何一项中所述的蛋白分解物。

18.如权利要求17所述的食品，其为高血压预防用食品。

19.一种经口摄取用制剂，其含有权利要求1～15任何一项中所述的蛋白分解物。

20.一种高血压的预防或治疗剂，其中，含有从下述9种肽中选择的至少一种肽作为有效成分：

Glu-Trp-Lys；

His-Pro-Ala-Leu；

Thr-Phe；

Ser-Pro-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Thr-Pro-Phe；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu。

21.一种食品，其含有权利要求20所述的蛋白分解物。

22.如权利要求21所述的食品，其为高血压预防用食品。

23.一种经口摄取用制剂，其含有权利要求20中所述的至少一种肽。

24.如权利要求19所述的制剂，其为明确的食品和/或含有辅助物的食品形态。

25.一种血管紧张素转化酶抑制剂，其以权利要求1～15中的任何一项所述的蛋白分解物为有效成分。

26.如权利要求1～15中任何一项中所述的蛋白分解物的制造方法，其特征在于，用胰蛋白酶处理蜂王浆材料。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，用合成吸附剂处理用胰蛋白酶处理而得到的蛋白分解物，除去(1)无机盐类、和(2)酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中选择的至少一种。

28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，将用胰蛋白酶处理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去无机盐和水溶性氨基酸，然后用含水醇洗脱。

29.如权利要求28所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性：

粒度分布：＞250μm(含有90％以上粒径大于250μm的粒子)

细孔径；400

官能团；没有

适用pH范围：全区域。

30.一种新型肽，含有以下5种肽中的任何一种：

His-Pro-Ala-Leu；

Asn-Leu-Tyr；

Leu-Ser-Tyr；

Tyr-Ser-Pro-Leu；

Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr。

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