CN1229031C - 改良的具有生物活性的乳清蛋白水解物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从WPI底物中制备一种具有改良的风味、功能性和ACE-I抑制特性的乳清蛋白水解物的方法。

Description

改良的具有生物活性的乳清蛋白水解物
                    技术领域
本发明涉及一种用于制备改良的水解的乳清蛋白产品的方法，所述产品基本上没有苦味并含有生物活性肽。该方法的产品具有高的消化性和好的感观特性。所述产品具有温和的口味而没有滑腻的或肉汤样的风味。所述改良的水解的乳清蛋白产品是用于添加进功能性食品中的生物活性肽的有用来源。
                    技术背景
大量的食品成分和食品产生于蛋白原料的水解，所述蛋白原料如乳蛋白、酪蛋白和乳清蛋白。
水解的蛋白的食品在卫生保健领域具有非水解的蛋白的食品所没有的优点。例如，酶性水解的蛋白更少引起过敏是熟知的。它们也比全蛋白更快被消化和吸收。含有水解的蛋白的食品在例如患有消化性疾病的住院病人的营养治疗上也是有用的。
已知乳清蛋白和酪蛋白经水解后释放出生物活性肽，它能呈现出许多生理学效应(Aubois等，1991；欧洲专利4745506)。大量的文章描述了这类生物活性肽，例如，具有抗高血压特性的ACE抑制肽已经通过酶学处理β-乳球蛋白和乳清蛋白浓聚物而被释放(Mullally等，1997)。在酸奶和αs与β酪蛋白水解物中也发现ACE抑制肽(日本专利4282400；Nakamura等1994，Yamamoto 1997)。
欧洲专利4745506揭示乳清中一种乳蛋白转铁蛋白的水解可释放出lactoferricin，它能做为一种抗微生物制剂，对于治疗人和动物的痢疾，脚癣，眼部感染，乳腺炎等是有用的。
然而，大多数食物蛋白的水解物，尤其是含乳清和酪蛋白的水解物的产品，已知会产生苦味。这引起口味问题，尤其是当试图在经口摄取的产品中掺和有做为一种生物活性肽的来源的乳蛋白的水解物时。
在蛋白水解领域，通常采用两种方法之一或两者来控制或消除蛋白水解物的苦味以提高产品的口感。
蛋白底物的广泛水解已知能减少乳蛋白的水解物的苦味(欧洲专利065663；欧洲专利0117047；美国专利3970520)。较少苦味的产品可以通过这个方法相当简单和便宜地生产。然而，广泛的水解减少了所有的肽的链的长度，包括重要的生物活性肽。蛋白底物的广泛水解破坏了重要的肽的功能和生物活性。除了经常出现滑腻的和肉汤样的风味外，结果是最终产品的口味与蛋白底物的原始的温和风味比较仍是差的。最后的缺点是对于一些底物而言，苦味仅被部分消除(Roy1992和1997)。
第二个通常的控制蛋白水解物的苦味的方法是利用去苦味酶，尤其是那些来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的酶。
蛋白水解物的“苦味”产生被认为是归结于大的疏水性“苦味”肽的出现。去苦味酶选择性地水解出现在蛋白水解物中的苦味肽。本领域人员能通过正确地选择去苦味酶和处理条件有效地去除乳蛋白的口味而留下完整的特殊的重要的生物活性肽。然而，使用去苦味酶使得该方法更昂贵，且不易成功获得对一些生物活性肽的保护。进一步的缺点是去苦味酶处理倾向于将游离氨基酸释放到最终产物中，其结果是，水解物出现了令人不悦的肉汤样或滑腻的风味(Roy 1992和1997)。
去除蛋白水解物苦味的不同方法造成附加的操作步骤和增加了终产物生产的费用。另外，终产物也过多地含有游离的氨基酸。
如果能开发出一种水解蛋白的方法，其能释放重要的生物活性肽并限制苦味肽与游离氨基酸的形成，并因此使得乳蛋白底物的原始温和风味可以保留，这将是最优的。
一些生物活性肽——尤其是抗高血压肽——在蛋白水解中是相当稳定的，并能在乳蛋白底物水解过程中被早期释放，如图1中描述的。
乳蛋白的水解物的苦味能通过添加糖或通过水解已经添加在乳蛋白底物中的天然糖，如乳糖来改善(Bernal和Jelen，1989)。例如当酸乳清和乳酪乳清通过半乳糖苷酶和乳糖酶水解乳糖使之变甜后，它们可以变得更为可口(FR 2309154；美国专利4358464；曰本专利8056568)。
为了获得口味更佳的包含生物活性肽的水解的蛋白产品，需要对水解进行精确的控制来阻止苦味的发生。
终止水解的通常方法是通过酶的失活，通常通过在高温下的热失活，典型的为＞90-100℃并持续一段时间。然而，这个方法不能被用于终止乳清蛋白的水解，因为任何仍残留在混合物中的完整的未水解的乳清蛋白将变性和沉淀，使得终产物的可溶性下降且不利于用作食品成分。
WO 99/65326克服了这个问题，它公开了一种温和地水解甜乳清或甜乳清蛋白浓聚物(WPC)以产生具有一个或更多的以下特点的包含生物活性肽的水解物的方法：
抗高血压ACE-I活性；
双相的生长促进活性；
无胶的，无苦的风味；
令人愉悦的轻度甜味；
良好的口感特性。
本发明使用的含乳清蛋白底物不同于WO 99/65326，尽管使用了相似的水解方法。令人惊讶的是，使用所述的不同的底物所产生的水解物显示出上面提及的乳清水解物的诸个特性有了戏剧性的提高，尤其是在产物的抗高血压的ACE-I活性、口味和功能性方面。
本发明广泛涉及对一种含有乳清蛋白的不同的底物进行水解的方法以及通过该方法所产生的新的水解物。
                    发明概述
相应的本发明可以被广泛的认为包括用于制备一种改良的含生物活性肽的乳清蛋白水解物的方法，其包含用具有以下特征的一种或更多酶水解乳清蛋白分离物(WPI)：
i)所述的酶是热不稳定(heat labile)的蛋白酶；
ii)在大约30℃和65℃之间的温度进行水解，当所述酶是中性蛋白酶时，pH为大约3.5到大约9.0，当所述酶是酸性蛋白酶时，pH为大约2.0到大约6.0，而当所述酶是碱性蛋白酶时，pH为大约5.0到大约10.0；
iii)当水解度达到不大于约10％时，终止水解；
iv)通过灭活所述一种或更多种酶来终止水解；并且
v)所述步骤iv)的条件要足够温和以避免所述水解物中的肽或残余蛋白的明显变性；
其中本方法生产的产物是高度可溶的。
WPI指的是通过本领域已知的方法生产的乳清蛋白分离物。优选地WPI是通过离子交换的方法从乳清蛋白浓聚物中生产的，如奶酪、酸，或乳酸乳清蛋白浓聚物，这是本领域人员应当懂得的。
热不稳定指的是所述的酶易于在相对温和的温度中发生不可逆性失活，这是本领域人员应当懂得的。
优选地，所述的酶选自蛋白酶P6、蛋白酶A、蛋白酶M、肽酶、Neutrase、Validase、AFP 2000、和其他热不稳定蛋白酶。
酶水解步骤可以在适合于所用的特殊的酶的条件下进行，这是本领域人员应当了解的。
乳清蛋白分离物(WPI)可以在浓度约5-35％固体物质的范围内被水解并且酶或酶混合物可以被添加使得酶与底物比在约0.01％和约3％w/w总固体物质之间，优选地在约0.01％和约1.0％w/w总固体物质之间。
用酸性蛋白酶处理的WPI可以在约2.5和约6.0之间的pH下被水解，优选地pH在约3.0和约5.0之间。
用中性蛋白酶处理的WPI可以在约3.5和约9.0之间的pH下被水解，优选地pH在约6.0和约8.0之间。
用碱性蛋白酶处理的WPI可以在约5.0和约10.0之间的pH范围下被水解，优选地pH在约6.0和约8.0之间。
蛋白水解可以在温度范围在约30-65℃之间进行，优选地在约50-60℃。
在一个实施方案中，用于选择性地水解WPI的一种或更多的酶在所述水解步骤ii)中可以被固定在一个惰性(inert)支持物上，其中所述惰性支持物是Roehm Eupergit，角叉藻聚糖颗粒，脱乙酰壳多糖颗粒或其他任何合适的惰性支持材料。这个酶系统可以被用在一个搅拌箱或固定的反应床或在膜或中空的纤维反应器来进行水解反应。
水解使用的酶可以在水解反应之前被交叉连接于所述的惰性支持物。
本发明的水解物被认为是“温和的(mild)”水解物，因此其水解度，也就是酶反应分解的肽链的百分比小于10％。因此，尽管水解物可以仍然包含可能被轻度变性的大的肽链，但最终的水解物产物是高度可溶的。
WPI底物的水解度是优选地从约3％到约10％，最优选地是在水解终止之前从约3％到5％。
水解通过酶失活步骤iv)被终止，优选地，酶失活包含热失活。
热失活可以包含将所述水解物加热到约100℃的温度约10秒。
当水解在低于65℃的温度下进行时，热失活步骤在约65℃到70℃进行约10秒到约15分钟。
当水解在低于60℃的温度下进行时，热失活步骤在约60℃到65℃进行约10秒到约30分钟。
或者，酶失活步骤iv)包含调整所述含乳清蛋白的底物的pH值以达到使所述蛋白酶是没有活性的pH值。
依照一种选择，依赖于使用的酶，酶或酶的混合物也可以被蒸发或干燥的方法失活。
依照另一种选择，酶或酶混合物有或没有先前的pH值改变也可以被失活。
或者，可通过简单地将酶从反应混合物中去除而使之失活。例如，当一个或更多用于选择性水解WPI的酶被固定在一惰性支持物上，例如在水解反应之前通过交叉相连于所述惰性支持物，它们随后可以通过膜过滤从水解反应中分离以达到失活。
或者，一旦水解完成后，酶可以通过使用一种具有标定分子量截断值在约10-500kDa的超滤膜从反应混合物中分离，优选地约10-200kDa。
在优选的实施方案中，通过首先改变反应混合物的pH值以达到酶是无反应或低反应的pH值，使得一种或更多乳清蛋白水解酶失活，和/或用一个热交换器将反应混合物加热到比较温和的温度来失活酶而不影响底物中的乳清蛋白，以终止水解。失活酶的合适的温度范围是在大约55-70℃，优选地大约65℃。
水解和以任选的方式将酶失活或去除后，水解物被任选地在盐和水能从水解物中去除的条件下进行反向渗透。包括乳清蛋白，多肽和生物活性肽的纯化的去盐的水解物然后被回收。
任选地，包含生物活性肽片段的水解的WPI能被约5-200kDa通过孔径的UF膜纯化，优选地使用10-50kDa通过孔径。
生物活性肽，和其他的肽在透过物(permeate)中被回收。
根据另一种选择，离子交换或疏水吸附或疏水作用层析法或这些方法的组合可以被用于从水解物中以富集的形式回收水解的生物活性片段。
在另一个实施方案中，本发明在于一种乳清蛋白水解物，其含有选自SAP(SEQ ID NO：1)、MKG(SEQ ID NO：2)、ALPMH(SEQ IDNO：3)、LIVTQ(SEQ ID NO：4)、VSLPEW(SEQ ID NO：5)、INYWL(SEQ ID NO：6)、LKPTPEGDLEIL(SEQ ID NO：7)和LKGYGGVSLPEW(SEQ ID NO：8)的一种或更多的生物活性肽。
优选地，所述乳清蛋白水解物含有至少一种选自LIVTQ(SEQ IDNO：4)、MKG(SEQ ID NO：2)和ALPMH(SEQ ID NO：3)生物活性肽，和至少一种选自SAP(SEQ ID NO：1)、VSLPEW(SEQ ID NO：5)、INYWL(SEQ ID NO：6)、LKPTPEGDLEIL(SEQ ID NO：7)和LKGYGGVSLPEW(SEQ ID NO：8)的生物活性肽。
进一步地，本发明提供了一种药物组合物，其包含一种或多种本发明方法生产的生物活性肽和一种药用可接受的载体一起。优选地，所述药物组合物至少包含生物活性肽MKG(SEQ ID NO：2)和一种药用可接受的载体。
更进一步地，本发明提供了一种治疗和防治哺乳动物的高血压的方法，其包含给有需要的哺乳动物施用一有效剂量的根据本发明的方法水解WPI而产生的生物活性肽。
更进一步地，本发明提供了用本发明方法生产的一种或多种生物活性肽在生产一种用来治疗或预防需要该治疗的患者的高血压的药物中的用途。优选地所述生物活性肽是MKG(SEQ ID NO：2)。
本发明进一步提供了一种用本发明方法制备的、无苦味的、高度可溶的WPI水解物产品，其中WPI水解度是约3％到约10％。所述产品中乳清蛋白的平均颗粒大小可能是小于约30微米，优选地小于约3微米。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种含有本发明的WPI水解物的食品产物。
本发明进一步包含在对象中降低收缩压的方法，其中所述方法包含给需要的对象施用有效剂量的含有本发明的所述水解物的新的WPI水解物或食品产物。
本发明进一步包含一种或多种选自SAP(SEQ ID NO：1)、MKG(SEQ ID NO：2)、ALPMH(SEQ ID NO：3)、LIVTQ(SEQ ID NO：4)、VSLPEW(SEQ ID NO：5)、INYWL(SEQ ID NO：6)、LKPTPEGDLEIL(SEQ ID NO：7)和LKGYGGVSLPEW(SEQ ID NO：8)的肽。
本发明进一步包含至少一种选自LIVTQ(SEQ ID NO：4)、MKG(SEQ ID NO：2)和ALPMH(SEQ ID NO：3)的生物活性肽，以及至少一种选自SAP(SEQ ID NO：1)、VSLPEW(SEQ ID NO：5)、INYWL(SEQ ID NO：6)、LKPTPEGDLEIL(SEQ ID NO：7)和LKGYGGVSLPEW(SEQ ID NO：8)的生物活性肽。
本发明的水解的WPI产物有一个或多个下面的特点：
·抗高血压的ACE-I活性
·益生(probiotic)促生长活性；
·无胶的，无苦的风味
·令人愉悦的到轻微的甜味
·良好的口感特性
·高度可溶性
·非常好的泡沫特性
·非常好的凝胶特性
·改善的热稳定性
比较于WO 99/65326阐述的将甜乳清蛋白浓集物(WPC)做为含有乳清蛋白的底物，应用温和的水解技术于乳清蛋白分离物(WPI)底物，发现终产物具有如下一些显著的改善：
·可溶性
尽管WPI在终止蛋白酶反应的加热条件下仍有轻微变性，但它不产生任何不可溶的物质。溶解性仍在96％左右，这高于相应的WPC水解物。
·热稳定性
水解的WPI比水解的WPC具有更显著的热稳定性。@5％TS中120℃加热10分钟后，溶解性仍在95％。
·外观
正确的选择反应条件能决定是否溶液中的最终的水解物看起来是白色或透明的。实施例1(见下面)生产出一不透明的产物，而实施例2和3(见下面)的产物在中性pH下的溶液中是透明的。水解WPC在外观上基本上都是白色的。
·发沫能力和稳定性
水解的WPI的发沫能力是非水解的WPI的大约2倍，而发沫稳定性是其大约4倍。这使得产品十分适合于做为酸奶和甜点制作的成分。水解的WPI也表现出了比WPC水解物更高的发沫能力和稳定性。
·胶凝强度(gel strength)
温和水解的WPI表现出了比非水解的WPI显著增加的胶强度。这使得产品十分适合于做为酸奶和甜点制作的成分。水解的WPI也表现出了比WPC水解物更高的胶强度。
·风味
水解的WPI的苦味比温和水解的WPC产物显著减少。苦味没有表现出随水解时间而增加的趋势，这使得本方法比WPC水解更容易控制。
·体外的ACE-I活性
水解的WPI的体外ACE-I活性为温和水解的WPC的大约2倍，如果反应条件和添加的酶相当。
·加快益生菌发酵
添加比例为1.5％时，水解的WPI使益生菌酸奶发酵时间率加速约40％。
本发明在于上面所描述的内容，并考虑到了对下述实施例的解释。
                        附图简述
本发明将借助于附带的附图进行描述：
图1纵坐标的苦味和生物活性对横坐标的水解度的曲线。在水解反应生成苦味肽之前获得根据本发明的含生物活性肽和具有可接受风味的产品的“时机窗(opportunity window)”是在线x1和x2之间。
图2显示了按6.0gWPC水解物/kg体重喂养对成熟原发性高血压大鼠(SHR)的收缩期血压的急性的短期效应。
图3显示了3.6gWPI水解物/kg体重喂养对成熟的原发性高血压大鼠(SHR)的收缩期血压的急性的短期效应。
图4显示了165mg肽MKG(SEQ ID NO：2)/kg体重喂养对成熟原发性高血压大鼠(SHR)的收缩期血压的急性的短期效应。
                     发明的详细描述
如上讨论的，本发明提供了一种用于生产含生物活性肽的水解的WPI产品的方法，水解在高度可控的条件下进行以避免水解过程中出现不希望的口味(如苦味，滑腻和肉汤样)。水解被终止在“时机窗”内，也就是在真正的苦味出现之前——如图1描述的——以提供具有良好的感观特性和最大生物活性肽的水解物。在图1中水解物被量化表示在x轴上。时机窗在x1和x2之间，其依赖于所使用的酶而不同。探求的理想条件是在可接受水平的苦味下的最大生物活性。
在本发明方法的特别优选的实施方案中，水解WPI的酶是热不稳定的并选自蛋白酶P6、蛋白酶A、蛋白酶M、肽酶、Neutrase、Validase和AFP 2000(都如这里所定义的)，并且通过在高温下短时间处理(大约为85-100℃下1-10秒)来终止WPI的水解。本申请人已经惊奇地发现所述酶(1)能产生具有良好的生物活性肽的水平的乳清蛋白水解物，和(2)能通过短时间，高温处理失活，这仅引起水解物中乳清蛋白的部分失活，并令人惊奇地提高了乳清蛋白的感观特性，提供了最终外观上为白色或透明的产品。
本发明现在通过下面的使用ALACENTM895或ALACENTM894(乳清蛋白分离物，从NZDB商业性获得)的实施例来举例说明，它的产品特性被附加在附录I上。
实施例1
试验性生产WPI温和水解物
蛋白含量大于90％w/w的阳离子离子交换技术生产的乳清蛋白分离物(ALACENTM895)按20％固体物质在水中(50℃)被复原(reconstitute)。复原的ALACENTM 895在50℃下被转移到150L的箱中。将水(50℃)加到箱中使得最终的固体物质体积为4％。搅拌溶液，加入Neutrase(E：S 0.9％)。
加入酶2小时后，首次水解物被泵入通过UHT设备。使用直接蒸汽注射加热水解物到88℃使酶失活，水解物在这个温度下保持1.5秒。水解物被瞬时冷却，通过壳和管热交换器冷却到周围温度。
水解物随后被脱水和干燥。
按实施例1的方法制备的水解物具有下面的特点：
溶解度：95％
热稳定性：120℃10分钟@5％TS溶解度95％
体外ACE-I活性：289mg/L IC50
发沫能力：比非水解的WPI显著增加
风味：比以WPC为基础的温和水解物显著提高
外观：不透明的白色，颗粒大小-0.1μm
用本领域人员熟知的标准方法测定WPI水解物的溶解度，热稳定性，发沫能力和外观。离心3000g十分钟(室温下)测定5％总固体物质(TS)溶液的溶解度。通过加热到120℃10分钟，快速冷却，然后700g离心10分钟测定5％TS溶液的热稳定性。测定上清中和原始溶液所含的TS。溶解度定义为TS(上清)/TS(原始溶液)。用Hobart混合器(型号N50G，Hobart公司)搅拌来测定pH值7.0下10％TS溶液的发沫能力。用起泡百分比(percentage overrun)比较样品，如本领域人员所理解的。肉眼观察确定5％TS的外观，用MalvernMasterSizer(Model MSEOOSM，Malvern Instruments Ltd)测定颗粒大小。
根据D W Cushman和H S Cheung(1971)的方法，用FAPGG(Product 305-10 ex Sigma Chemical Corporation，St Louis，MO，USA)做为底物来测定干的产品的ACE-I活性(体外)。ACE-I活性用减少ACE-I酶活性到50％所需的物质的量来表示。
借助于水解物的苦味和收敛性主观地评价风味。特别的，由正式的感觉调查小组(formal sensory panel)评价感觉项目。用多维描记仪在24℃下测定5％w/w样品。样品被评估和记分在150mm的指定线上(缺乏(0)到强烈(150))。
实施例2
按实施例1上面的描述重复该水解反应(10％总固体物质，E：S0.9％，150L)。失活后，水解物立即被脱水和干燥。
这个方法制备的水解物具有下面的特点，其由所述实施例1的阐述进行测定：
溶解度：97％
热稳定性：120℃10分钟@TS溶解度96％
体外ACE-I活性：503mg/L IC50
发沫能力：比非水解的WPI显著增加
成胶性：比非水解的WPI显著增加
风味：比以WPC为基础的温和水解物显著提高
外观：透明的微黄色
实施例3
按上面的描述重复实施例1的水解反应(4％总固体物质，E：S0.9％，150L)。加入酶4个小时后，用和实施例1相同的条件将首次水解物泵入通过UHT设备。
这个方法制备的水解物具有下面的特点，其由所述实施例1的阐述进行测定：
体外ACE-I活性：230mg/L IC50
发沫能力：比非水解的WPI显著增加
成胶性：比非水解的WPI显著增加
风味：比以WPC为基础的温和水解物显著提高
外观：透明的微黄色
实施例4
2％的ALACANTM894(微滤过的WPI)溶液在用3,000道尔顿分子量的透过膜(CDUF001LB，Millipore Corporation，Bedford)10℃下进行超滤过之前将pH值调整到3。滞留物的pH值在用先前使用的相同的膜10℃超过滤之前被调整到7.0并稀释到2％总固体物质。滞留物的总固体物质在用E：S 0.9％ w/w Neutrase(Novo Nordisk，Denmark)50℃水解之前被调整到5.0％。4小时后，样品在88℃下3秒失活，随后被冻干。ACE-I的活性被确定为227mg/L。
实施例5
来自实施例3的温和水解的WPI当以1.5％的添加率被加到半脂乳(half fat milk)时，显示出促进益生菌生长。乳被热处理@90℃10分钟。在冷却到37℃后，奶被0.1％S.thermophilus和2％L.rhamnosusHN001(DR20TM)接种。对照的发酵时间是第20个小时到达要求的4.4的pH值。相反的，添加的WPI水解物将该发酵时间减少到13小时。
实施例6
确定WPI水解物中的ACE-抑制物肽
本实施例的目的是分离和确定出现在WPI水解物中的ACE-抑制物肽。
方法学：
·ACE-I肽分离的初材料是从实施例1的原始水解物获得的UFpermeate(10kDa)；
·用逆相HPLC分离出现在水解物中的肽
·按实施例1所述分别检测纯化的肽的ACE-抑制物活性
·结合质谱测量法和N-末端序列分析来确定每个活性肽的氨基酸序列
·通过与乳蛋白的已知序列比较序列来确定活性肽的来源肽，它们的来源，活性和已知的相似性被呈列在下面的表1中：
表1：从WPI水解物中分离的ACE-抑制物肽
  肽   ACE-抑制物序列   来源  1活性(IC50)
  1   SAP(SEQ ID NO：1)   β-LG(36-38)   22
  2  2MKG(SEQ ID NO：2)   β-LG(7-9)   23
  3  2ALPMH(SEQ ID NO：3)   β-LG(142-146)   23
  4  2LIVTQ(SEQ ID NO：4)   β-LG(1-5)   19
  5   VSLPEW(SEQ ID NO：5)   α-LA(21-26)   8
  6  3INYWL(SEQ ID NO：6)3LKPTPEGDLEIL(SEQ IDNO：7)   α-LA(101-105)β-LG(46-57) 11
  7   LKGYGGVSLPEW(SEQID NO：8)   α-LA(15-26)   7
1mg/L
2也发现在WO 99/65326的WPC水解物中
3样品中出现两种肽；一个或两者可能是活性肽。来自WPI水解物的三种活性肽以前在WPC水解物中被确定，也就是β-LG(7-9)、β-LG(142-146)和β-LG(1-5)。
实施例7
温和水解的WPI与温和水解的WPC和非水解的WPI的感觉比较
WPI按上面实施例1中所述被水解
WPC按WO 99/65326的实施例1所述被水解。(ALACENTM392、10％、水解2小时后失活)。
ALATALTM819是New Zealand Dairy Board的商品化产品，产品说明书的摘要附在附录I。
味觉调查小组评价产品的苦味和收敛性，记分在150mm的指定线上(缺失(0)到强烈(150))。
利用如Frister等描述的修饰的O-苯二醛(MOPA)方法确定水解度。
表2用formal sensory panel评估WPI和水解物样品的平均积分(/150)，标准WPI和水解的乳清蛋白的水解度和ACE-I活性
  测定产品     感觉评估   水解度(％)   ACE-I活性(mg/L)
  苦味    收敛性
  ALACENTM895(WPI)   36.2    24   0   ～2000
  温和水解的WPC   78      67.1   4.5   440
  温和水解的WPI   55.1    41.6   4.3   230
  ALATALTM819   93.1    53.3   10   -
温和水解的WPI和温和水解的WPC都是如预期的比非水解的WPI更苦和收敛。然而，这些产品比更强水解的ALATALTM819(NewZealand Dairy Board的产品，NZ)具有显著减少的苦味和收敛性。
温和水解的WPI产品比较于温和水解的WPC(WO 99/65326描述的)提供了更可接受的风味的产品，并具有显著更高的ACE-I活性。结果也显示温和水解的WPI比相当的WPC产品具有显著少的苦味和收敛性，尽管两者的水解度是相似的。与具有更可接受的风味一样，温和水解的WPI的ACE-I活性几乎是温和水解的WPC的两倍。
尽管WPC的进一步水解可能造成ACE-I活性的增加，但比较于温和水解的WPI可以观察到风味的显著下降，其对风味的不良影响归结于苦味和收敛性的增加。
实施例8
血压测定
用尾袖带监测器和为测定小动物血压专门设计的设备[IITC Inc，239 Victory Blvd.，Woodland Hills，CA 91367，USA]测定血压。每个点是在近5-10分钟内取得的3-5个读数的平均值。
动物株
原发性高血压大鼠(SHR)来源于西澳大利亚的动物资源中心。
样品剂量
除非另有说明，试验材料按每公斤体重基准给予每只大鼠。给予每个动物的单个剂量被结合到有风味的胶冻中，其容易被动物消化。
用于评价短时间的血压效应的三个样品是温和水解的乳清蛋白富集物(图2)，温和水解的乳清蛋白分离物(见图3)和表1中合成的肽，即MKG(SEQ ID NO：2)(见图4)。WPC根据WO 99/65326中的实施例1中所述的方法学来制备。
通过用制剂处理SHR，然后研究在随后的小时内它们的血压反应来确定制剂的急性或短时间效应。此研究可发现是否一个制剂降低了已经增高的血压。
结果
与对照比较，用3.6g/kg体重的WPI水解物短期饲养SHRs(图3)造成血压的显著下降(p＝0.0378)。这个血压的下降类似于用6.0g/kg体重的WPC水解物喂养大鼠获得的血压下降(图2)。因此，WPI水解物表现出比相当的WPC水解物更强的活性以致低至近50％的WPI水解物在成熟SHR上获得相似的血压(收缩压)下降。
用165mg/kg体重的肽MKG(图4)短期饲养SHRs显示出比对照组大鼠(p＝0.0021，4小时后；p＜0.0001，8小时后)以及温和WPI水解物组和温和WPC水解物组更大的血压下降。
结论
根据本发明的温和水解WPI的方法提供了有用的WPI水解物，其表现出比WO 99/65326的WPC水解物显著的功能改善。特别地，这个WPI水解物包含更多活性肽，并且在体外获得与WPC水解物一样程度的血压下降需要更少的WPI水解物。WPI能被水解更长的时间而不丢失可接受的风味特性并同时保持增加的ACE-I活性。因此，总体而言，本发明的方法提供了一种比WO 99/65326的乳清蛋白水解物具有在风味、ACE-I活性和功能性上改善的生物活性的乳清蛋白水解物。
                      工业应用
本发明的方法用于生产新的乳清蛋白水解物，其具有令人惊讶的有用的特性并能被用作食品或抗血压的药物。
应当理解，本发明并不仅局限于所述所实施例，如本领域人员所易于想到的多种改动，可能并不脱离所附权利要求的保护范围。
参考文献
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附录I
ALACENTM895
乳清蛋白水解物
P613.04.0898
ALACEN 895是一种可溶的，93％的乳蛋白，含有能提供营养用处和提供增强功能的与风味的特性的少量的脂肪，乳糖和胆固醇。
功能上，ALACEN 895是一种特殊化的蛋白，具有酸/热稳定性，溶液的清亮性和气泡稳定性。
产品特性
●极好的搅拌(whipping)能力
●清新的风味
●低乳糖
●低脂肪和低胆固醇成分
●酸/热稳定性
●在大的pH值范围内可溶
●极好的营养特性
建议用途
ALACEN 895对于是风味敏感的和要求营养蛋白产品的应用是特别有用的。
●高蛋白饮料
●低脂肪和低乳糖食品
●Meringue和whipped toppings
●蛋白加强的营养食品
标准构成
能量1616KJ/100g
蛋白(Nx6.38)93.1％
干重        96.6％
脂肪        0.6％
含水量      3.6％
灰分(ash)   1.6％
乳糖(by difference)  1.1％
标准的化学分析
pH值(5％在20℃)  6.8
物理特性
颜色      乳白色
风味      清新
沉淀(50g)  A盘
标准的细菌学
需氧平板计数(cfn/g)＜30,000
杆菌(1g)  阴性
酵母菌和霉菌(cfn/g)＜10
沙门菌(750g)  阴性
标准的矿物质构成
钠  484mg/100g
钾    80.1mg/100g]
钙    106mg/100g
磷    52.5mg/100g
包装
标准的包装是多层口袋，结合有一个防水层和装有产品的内在的塑料内衬。不需要订书订或金属的扣订。
净重    25.0kg
毛重    25.5kg
储存和处置
ALACEN 895应当被存放在一个冷的，干燥通风的地方。温度低于25℃，相对湿度小于65％和无气味的环境一直持续到储存期。包装不应该和墙或地面接触。储存物应当被轮替使用，优选地在6个月的转运内。
质量保证
在生产中执行了严格的质量控制操作。生产环境也被进行规律的监测和控制。
终产品被抽样和用国际认同的方法测定其化学，感官和微生物参数。
在储存和运输期间，小心谨慎以保证产品质量的保持。每个包装被标识以备追访。
ALACEN 894
乳清蛋白分离物
P422.01.2000
ALACEN 894是一种可溶的，＞90％db的乳清蛋白分离物(WPI)产品，通过超滤(UF)和互流微滤(MF)生产。微滤天然地分离未变性的蛋白，提供了一具有低脂肪和高蛋白的MF WPI产品。
ALACEN 894具有极好的的营养品质，真正蛋白消化率99.7％，PD-CAAS＝1％，和PER＝3.0。这些性质使得ALACEN 894对于要求极好的营养特点和或溶解性的蛋白加强的食品特别的有用。
产品特点
●极好的营养品质
●清新的风味
●在大的pH值范围内可溶
●低脂肪&低胆固醇
●低乳糖
建议用途
●蛋白加强的营养食品
●Meringue & Whipped Toppings
●低脂肪&低乳糖食品
标准构成分析
蛋白(Nx6.38)89.9％
干重(Nx6.38)94.1％
含水量      4.5％
脂肪         0.2％
灰分(ash)    3.2％
乳糖(by difference)  0.6％
标准的化学分析
pH值  6.9
物理特性
颜色     乳白色
风味     清新
干颗粒(50g)  A盘
标准的细菌学
需氧平板计数(cfn/g)＜10,000
杆菌(/g)  未检测到
大肠杆菌(/g)  未检测到
酵母菌和霉菌(cfn/g)＜10
凝固酶阳性葡萄球菌(/g)未检测到
沙门菌(/750g)  无
李斯特杆菌(/50g) 无
标准的矿物质构成
钠    280mg/100g
钾    901mg/100g
钙    310mg/100g
磷    199mg/100g
包装
标准的包装袋是一多层的纸袋，它包含产品在一塑胶的内袋中，不使用订书订或金属的扣订。
净重    20.0kg
毛重    20.4kg
储存和处置
ALACEN 895应当被存放在一个冷的，干燥通风的地方。温度低于25℃，相对湿度小于65％和无气味的环境一直持续到储存期。
包装不应该和墙或地面接触。储存物应当被轮替使用，优选地在生产的24月内。
质量保证
在生产中执行了严格的质量控制操作。生产环境也被进行规律的监测和控制。
终产品被抽样和用国际认同的方法测定其化学，感官和微生物参数。
在储存和运输期间，小心谨慎以保证产品质量的保持。每个包装被标识以备追访。
ALATAL819
乳清蛋白水解物
WPH 926是一高质量的水解物，由乳清蛋白的控制的酶的处理生产，它提供氨基酸，肽和多肽。乳清蛋白原材料是高营养的。因为酶处理是温和的和小心监控的过程，必需氨基酸仍是完整的和保持了初始蛋白的高营养品质。WPH 926被设计成提供了抗原性的10-4倍的减少，然而仍保存有清新的风味。
标准的构成分析
蛋白(Nx6.38)，干重分别是84.5％和80.9％
灰分(ash)％   4.7
含水量％      4.3
脂肪％        4.0
乳糖％        3.2
抗生素(IU/g)＜0.01
标准矿物质分析
钠％  0.6
钙％  0.6
钾％  1.0
磷％  0.3
镁％  0.02
氯％  0.3
建议应用
●吸收障碍的肠内营养产品
●无乳糖的营养产品
产品特性
●极好的营养品质
●减少的过敏性
●很好的溶解性
●好的热不稳定性
●差的风味方面
标准的分子分析
氨基氮％ 1.7
总氮％   13.4
AN/TN％  23
推荐标识
乳清蛋白水解物
标准微生物学分析
标准平板计数(cfu/g)＜1,000
杆菌(1g)  阴性
酵母菌和霉菌(cfu/g)＜10
凝固酶阳性葡萄球菌(1g)  阴性
沙门菌(750g)  阴性
标准物理特性
颜色    乳白色
感觉    清新，微苦
体积密度(包裹的，g/ml)  0.50
pH(5％在20℃)  7.2
溶解性％       100
包装
热封，多层的牛皮纸袋
聚乙烯袋内在单独分装，无订书订或金属的扣订
净重    50.0磅(22.7kg)
毛重    50.8磅(23.1kg)
酶
在WPH 926生产中使用的所有的酶都是食品级的和被美国食品和药品监督管理局所认证为普遍认证为安全的(GRAS)。
储存
乳清蛋白水解物最好在消费者收到后的1年内使用，当储存在合适的条件下。因为水解物是吸湿性的和能吸收风味，因此建议产品储存在温度低于25℃，相对湿度小于65％和无气味的环境中
                               序列表
<110>纽西兰乳品局
<120>改良的具有生物活性的乳清蛋白水解物
<130>P425133 CJE
<140>
<141>
<150>NZ 506866
<151>2000-09-11
<160>8
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>3
<212>PRT
<213>肽
<400>1
Ser Ala Pro
  1
<210>2
<211>3
<212>PRT
<213>肽
<400>2
Met Lys Gly
  1
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>肽
<400>3
Ala Leu Pro Met His
  1               5
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>肽
<400>4
Leu Ile Val Thr Gln
  1               5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>肽
<400>5
Val Ser Leu Pro Glu Trp
  1               5
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>肽
<400>6
Ile Asn Tyr Trp Leu
  1               5
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>肽
<400>7
Leu Lys Pro Thr pro Glu Gly Asp Leu Glu Ile Leu
  1               5                  10
<210>8
<211>12
<212>PRT
<213>肽
<400>8
Leu Lys Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp
  1               5                  10

Claims (32)

1.一种用于制备改良的含生物活性肽的乳清蛋白水解物的方法，所述方法包含用一种或多种酶水解乳清蛋白分离物，所述方法的特征在于：
i)所述的酶是热不稳定的蛋白酶；
ii)在30℃和65℃之间的温度下进行水解，当所述酶是中性蛋白酶时，水解时pH为3.5到9.0，当所述酶是酸性蛋白酶，水解时pH为2.0到6.0，而当所述酶是碱性蛋白酶，水解时pH为5.0到10.0；
iii)当水解度达到不大于10％时，终止水解；并且
iv)通过在避免所述水解物中的肽或残余蛋白发生明显变性的温和条件下灭活上述的一种或多种酶来终止水解，
其中本方法生产的产物是高度可溶的。
2.权利要求1的方法，其中所述的酶选自蛋白酶P6、蛋白酶A、蛋白酶M、肽酶、Neutrase、Validase、AFP 2000和任何其他热不稳定蛋白酶。
3.权利要求1或2的方法，其中所述酶失活的步骤iv)包含热失活。
4.权利要求3的方法，其中所述热失活包含将所述水解物加热到100℃的温度10秒。
5.权利要求3的方法，其中，当所述水解在低于65℃的温度下进行时，所述热失活步骤在65℃到70℃进行10秒到15分钟。
6.权利要求3的方法，其中，当所述水解在低于60℃的温度下进行时，所述热失活步骤在60℃到65℃进行10秒到30分钟。
7.权利要求1或2的方法，其中所述的酶失活步骤包含调整所述含乳清蛋白的底物的pH值到所述蛋白酶是没有活性的pH值。
8.权利要求7的方法，其中所述酶失活步骤包括权利要求3到6中任一项的热失活。
9.权利要求1或2的方法，其中所述酶失活步骤iv)包含用一个具有10-500kDa范围的标定分子量截断值的超滤膜超滤所述水解物。
10.权利要求9的方法，其中所述超滤膜具有10-200kDa范围的标定分子量截断值。
11.权利要求1或2的方法，其中所述的酶在所述水解步骤ii)中被固定在一惰性支持物上。
12.权利要求11的方法，其中所述惰性支持物是RoehmEupergit、角叉藻聚糖颗粒、脱乙酰壳多糖颗粒或其他任何合适的惰性支持材料。
13.权利要求1的方法，其中所述的水解度为3％到10％。
14.权利要求13的方法，其中所述的水解度为3％到5％。
15.权利要求1的方法，其中如此生产的所述乳清蛋白水解物包含一种或多种选自序列为SAP、VSLPEW、INYWL、LKPTPEGDLEIL和LKGYGGVSLPEW的生物活性肽。
16.权利要求1的方法，其中如此制备的所述乳清蛋白水解物包含至少一种选自序列为LIVTQ、MKG和ALPMH的生物活性肽，和至少一种选自序列为SAP、VSLPEW、INYWL、LKPTPEGDLEIL和LKGYGGVSLPEW的生物活性肽的组合。
17.一种药物组合物，其包含一种或多种由权利要求1到16中任一项的方法生产的生物活性肽和一种药用可接受的载体。
18.  权利要求17的药物组合物，其包含生物活性肽MKG和一种药用可接受的载体。
19.权利要求1到16中任一项的方法生产的一种或多种生物活性肽在生产用于治疗或预防需要该治疗的患者的高血压的药物中的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述生物活性肽是MKG。
21.权利要求1到16中任一项的方法制备的一种含有生物活性肽的无苦味、高度可溶的乳清蛋白分离物水解物产品。
22.权利要求21的产品，其中所述乳清蛋白分离物的水解度是3％到5％。
23.权利要求22的产品，其中所述产品中乳清蛋白的主要颗粒大小是小于30微米。
24.权利要求23的产品，其中所述主要颗粒大小是小于3微米。
25.权利要求21的产品，其在溶液中是清亮或白色的。
26.权利要求21的产品，其中所述一种或多种生物活性肽选自序列为SAP、MKG、ALPMH、LIVTQ、VSLPEW、INYWL、LKPTPEGDLEIL和LKGYGGVSLPEW的肽。
27. 权利要求21的产品，其包含至少一种选自序列为LIVTQ、MKG和ALPMH的生物活性肽，和至少一种选自序列为SAP、VSLPEW、INYWL、LKPTPEGDLEIL和LKGYGGVSLPEW的生物活性肽的组合。
28.一种含有权利要求21到27中任一项的乳清蛋白分离物水解物产品的食品产品。
29.权利要求21到27中任一项的产品在生产用于治疗或预防有该需要的患者的高血压的药物中的用途。
30.一种药物组合物，其包含权利要求21到27中任一项的产品和一种药用可接受的载体。
31.权利要求30的药物组合物，其包含选自序列为SAP、VSLPEW、INYWL、LKPTPEGDLEIL和LKGYGGVSLPEW的肽的任何一种或任何两种或多种的组合。
32.权利要求30的药物组合物，其包含任何一种选自序列为LIVTQ、MKG和ALPMH的生物活性肽和至少一种选自序列为SAP、VSLPEW、INYWL、 LKPTPEGDLEIL和LKGYGGVSLPEW的生物活性肽的组合。
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