NO326072B1

NO326072B1 - Myseprotein-hydrolysat, fremgangsmate for dets fremstilling, farmasoytisk sammensetning, matprodukt samt anvendelse.

Info

Publication number: NO326072B1
Application number: NO20031096A
Authority: NO
Inventors: Ralf-Christian Schlothauer; Linda May Schollum; Julian Robert Reid; Stephanie Adele Harvey; Alistair Carr; Rachel Lois Fanshawe
Original assignee: New Zealand Dairy Board
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2003-03-10
Publication date: 2008-09-15
Also published as: EP1317186B1; EP1317186A1; CN1229031C; HUP0302370A2; EP1317186A4; CN1474656A; DK1317186T3; HK1063132A1; NO20031096D0; ZA200301982B; CA2421714A1; NZ506866A; AU9037601A; KR20030046442A; BR0113812A; ATE494795T1; MXPA03002109A; PE20030289A1; AU2001290376B2; KR100845362B1

Description

TEKNISK FELT

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å fremstille et myseproteinhydrolysat som inneholder bioaktive peptider samt produkter fremstilt ved nevnte fremgangsmåte. Et slikt produkt er lett å fordøye og har gode organoleptiske egenskaper. Produktene har en mild smak og mangler såpeaktige eller buljongaktige smaker. De forbedrede hydrolyserte myseproteinproduktene er nyttige kilder for bioaktive peptider for inkorporering i funksjonell mat.

BAKGRUNNSFELT

En rekke matingredienser og matvarer er blitt produsert fra hydrolysen av en protein-kilde slik som melkeproteiner, kasein og myseproteiner.

Hydrolyserte proteinmatvarer kan ha fordeler over ikke-hydrolyserte proteinmatvarer på en rekke områder innen helseomsorg. For eksempel er det kjent at enzymatisk hydrolyserte proteiner er mindre allergene. De blir også hurtigere fordøyd og absorbert enn hele proteiner. Matvarer som inneholder hydrolyserte proteiner er også nyttige i næringen til sykehuspasienter for eksempel med fordøyelsessykdommer.

Hydrolyse av myseproteiner og kaseiner er kjent for å frigjøre bioaktive peptider som kan utvise en rekke fysiologiske effekter (Maubois m.fl., EP 4745506). En reke publi-kasjoner beskriver slike bioaktive peptider, f.eks. har ACE-hemmende peptider som har blodtrykksnedsettende egenskaper blitt frigjort gjennom en enzymatisk behandling av 3-laktoglobulin og myseproteinkonsentrater (Mullally m.fl., 1997). ACE-hemmende peptider er også funnet i sur melk og i hydrolysater av as- og P-kasein .(JP 4282400; Nakamura m.fl. 1994, Yamamoto 1997).

EP 4745506 viser at hydrolysen av melkeproteinet laktoferrin i myse frigjør laktoferri-sin som virker som et antimikrobielt middel som er nyttig for å behandle diaré, fotsopp, øyeninfeksjon, mastitt osv. hos mennesker og dyr.

Hydrolysen av de fleste matproteiner, spesielt hydrolysen av myse- og kaseininnehol-dende produkter er imidlertid kjent for å generere bitterhet. Dette forårsaker ganepro-blemer, spesielt når man forsøker å formulere oralt innførte produkter som inkorporerer melkeprotein-hydrolysater som en kilde for bioaktive peptider.

Innen feltet for proteinhydrolyse blir én eller begge av to tilnærmingsmåter vanligvis anvendt for å kontrollere eller fjerne bitterhet i proteinhydrolysater for å øke smaken av produktene.

Den utstrakte hydrolysen av protensubstratet er kjent for å redusere bitterheten i melkeprotein-hydrolysater (EP 065663; EP 0117047; US 3970520). Mindre bitre produkter blir produsert relativt lett og billig på denne måten. Imidlertid reduserer utstrakt hydrolyse kjedelengdene til alle peptidene, inkludert de bioaktive peptidene av interesse. Utstrakt hydrolyse av proteinsubstratet ødelegger den funksjonelle og biologiske aktiviteten av peptider av interesse. I tillegg utvikles ofte såpeaktige og buljongaktige avsma-ker, med den konsekvensen at smaken av sluttproduktet forblir dårlig sammenlignet med det originale, mildt smakende proteinsubstratet. En siste ulempe er at for noen hydrolysater blir bitterheten bare delvis fjernet (Roy 1992 og 1997).

En annen, vanlig fremgangsmåte for å kontrollere bitterheten i proteinhydrolysatet er å anvende enzymer som fjerner bitterhet, spesielt de som kommer fra Aspergillus oryzae.

"Bitterhef-dannelse i proteinhydrolyse tror man skyldes tilstedeværelsen av store, hyd-rofobe "bitre" peptider. Enzymer som fjerner bitterheten hydrolyserer selektivt bitre peptider som er til stede i proteinhydrolysatet. En fagperson - ved det skjønnsomme valget av enzymer som fjerner bitterhet og betingelsene for behandling - kan effektivt avbitre melekprotein-hydrolysater og etterlate intakt de spesielle bioaktive peptidene av interesse. Anvendelse av enzymer som fjerner bitterhet, gjør imidlertid prosessen dyrere, og beskyttelse av noen av de bioaktive peptidene oppnås ikke lett eller med suksess. En videre ulempe er at behandlingene med enzymer som fjerner bitterhet, har en tendens til å frigjøre frie aminosyrer inn i sluttproduktet og som en konsekvens, utvikler hydrolysatene ubehagelige buljongaktige eller såpeaktige smaker (Roy 1992 og 1997).

De forskjellige fremgangsmåtene for å avbitre proteinhydrolysatene resulterer i tilleggs-prosesstrinn og letter til kostnader til produksjonen av sluttproduktet. I tillegg blir sluttproduktet også brakt ut av likevekt ved dets levering av frie aminosyrer. Det vil være fordelaktig hvis en prosess for å hydrolysere proteiner kunne utvikles som frigjør bioaktive peptider av interesse og som begrenser dannelsen av bitre peptider og frie aminosyrer, og på den måten tillater at den originale, milde smaken til melkeproteinsubstra-tene blir opprettholdt.

Noen bioaktive peptider - spesielt blodtrykksnedsettende peptider - er relativt stabile under proteinhydrolysen og blir frigjort veldig tidlig under hydrolysen av melkeprotein-substratet som vist i figur 1.

De bitre smakene i melkeprotein-hydrolysatene kan forbedres ved å tilsette sukkere eller ved å hydrolysere naturlige sukkere, slik som laktose, som allerede er tilstede i melke-proteinsubstratet (Bernal og Jelen, 1989. For eksempel blir sur myse og ostemyse gjort mer velsmakende når de er blitt søtet med p-galaktosidase og laktasehydrolyse av laktose (FR 2309154; US 4358464; JP 8056568).

For å oppnå en smak som er veldig akseptabel for et hydrolysert proteinprodukt som inneholder bioaktive peptider, er det nødvendig med nøyaktig kontroll av hydrolysen for å hindre at bitterhet finner sted.

En vanlig fremgangsmåte for å avslutte hydrolysen er å deaktivere enzymene, vanligvis ved termisk deaktivering ved høye temperaturer, typisk > 90 - 100°C i en utvidet tidspe-riode. Imidlertid kan denne fremgangsmåten ikke anvendes for å stoppe hydrolysen av myseproteiner fordi ethvert intakt, ikke-hydrolysert myseprotein som er igjen i blandin-gen vil denaturere og presipitere og gjøre sluttproduktet mindre løselig og mindre akseptabelt for anvendelse som en matingrediens. Videre beskriver Mutilangi et al. en fremgangsmåte for å fremstille et varmedenaturert myseprotein produkt.

Et slikt problem ble overvunnet i WO 99/65326 som utgreier en prosess for mild hydrolyse av søt myse eller søt myseproteinkonsentrat (WPC) for å produsere hydrolysater som inneholder bioaktive peptider som har én eller flere av følgende egenskaper:

• Blodtrykksnedsettende ACE-I-aktivitet

• "bifidus" vekstfremmende aktivitet

• ikke-klebrig, ikke-bitter smak

• behagelig til svakt søt smak

• gode organoleptiske egenskaper

Den foreliggende oppfinnelsen anvender et forskjelllig myseprotein-inneholdende substrat enn det som ble anvendt i WO 99/65326 selv om en lignende hydrolyseringspro-sess blir anvendt. Overraskende så resulterer anvendelsen av dette forskjellige substratet i et hydrolysat som viser dramatiske forbedringer i de ovennevnte egenskapene til mysehydrolysatene, spesielt i den blodtrykksnedsettende ACE-I-aktiviteten, smaken og funksjonaliteten til produktet.

Det er i store trekk mot hydrolyseringsprosessen av et forskjellig myseprotein-inneholdende substrat og det nye hydrolysatet som produseres ved denne prosessen at den foreliggende oppfinnelsen er rettet.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å lage et forbedret myseprotein-hydrolysat som inneholder bioaktive peptider, som omfatter å hydrolysere et myseproteinisolat (WPI) med ett eller flere enzymer, hvor

i) enzymet er en varmelabil protease;

ii) hydrolysen blir utført ved en temperatur på mellom ca. 30°C og 65°C ved en pH på ca. 3,5 til ca. 9,0 når nevnte enzym er en nøytral protease, ved en pH på ca. 2,5 til ca. 6,0 hvor nevnte enzym er en sur protease, og ved en på ca. 5,0 til ca. 10,0 hvor nevnte enzym er en alkalisk protease;

iii) hydrolysen blir avsluttet når hydrolyseringsgraden som ikke er høyere enn

ca. 10% er nådd;

iv) hydrolysen blir avsluttet under milde betingelser for unngåelse av vesentlig

denaturering av peptider eller rest protein i hydrolysatet;

der produktet av fremgangsmåten er meget løselig.

Ved WPI forstås et myseproteinisolat som er produsert av enhver fremgangsmåte som er kjent i fagfeltet. Helst blir WPI produsert ved en fremgangsmåte basert på ione-utbytting fra et myseproteinkonsentrat, slik som en ost, syre eller melkemyseproteinkonsen-trat, som vil forstås av en fagperson.

Helst blir enzymet valgt fra gruppen som består av Protease P6, Protease A, Protease M, Peptidase, Neutrase, Validase, AFP 2000, eller en hvilken som helst annen varmelabil protease.

Myseproteinisolatet (WPI) kan hydrolyseres ved en konsentrasjon i området fra ca. 5 til 35% tørrstoffog enzymet eller enzymblandingen kan tilsettes for å gi et enzym-til-sub-stratforhold mellom ca. 0,01% og ca. 3% vekt/vekt totalt tørrstoff, helst mellom ca. 0,01% og ca. 1,0% vekt/vekt totalt tørrstoff.

WPI behandlet med sure proteaser hydrolyseres ved en pH på mellom ca. 2,5 og ca. 6,0, helst en pH på mellom 3,0 og ca. 5,0.

WPI behandlet med nøytrale proteaser hydrolyseres ved en pH på mellom ca. 3,5 og ca. 9,0, helst en pH på mellom 6,0 og ca. 8,0.

WPI behandlet med alkaliske proteaser hydrolyseres ved en pH i området mellom ca. 5,0 og ca. 10,0, helst en pH på mellom ca. 6,0 og ca. 8,0.

Proteinhydrolysen utføres ved et temperaturområde fra mellom ca. 30 til 65°C, helst fra ca. 50 til 60°C.

I én utførelsesform kan det ene eller flere enzymer som anvendes for selektivt å hydrolysere WPI være immobilisert på en uvirksom støtte under nevnte hydrolysetrinn ii) hvor nevnte uvirksomme støtte er Roehm Eupergi, karragenpartikler, "chitosan"-partik-ler eller ethvert annet, passende uvirksomme støttemateriale. Dette enzymsystemet kan så anvendes i en røretank eller ubevegelig bunn-reaktor eller på en membran eller hul fiber-reaktor for å utføre hydrolysereaksjonen.

Enzymet eller enzymene som anvendes for hydrolyse kan krysskobles til nevnte uvirksomme støtte før hydrolysereaksjonen.

Hydrolysatet i den foreliggende oppfinnelsen blir referert til som et "mildt" hydrolysat, hvor graden av hydrolyse, dvs. prosent peptidbindinger som kløyves av den enzyma-tiske virkningen er mindre enn ca. 10%. Selv om hydrolysatet fremdeles kan inneholde store peptidkjeder, som kan være svakt denaturerte, er dermed slutthydrolysatproduktet meget løselig.

Graden av hydrolyse av WPI-substratet er helst fra ca. 3% til ca. 10%, mest ønskelig fra ca. 3% til ca. 5% før hydrolysen er avsluttet.

Hydrolyse er bestemt av enzym-deaktiveringstrinnet iv). Helst omfatter enzymdeaktive-ringen varmedeaktivering.

Varmedeaktiveringen kan omfatte å varme nevnte hydrolysat i opptil 10 sekunder ved en temperatur på opptil ca. 100°C.

Når hydrolysen blir utført ved en temperatur under 65°C blir varmedeaktiveringstrinnet utført ved ca. 65°C til ca. 70°C i fra ca. 10 sekunder til ca. 15 minutter.

Når hydrolysen blir utført ved en temperatur under 60°C, blir varmedeaktiveringstrinnet utført ved ca. 60°C til ca. 65°C i fra ca. 10 sekunder opptil ca. 30 minutter.

Alternativt omfatter enzymdeaktiveringstrinnet iv) å forandre pH av nevnte myseproteininneholdende substrat til en pH hvor nevnte protease ikke er aktiv.

Ifølge én mulighet avhengig av enzymet eller enzymene som anvendes, kan enzymet eller enzymblandingen også deaktiveres ved fordampnings- og tørkingsprosedyrer.

Ifølge en annen mulighet kan enzymet eller enzymblandingen også deaktiveres med eller uten en på forhånd forandret pH.

Alternativt kan enzymene deaktiveres ved enkelt å fjerne dem fra reaksjonsblandingen. Når ett eller flere enzymer som anvendes for selektivt å hydrolysere WPI blir immobilisert på en uvirksom støtte, slik som ved krysskobling til nevnte uvirksomme støtte før hydrolyseringsreaksjonen, kan de for eksempel deretter separeres ut av hydrolysereaksjonen ved membranfiltrering for å oppnå deaktiveiing.

Alternativt kan enzymet eller enzymene separeres ut av hydrolyseringsblandingen ved anvendelse av en ultrafiltreirngsmembran med en nominell molekylvektavskj æring i området på ca. 10 til 500 kDa, helst ca. 10 til 200 kDa, når hydrolysen er fullstendig.

I en foretrukket utførelsesform blir avslutningen av hydrolysen oppnådd ved deaktivering av ett eller flere myseproteinhydrolyseenzymer ved først å forandre pH i reaksjonsblandingen til en pH hvor enzymet eller enzymene enten er inaktive eller mindre aktive, og/eller varmereaksjonsblandingen til en forholdsvis mild temperatur ved å anvende en varmeutbytter for å denaturere enzymet, men som ikke denaturerer de intakte myseproteinene i substratet. Et passende temperaturområde som ville denaturere enzymene er i størrelsesorden på ca. 55 til 70°C, helst ca. 65°C.

Etter hydrolyse og valgfri deaktivering eller fjerning av enzymene, kan hydrolysatet valgfritt utsettes for revers osmose under betingelser hvor salt og vann fjernes fra hydrolysatet. Det rensede, avsaltede hydrolysatet som omfatter myseproteiner, polypeptider og bioaktive peptider, blir så utvunnet.

Valgfritt kan det hydrolyserte WPI som inneholder den bioaktive peptidfraksjonen ren-ses med en UF-membran på ca. 5 - 200 kDa-avskjæring, helst ca. 10 - 50 kDa-avskjæring. De bioaktive peptidene, og andre peptider, blir så gjenvunnet i det som har gått igjennom.

Ifølge en annen mulighet kan ione-utbytting eller hydrofob adsorpsjon eller hydrofob interaksjonskromatografi eller kombinasjoner av disse prosessene anvendes for å gjen-vinne den hydrolyserte bioaktive fraksjonen fra hydrolysatene i en anriket form.

I en annen utførelsesform består oppfinnelsen av et myseprotein-hydrolysat som inneholder én eller flere bioaktive peptider valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ ID

No. 1), VSLPEW (SEQ ID No. 5), INYWL (SEQ ID No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ

ID No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ID No. 8).

Helst omfatter myseprotein-hydrolysatet minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av LIVTQ (SEQ ID No. 4), MKG (SEQ ID No. 2) og ALPMH (SEQ ID No. 3), i kombinasjon med minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ ID No. 1), VSLPEW (SEQ ID No. 5), INYWL (SEQ ID No. 6),

LKPTPEGDLEIL (SEQ ID No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ID No. 8).

Ifølge enda et aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som omfatter ett eller flere peptider valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ ID No. 1), VSLPEW (SEQ ID No. 5), INYWL (SEQ ID No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ID No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ID No. 8), eventuelt i kombinasjon med minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av LIVTQ (SEQ ID No. 4), MKG (SEQ ID No. 2) og ALPMH (SEQ ID No. 3)), sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Helst omfatter nevnte farmasøytiske sammensetning minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen bestående av SAP (SEQ ED No. 1),

VSLPEW (SEQ ED No. 5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7)

og LKGYGGVSLPEW (SEQ ED No. 8) i kombinasjon med det bioaktive peptidet MKG (SEQ ED No. 2), sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelse av ett eller flere bioaktive peptider valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ ED No. 1), VSLPEW (SEQ ED No.

5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7) og LKGYGGVSLPEW

(SEQ ED No. 8), eventuelt i kombinasjon med minst ett bioaktivt peptid valgt fra

gruppen som består av LIVTQ (SEQ ED No. 4), MKG (SEQ ED No. 2) og ALPMH (SEQ ED No. 3)), for fremstilling av et medikament for å behandle eller forebygge blodtrykksøkning hos en pasient som trenger en slik behandling. Foretrukket anvendes minst ett av SAP (SEQ ED No. 1), VSLPEW (SEQ ED No. 5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ED No. 8) i kombinasjon med MKG (SEQ ED No. 2).

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre et ikke-bittert, meget løselig WPI-hydrolysatprodukt laget ved prosessen i oppfinnelsen, hvor graden av hydrolyse av WPI fortrinnsvis er ca. 3% til ca. 10%, mer foretrukket ca. 3% til ca. 5%. Det er foretrukket at den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen av myseproteinene i produktet er mindre enn ca. 30 mikron, helst mindre enn ca. 3 mikron.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et matprodukt som inneholder nevnte ikke-bittert, meget løselig WPI-hydrolysatprodukt.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelse av et matprodukt som inneholder nevnte ikke-bittert, meget løselig WPI-hydrolysatprodukt ved fremstilling av et medikament for å behandle eller forebygge blodtrykksøkning hos en pasient som trenger det.

Oppfinnelsen vedrører også en farmasøytisk sammensetning som omfatter nevnte ikke-bittert, meget løselig WPI-hydrolysatprodukt i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen vedrører et hydrolysat, kjennetegnet ved at det omfatter minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av: SEK ED No. 1 og SEK ED No. 5-8.

Et siste aspekt vedrører et hydrolysat, kjennetegnet ved at det omfatter minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av: SEK ED No. 2-4 i kombinasjon med minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av: SEK ED No. 1 og SEK ED No. 5-8.

Det hydrolyserte WPI-produktet ifølge oppfinnelsen har én eller flere av de følgende trekkene:

• blodtrykksnedsettende ACE-I-aktivitet

"probiotisk" vekstfremmende aktivitet

ikke-klebrig, ikke-bitter smak

behagelig til svakt søt smak

gode organoleptiske egenskaper

høy løselighet

veldig gode skummingsegenskaper

veldig gode gelatineringsegenskaper

forbedret varmestabilitet

Anvendelsen av den milde hydrolyseteknologien til substratet av myseproteinisolatene (WPI) viste noen dramatiske forbedringer av sluttproduktet sammenlignet med søtt myseproteinkonsentrat (WPC) som et myseproteininneholdende substrat som utgreiet i WO 99/65326 som følger:

• Løselighet

Selv om WPI fremdeles denatureres svakt ved varmebetingelsene for å stoppe proteasereaksjonen, produserer den ingen uløselige materialer. Løseligheten forblir rundt 96% noe som er større enn det korresponderende WPC-hydrolysatet.

• Varmestabilitet

Det hydrolyserte WPI var signifikant mer varmestabilt enn det hydrolyserte WPC. Etter 120°C i 10 minutter @ 5% TS forble løseligheten 95%.

• Utseende

Passende seleksjon av reaksjonsbetingelser kan bestemme om slutt-hydrolysatet vil se hvitt ut eller være klar i løsni ng. Eksempel 1 under produserer et opakt produkt, mens eksemplene 2 og 3 (under) resulterer i klart produkt i løsning ved nøytral pH. Hydrolysatene av WPC var alle vesentlig hvite av utseende.

• Skummingsevne og -stabilitet

Det hydrolyserte WPI viser ca. dobbel evne til skumming og ca. 4-ganger skum-mingsstabilitet av ikke-hydrolysert WPI. Dette gjør produktet veldig passende som ingrediens i yoghurt og dessertbruk. Det hydrolyserte WPI viste også forbedret skummingsevne og -stabilitet sammenlignet med et WPC-hydrolysat.

• Gelstyrke

Det mildt hydrolyserte WPI viser en markert øket gelstyrke sammenlignet med ikke-hydrolysert WPI. Dette gjør produktet veldig passende som ingrediens i yoghurt og dessertbruk. Det hydrolyserte WPI viste også forbedret gelstyrke sammenlignet med WPC-hydrolysat.

• Smak

Det hydrolyserte WPI viser signifikant mindre bitterhet sammenlignet med svakt hydrolyserte WPC-produkter. Bitterheten viser ingen tendens til å øke gjennom hydrolyseringstiden, noe som gjør kontrollen over prosessen mye lettere sammenlignet med WPC-hydrolyse.

• ACE-I-aktivitet in vitro

Det hydrolyserte WPI viser ca. dobbel ACE-I-aktivitet in vitro av mildt hydrolyserte WPC, under sammenligning av reaksjonsbetingelser og tilsetning av enzym.

• Akselerering av probiotisk fermentering

Det hydrolyserte WPI viste en akselerering i hastigheten for probiotisk yoghurt-fermenteringstid på ca. 40% ved en tilleggshastighet på 1,5%.

Oppfinnelsen består av det foregående og også konstruksjoner som det gis eksempler på i det følgende.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Den foreliggende oppfinnelsen vil nå bli beskrevet med referanse til de medfølgende tegningene hvor: Figur 1 er et plot av bitterhet og bioaktivitet på ordinanten mot graden av hydrolyse på abscissen. "Mulighetsvinduet" for å få et produkt ifølge den foreliggende oppfinnelsen som inneholder bioaktive peptider og som har akseptable smaker før hydrolyseringsreaksjonen produserer bitre peptider er mellom linjene Xi og X2. Figur 2 viser den akutte, kortvarige effekten av systolisk blodtrykk av å dosere modne, spontane, hypertensive hastigheter (SHR) med 6,0 g WPC hydrolysat per kg kroppsvekt. Figur 3 viser den aktutte korttidseffekten av systolisk blodtrykk av å dosere modne, spontane, hypertensive hastigheter (SHR) med 3,6 g WPI hydrolysat per kg kroppsvekt. Figur 4 viser den akutte, kortvarige effekt av systolisk blodtrykk av å dosere modne, spontane, hypertensive hastigheter (SHR) med 165 mg peptid MKG (SEQ ED No. 2) per kg kroppsvetk.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Som diskutert over tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en prosess for å produsere WPI-produkt som inneholder bioaktive peptider, hvor hydrolysen utføres under en høy grad av kontroll for å hindre uønskede smaker som utvikler seg under hydrolyse (for eksempel bitterhet, såpeaktig og buljongaktig). Hydrolysen blir stanset innen "mulighetsvinduet", dvs. før fremkomsten av vesentlig bitterhet - som vist i figur 1 - for å tilveiebringe hydrolysater som har gode organoleptiske egenskaper og maksimalt med bioaktive peptider. I figur 1 er graden av hydrolyse representert kvalitativt på X-aksen. Vinduet for mulighet er mellom puntkene Xi og X2 som vil variere avhengig av enzymet som anvendes. De optimale betingelsene som søkes er en maksimal bioaktivitet med et akseptabelt nivå av bitterhet.

I bestemte, foretrukne utførelsesformer av prosessen i oppfinnelsen, er enzymet som hydrolyserer WPI varmelabilt og valgt blir fra gruppen som består av Protease P6, Protease A, Protease M, Peptidase, Neutrase, Validase og AFP 2000 (alle er her definert) og hydrolysen av WPI blir avsluttet ved varmebehandling i kort tid ved en høy temperatur (ca. 85 til 100°C i ca. 1 til 10 sekunder). Søkerne har overraskende funnet at de ovenfor nevnte enzymene (1) er i stand til å produsere et myseproteinhydrolysat som inneholder et godt nivå med bioaktive peptider, og (2) som kan inokuleres ved behandling i kort tid ved høy temperatur som bare forårsaker delvis denaturering av myseproteinene i hydrolysatet, og som overraskende forbedrer de organoleptiske egenskapene til myseproteinene, med hensyn til å tilveiebringe et produkt som er vesentlig hvitt eller klart av utseende.

Den foreliggende oppfinnelsen blir nå eksemplifisert ved de følgende eksemplene ved å anvende ALACEN™ 895 eller ALACEN™ 894 (myseproteinisolater, kommersielt til-gjengelig fra NCDB), produktspesifikasjonene for dem er vedlagt i Appendiks I:

Eksempel 1

Prøve fabrikkproduksjon av WPI mildt hydrolysat

Myseproteinisolat produsert ved kation-ione-utbyttingsteknologi (ALACEN™ 895) med et proteininnhold > 90% vekt/vekt ble rekonstituert til 20% totalt tørrstoff i vann (50°C). Rekonstituert ALACEN™ 895 ble overført til en 1501 tank ved 50°C. Vann (50°C) ble tilsatt til tanken for å få en sluttotal av tørrstoff på 4%. Løsningen ble rørt og Neutrase (E:S 0,9%) ble tilsatt.

To timer etter tilsetning av enzym ble det første hydrolysatet pumpet gjennom UHT-anlegget. Enzyminaktivering ble oppnådd ved å anvende direkte dampinjeksjon for å varme hydrolysatet til 88°C og hydrolysatet ble holdt ved denne temperaturen i 1,5 sekunder. Hydrolysatet ble kortvarig nedkjølt og passerte gjennom hus- og rør-varmeut-byttinger for å kjøles ned til omgivelsestemperatur.

Hydrolysatet ble deretter inndampet og tørket.

Et hydrolysat som ble laget ved å følge prosessen i eksempel 1 hadde følgende trekk:

Løselighet: 95%

Varmestabilitet: 120°C i 10 min. ved 5% TS løselighet 95%

ACE-I in vtfro-aktivitet: 289 mg/l IC50

Skumming: Markert økning sammenlignet med ikke-hydrolysert WPI

Smak: Markert forbedring sammenlignet med WPC-baserte, milde hydrolysater Utseende: Opak hvit, partikkelstørrelse ~ 0,1 um.

Løseligheten, varmestabiliteten, skumming og utseende til WPI-hydrolysatet blir målt ved standard fremgangsmåter som er kjent for fagfolk. Løseligheten for 5% totalt tørr-stoff (TS) -løsning ble bestemt ved sentrifugering ved 3000 G i 10 minutter (ved rom-temperatur). Varmestabiliteten til 5% TS-løsningene ble bestemt ved å varme til 120°C i 10 minutter, rask avkjøling, deretter sentrifugering ved 700 G i 10 minutter. TS som var i supernatanten og i den opprinnelige løsningen ble bestemt. Løseligheten var definert som TS(supernatant)/TS(opprinnelig løsning). Skumming av 10% TS-løsninger ved pH 7,0 ble bestemt ved å vispe med en Hobart mikser (modell N-50G, Hobart Corporation) i 15 minutter. Prosent oversvømmelse ble anvendt for å sammenligne prøven som det vil forstås av en fagperson. Tilsynekomsten av 5% TS ble bestemt ved visuell observa-sjon og partikkelstørrelsen ble målt ved å anvende en Malvern MasterSizer (modell MSEOOSM, Malvern Instruments Ltd).

ACE-I-aktivitet ( in vitro) i det tørkede produktet ble bestemt ved å anvende FAPGG

som et substrat (Product 305-10 ex Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO, USA) ifølge fremgangsmåten til D. W. Cushman og H.S. Cheung (1971). ACE-I-aktivitetene er uttrykt som mengde materiale (mg/l) som trengs for å redusere aktiviteten av ACE-I-enzymet med 50%.

Smaken ble undersøkt subjektivt med referanse til bitterheten og astringensen til hydrolysatene, spesielt ble den sensoriske profilen undersøkt av et formelt sensorisk panel. 5% vekt/vekt-prøver ble smakt på ved 24°C ved å anvende multi-dimensjonell skale-ring. Prøvene ble evaluert og markert på en 150 mm forankret linje (fravær (0) til intens

(150)).

Eksempel 2

Hydrolysereaksjonen ble repetert som skissert over for eksempel 1 (10% totalt tørrstoff, E:S 0,9%, 1501). Etter inaktivering ble hydrolysatet øyeblikkelig inndampet og tørket.

Et hydrolysat laget med denne fremgangsmåten hadde de følgende trekkene som ble målt som utgreiet over for eksempel 1:

Løselighet: 97%

Varmestabilitet: 120°C i 10 minutter ved 5% TS-løselighet 96%

ACE-I in vitro- aktivitet;: 503 mg/l IC50

Skumming: Markert økning sammenlignet med ikke-hydrolysert WPI

Gelatinering: Markert økning sammenlignet med ikke-hydrolysert WPI

Smak: Markert forbedring sammenlignet med WPC-baserte, mile hydrolysater Utseende: Klar, gulaktig

Eksempel 3

Hydrolysereaksjonen i eksempel 1 ble repetert som skissert over (4% totalt tørrstoff, E:S 0,9%, 1501). Fire timer etter enzymtilsetning ble det første hydrolysatet pumpet gjennom UHT-anlegget ved å anvende de samme betingelsene som i eksempel 1.

Et hydrolysat laget ved denne fremgangsmåten hadde de følgende trekkene som blir målt som utgreiet over for eksempel 1:

ACE-I in vifro-aktivitet: 230 mg/l IC50

Skumming: Markert økning sammenlignet med ikke-hydrolysert WPI

Gelatinering: Markert økning sammenlignet med ikke-hydrolysert WPI

Smak: Markert forbedring sammenlignet med WPC-baserte, milde hydrolysater Utseende: Klar, gulaktig

Eksempel 4

En 2% løsning med ALACEN™ 894 (mikrofiltrert WPI) ble forandret til pH 3,0 før den gjennomgikk ultrafiltrering ved 10°C med en 3000 Dalton nominell molekylvekt av-skjæringsmembran (CDUF001LB, Millipore Corporation, Bedford). pH til det som gikk igjennom ble forandret til 7,0 og fortynnet til 2% totalt tørrstoff før ultrafiltrering ved 10°C med den samme membranen som ble anvendt tidligere. De total tørrstoffene til det som gikk igjennom ble justert til 5,0% før det ble hydrolysert med E:S 0,9% vekt/vekt Neutrase (Novo Nordisk, Danmark) ved 50°C. Etter 4 timer ble prøven inaktivert ved 88°C i 3 sekunder og deretter frysetørket. ACE-I-aktiviteten ble bestemt til å være 227 mg/l.

Eksempel 5

Mildt hydrolysert WPI fra eksempel 3 ble vist å fremme veksten av en probiotisk mik-roorganisme når den ble tilsatt til halvfet melk ved en tilleggsrate på 1,5%. Melken ble varmebehandlet ved 90°C i 10 minutter. Etter nedkjøling til 37°C ble melken inokulert med 0,1% S. thermophilus 2% L. rhamnosus HN001 (DR20™). Fermenteringstiden til kontrollen var 20 timer for å nå den ønskede pH på 4,4.1 motsetning til dette reduserte tilsettingen av WPI-hydrolysatet fermenteringstiden til 13 timer.

Eksempel 6

Identifikasjon av ACE-inhibitor-peptider i WPI-hydrolysater

Hensikten med dette eksemplet var å isolere og identifisere ACE-I-hemmende peptider som er tilstede i WPI-hydrolysatene.

Metodologi

• Startmaterialet for ACE-I peptidisolering var et UF-permeat (10 kDa) ervervet fra det opprinnelige hydrolysatet fra eksempel 1; • Peptider tilstede i hydrolatet ble separert ved å anvende revers-fase HPLC; • Rensede peptider ble undersøkt individuelt for ACE-hemmende aktivitet som beskrevet i eksempel 1; • Aminosyresekvensen til hvert aktivt peptid ble identifisert ved en kombinasjon av massespektrometri og N-terminal sekvensanalyse; • Utgangspuntket for de aktive peptidene ble bestemt ved å sammenligne deres sekvenser med kjente sekvenser for melkeproteiner.

Peptidene, deres opprinnelse, aktiviteter og kjente likheter er satt frem i tabell 1 under: • Tre av de aktive peptidene fra WPI-hydrolysatet var tidligere identifisert i WPC-hydrolysatet, dvs. p-LG(7-9), p-LG(142-146) og p-LG(l-5).

Eksempel 7

Sensorisk sammenligning av mildt hydrolysert WPI sammenlignet med mildt hydrolysert WPC og ikke-hydrolysert WPI

WPI ble hydrolysert som vist over i eksempel 1. WPC ble hydrolysert som vist i eksempel 1 i WO 99/65326 (ALACEN™ 392,10%, hydrolysert og inaktivert etter 2 timer).

ALATAL™819 er et kommersielt produkt fra New Zealand Dairy Board; oppsumme-ringen av produktspesifikasjonen er vedlagt i appendiks I.

En smakspanel noterte bitterheten og astringensen til produktene på en 150 mm forankret linje (fravær (0) til intens (150)).

Graden av hydrolyse ble bestemt ved å anvende den modifiserte O-ftaldialdehyd (MOPA) -fremgangsmåten beskrevet av Frister m.fl. (1988).

Både mildt hydrolysert WPI og mildt hydrolysert WPC var som forventet bitrere og mer astringent enn det ikke-hydrolyserte WPI-produktet. Imidlertid var disse produktene signifikant mindre bitre og astringente enn et kraftigere hydrolysert ALATAL TM 819 (et produkt fra New Zealand Dairy Board, NZ).

Mildt hydrolyserte WPI-produkter ga mer akseptable smaksprodukter og hadde signifikant høyere ACE-I-aktivitet, sammenlignet med de mildt hydrolyserte WPI (beskrevet i

WO 99/65326). Resultatene viste også at det mildt hydrolyserte WPI var signifikant mindre bittert og astringent enn det ekvivalente WPC-produktet, selv om graden av hydrolyse for begge var den samme. Så vel som å ha en mer akseptabel smaksprofil, så var ACE-I-aktiviteten til den mildt hydrolyserte WPI nesten to ganger den til det mildt hydrolyserte WPC.

Selv om videre hydrolyse av WPC kan resultere i en øket ACE-I-aktivitet, er en signifikant nedgang i smaksprofilen sammenlignet med den mildt hydrolyserte WPI observert, kompromitterende for smaksprofilen som skyldes øket bitterhet og astringens.

Eksempel 8

Blodtrykksmåling

Blodtrykk ble målt ved å anvende en bakre mansjettmonitor og et formåldesignet appa-rat for å måle blodtrykket på små dyr [IITC Inc, 239 Victory Blvd., Woodland Hills, CA 91367, USA]. Hvert tidspunkt var gjennomsnittet av 3 til 5 avlesinger tatt i løpet av ca.

5 til 10 minutter.

Dyrestammen

Spontant hypertensive rotter (SHR) ble tilført fra the Animal Resource Centre, Western Australial.

Prøvedose

Testsubstansene ble gitt til hver rotte på basis av per kg kroppsvekt med mindre annet er sagt. Den individuelle dosen for hvert dyr ble inkorporert i en smakstilsatt gele som var lett å fortære av dyrene.

De tre prøvene som ble evaluert for korttidsblodtrykksrespons var et mildt hydrolysert myseprotein-konsentrat (figur 2), et mildt hydrolysert myseproteinisolat (se figur 3) og et syntetisert peptid fra tabell 1, nemlig (MKG (SEQ ED No. 2) (se figur 4). WPC var laget ifølge metodologien vist i eksempel 1 i WO 99/65326.

Akutte eller korttidseffekter av midlene ble bestemt ved å behandle voksne SHR med middelet og så studere deres blodtrykkresponser i de følgende timene. Studien oppda-ger om et middel senker blodtrykk som allerede er forhøyet.

Resultater

Korttidsdosering av SHR med 3,6 g/kg kroppsvekt WPI-hydrolysat (figur 3) resulterte i en signifikant reduksjon i blodtrykk sammenlignet med kontrollrottene (p = 0,0378). Reduksjonen i blodtrykk var lik den som ble oppnådd hos rotter dosert med 6,0 g/kg kroppsvekt WPC-hydrolysat (figur 2). WPI-hydrolysatet synes dermed å være mer aktivt enn det sammenlignet med WPC-hydrolysatet, slik at ca. 50% mindre av WPI-hydrolysatet er nødvendig for å gi en lignende nedgang i blodtrykk (systolisk) i modne

SHR.

Korttidsdosering av SHR med 165 mg/kg kroppsvekt peptid MKG (figur 4) viste en mye større reduksjon i blodtrykk sammenlignet med kontrollrotter (p = 0,0021) etter 4 timer; p < 0,0001 etter 8 timer) så vel som sammenlignet med det milde WPI-hydrolysatet og milde WPC-hydrolysatet.

Konklusjoner

Prosessen med mildt hydrolysert WPI ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer nyttige WPI-hydrolysater som viser signifikant funksjonell forbedring sammenlignet med WPC-hydrolysatene i WO 9965326. Spesielt omfatter de foreliggende WPI-hydrolysatene med aktive peptider med signifikant mindre WPI-hydrolysat nødvendig for å senke blodtrykk in vivo i samme grad som et WPC-hydrolysat. WPI kan hydrolyseres lenger uten å tape akseptable smakskarakteristika samtidig som den opprettholder den økte ACE-I-aktiviteten. Totalt tilveiebringer prosessen i den foreliggende oppfinnelsen dermed et bioaktivt myseprotein-hydrolysat som er forbedret i smak, ACE-I-aktivitet og funksjonalitet sammenlignet med det i WO 99/65326.

INDUSTRIELL BRUK

Prosessen i den foreliggende oppfinnelsen er nyttig for å produsere det nye myseprotein-hydrolysatet som har overraskende gunstige egenskaper og som kan anvendes som mat eller medisin som blodtrykksnedsettende middel.

REFERANSER

Bemal V & Jelen P (1989). Effectiveness of lactose hydrolysis in Cottage cheese whey for the development of whey drinks. Milchwissenchqft 44: 222-225

FR 2309154, 30 December 1976 Fromageries Bel La Vache Qui (From), France.

US 3970520,20 July 1976, General Electric Co, USA.

EP0117047, 29 August 1984, General Foods Corporation, USA.

Maubois J L, Léonil J, Trouvé R & Bouhallab S (1991)

Les peptides du lait å activité physiologique III. Peptidcs du lait å effect cardiovasculaire: activités antithrombotique ct antihypertensive. Lait, 71, 249-255.

JP 4282400, 7 October 1992, Calpis Shokuhin Kogyo KK, Japan.

EP065663, 1 December 1982, Miles Laboratories Incorporated, USA.

JP 8056568, 17 August 1994. Morinaga Milk Co Ltd Japan.

EP4745506, 11 March 1992, Morinaga Milk Co Ltd, Japan.

Mullally M M, Meisel H & FitzGerald R J (1997)

Identification of a novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptide corresponding to a tryptic fragment of bovine p-lactoglobulin. Federation of European Biochemical Societies Letters, 402, 99-101.

Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K & Takano T (1994)

Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790. Journal of Dairy Science, 77, 917-922.

Roy G (1992). Bitterness: reduction and inhibition. Trends in Food Science and Technology 3: 85-91

Roy G (1997). Modifying bitterness: Mechanism, ingredients and applications. Technomic Publishers, Lancaster, UK.

US 4358464,9 September 1982, Superior Dairy Company, USA.

Yamamoto N (1997). Antihypertensive peptides derived from food proteins. Biopolymers 43: 129-134.

Frister H, Meisel H & Schlimme E (1988). OPA method modified by use of N,N-dimethyl-2-mercaptoethylammoniumchloride as thiol component. Freesenius ZAnal Chem. 330, 631-633

Cushman D W & Cheung H S (1971). Spectrophotometric assay and properties of the angiotension converting enzyme in rabbit lung. Biochem Pharmacol 20: 163 7-1648.

WO 9965326, 23"<1> December, 1991, New Zealand Dairy Board, NZ.

Mutilangi et al (1996). Journal of food science, vol. 61, nr. 2, side 270-274

Claims

1. Fremgangsmåte for å lage et forbedret myseprotein-hydrolysat som inneholder bioaktive peptider, som omfatter å hydrolysere et myseproteinisolat (WPI) med ett eller flere enzymer, karakterisert ved at: i) enzymet er en varmelabil protease; ii) hydrolysen blir utført ved en temperatur på mellom ca. 30°C og 65°C ved en pH på ca. 3,5 til ca. 9,0 når nevnte enzym er en nøytral protease, ved en pH på ca. 2,5 til ca. 6,0 hvor nevnte enzym er en sur protease, og ved en pH på ca. 5,0 til ca. 10,0 hvor nevnte enzym er en alkalisk protease; iii) hydrolysen blir avsluttet når hydrolyseringsgraden som ikke er høyere enn ca. 10% er nådd; iv) hydrolysen blir avsluttet under milde betingelser for unngåelse av vesentlig denaturering av peptider eller rest protein i hydrolysatet; hvor produktet av fremgangsmåten er meget løselig.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymet blir valgt fra gruppen som består av Protease P6, Protease A, Protease M, Peptidase, Neutrase, Validase, AFP 2000, eller en hvilken som helst annen varmelabil protease.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at nevnte enzymdeaktiveringstrinn iv) omfatter varmedeaktiveringen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte varmedeaktivering omfatter å varme nevnte hydrolysat i opptil 10 sekunder til en temperatur på opptil ca. 100°C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at når nevnte hydrolyse blir utført ved en temperatur på under ca. 65°C, blir nevnte varmede-aktiveringstrinn utført ved ca. 65°C til ca. 70°C i fra ca. 10 sekunder til ca. 15 minutter.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at når nevnte hydrolyse blir utført ved en temperatur under ca. 60°C, blir nevnte varmedeakti-veringstrinn utført ved ca. 60°C til ca. 65°C i fra ca. 10 sekunder opp til ca. 30 minutter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert v e d at nevnte enzymdeaktiveringstrinn omfatter å forandre pH til nevnte myseproteininneholdende substrat til en pH hvor nevnte protease ikke er aktiv.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte enzymdeaktiverende trinn inkluderer varmedeaktivering ifølge ethvert av kravene 3 til 6.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert v e d at nevnte enzymdeaktiveringstrinn iv) omfatter å utsette nevnte hydrolysat for ultrafiltrering med en ultrafiltreirngsmembran som har en nominell molekylvektavskjæ-ring i området på ca. 10 til 500 kDa.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte ultrafiltreirngsmembran har en nominell molekylvektavskj æring i området på ca.

10 til 200 kDa.

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte enzym blir immobilisert på en uvirksom støtte under nevnte hydrolysetrinn ii).

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte uvirksomme støtte er Roehm Eupergit, karragenpartikler, "chitosan"-partikler eller hvilket som helst annet passende uvirksomt støttemateriale.

13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at hydrolyseringsgraden er fra ca. 3 til ca. 10%.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at hydrolysegraden er fra ca. 3% til ca. 5%.

15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at myseprotein-hydrolysatet som blir produsert omfatter ett eller flere bioaktive peptider valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ EO No. 1), VSLPEW (SEQ ED No. 5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ED No. 8).

16. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at myseprotein-hydrolysatet som lages omfatter minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av LEVTQ (SEQ ED No. 4), MKG (SEQ ED No. 2) og ALPMH (SEQ ED No. 3), i kombinasjon med minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ ED No. 1), VSLPEW (SEQ ED No. 5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ED No. 8).

17. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter minst ett av de bioaktive peptidene som blir produsert i fremgangsmåten ifølge krav 15, eventuelt i kombinasjon med minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av LEVTQ (SEQ ED No. 4), MKG (SEQ ED No. 2) og ALPMH (SEQ ED No. 3) ), sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

18. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 17, karakterisert ved at den omfatter minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen bestående av SAP (SEQ EO No. 1), VSLPEW (SEQ EO No. 5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ED No. 8) i kombinasjon med det bioaktive peptidet MKG (SEQ ED No. 2), sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

19. Anvendelse av minst ett av de bioaktive peptidene som blir produsert i fremgangsmåten ifølge krav 15, eventuelt i kombinasjon med minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av LEVTQ (SEQ ED No. 4), MKG (SEQ ED No. 2) og ALPMH (SEQ ED No. 3)), ved fremstilling av et medikament for å behandle eller forebygge blodtrykksøkning hos en pasient som trenger en slik behandling.

20. Anvendelse ifølge krav 19, hvor minst ett av de bioaktive peptidene som blir produsert i fremgangsmåten ifølge krav 15 anvendes i kombinasjon med MKG (SEQ ED No. 2).

21. Ekke-bittert, godt løselig WPI-hydrolysatprodukt, karakterisert ved at produktet inneholder bioaktive peptider laget ved fremgangsmåten ifølge krav 15 eller 16.

22. Produkt ifølge krav 21, karakterisert ved athydro-lysegraden til WPI er ca. 3% til ca. 5%.

23. Produkt ifølge krav 22, karakterisert ved athovedpar-tikkelstørrelsen til myseproteinene i produktet er mindre enn ca. 30 mikron.

24. Produkt ifølge krav 23, karakterisert ved athovedpar-tikkelstørrelsen er mindre enn ca. 3 mikron.

25. Produkt ifølge ethvert av kravene 21 til 24, karakterisert v e d at det er vesentlig klart eller hvitt i løsning.

26. Produkt ifølge ethvert av kravene 22 til 26, karakterisert v e d at ett eller flere av nevnte bioaktive peptider er valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ ED No. 1), VSLPEW (SEQ ED No. 5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ED No. 8).

27. Produkt ifølge ethvert av kravene 21 til 25, karakterisert ved at det omfatter minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av LEVTQ (SEQ ED No. 4), MKG (SEQ ED No. 2) og ALPMH (SEQ ED No. 3), i kombinasjon med minst ett bioaktivt peptid valgt fra gruppen som består av SAP (SEQ ED No. 1), VSLPEW (SEQ ID No. 5), INYWL (SEQ ED No. 6), LKPTPEGDLEIL (SEQ ED No. 7) og LKGYGGVSLPEW (SEQ ED No. 8).

28. Matprodukt, karakterisert ved at det inneholder et WPI-hydrolysatprodukt ifølge ethvert av kravene 21 til 27.

29. Anvendelse av et produkt ifølge ethvert av kravene 21 til 27 i produksjonen av et medikament for å behandle eller forebygge blodtrykksøkning hos en pasient som trenger det.

30. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter produktet ifølge ethvert av kravene 21 til 27 sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

31. Hydrolysat, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av: SEK ED No. 1 og SEK ED No. 5-8.

32. Hydrolysat, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av: SEK ED No. 2-4 i kombinasjon med minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av: SEK ED No. 1 og SEK ED No. 5-8.