CN103805664B - 一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物及其制备方法，所述制备方法将酶解法和糖基化方法相结合，能够最大程度的降低过敏原含量。其中，酶解法中选用的酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶A和蛋白酶M，糖基化方法中的糖选用低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖中的一种或几种的混合物。利用本发明的方法，能够有效降低乳清蛋白的抗原性抑制率，其中α‑乳白蛋白(α‑LA)的抗原性抑制率达到5％，β‑乳球蛋白(β‑LG)的抗原性抑制率达到2％。

Description

一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物及其制备方法

技术领域

本发明属于食品生物工程领域，具体涉及一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物及其制备方法。

背景技术

随着食品工业的不断发展，食物来源越来越丰富，食物的安全性日渐受到人们的重视。但近几十年来，食物过敏现象逐年增多，食物过敏已经成为人类营养尤其是儿童营养中的一个重要的公共卫生问题。流行病学研究表明，有约33％的过敏反应是由食物引发的。据统计，全球有近2％的成年人和4～6％的儿童患有食物过敏。发达国家十分重视对食物过敏的研究及防治，但目前我国对食物过敏问题一直没有引起足够的重视，相关研究报道较少。

对婴幼儿来说，母乳是最理想的营养品。但当母乳缺乏时，牛乳因其营养丰富、来源广泛，且与母乳成分较为接近而被作为母乳的最佳替代品。大量流行病学研究表明，在食物过敏中，牛乳蛋白过敏对婴幼儿来说是最普遍的，有2～6％的婴幼儿对牛乳蛋白有一定的过敏，且伴随基因遗传的提高而急速上升，约有20％的婴幼儿在1岁前，用牛奶喂养都会发生牛乳蛋白过敏。所以，研究一种低敏性乳蛋白对于满足市场需求是十分迫切的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物及其制备方法，能够最大程度的降低过敏原含量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)按照5～8％的重量比将乳清蛋白溶于水中，得到乳清蛋白溶液；

(2)水解：将所述乳清蛋白溶液的pH值调节至7.0～8.0，按照3000～5000U／g蛋白的比例加入复合酶，在55℃～75℃温度下，水解1～2h，得到水解乳清蛋白溶液；

(3)按照10～15％的重量比将糖溶解于上述水解乳清蛋白溶液中，配制成混合液，将所述混合液的pH值调至7.0～8.0，冷冻干燥得到蛋白糖混合物；

(4)糖基化：将所述蛋白糖混合物在60％～70％相对湿度、55℃～65℃温度下，进行糖基化处理24h～48h，得到糖基化水解乳清蛋白；

(5)将上述糖基化水解乳清蛋白溶解于水中，透析除去未反应的糖和盐，再次冷冻干燥，即得到所述的低敏性糖基化乳清蛋白水解物。

进一步的，步骤(1)中所述的乳清蛋白是浓缩乳清蛋白WPC-8000。

进一步的，步骤(2)中所述的复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶M的混合物，所述各个酶的重量份数比为：

进一步的，步骤(3)所述的糖是低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖中的一种或几种的混合物。

进一步的，所述低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖的重量份数比为：

低聚麦芽糖 1～2

葡萄糖 1～5

磷酰基低聚糖 0.5～1。

本发明相比现有技术的有益效果是：

1、本发明将酶解法和糖基化处理相结合，能够有效降低乳清蛋白的抗原性，其中α-乳白蛋白(α-LA)的抗原性抑制率达到5％，β-乳球蛋白(β-LG)的抗原性抑制率达到2％；

2、本发明制备得到的低敏性糖基化乳清蛋白水解物，由于糖基化处理引入了多糖，解决了酶解法得到水解产物的苦涩味道，并且引入了香甜的特殊风味；

3、本发明的低敏性糖基化乳清蛋白水解物由于引入糖类，被引入的糖分子由于空间位阻和电荷作用，可以掩蔽蛋白上的抗原决定簇，降低乳清蛋白的抗原性，另外，糖分子的引入还能够增加乳清蛋白的营养成分。

附图说明

图1为本发明低敏性糖基化乳清蛋白水解物的电泳图，其中1为水解物，2为乳清蛋白，3为小分子量蛋白电泳marker；

图2、图3和图4为本发明低敏性糖基化乳清蛋白水解物抗原性抑制率柱状图，其中1、2分别为原料乳清蛋白中α-LA、β-LG的抗原性抑制率，3、4分别为本发明所述低敏性糖基化乳清蛋白水解物中α-LA、β-LG的抗原性抑制率。

具体实施方式

实施例1

一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)按照5～8％的重量比将乳清蛋白溶于水中，得到乳清蛋白溶液；

(2)水解：将所述乳清蛋白溶液的pH值调节至7.0～8.0，按照3000～5000U／g蛋白的比例加入复合酶，在55℃～75℃温度下，水解1～2h，得到水解乳清蛋白溶液；

(3)按照10～15％的重量比将糖溶解于上述水解乳清蛋白溶液中，配制成混合液，将所述混合液的pH值调至7.0～8.0，冷冻干燥得到蛋白糖混合物；

(4)糖基化：将所述蛋白糖混合物在60％～70％相对湿度、55℃～65℃温度下，进行糖基化处理24h～48h，得到糖基化水解乳清蛋白；

(5)将上述糖基化水解乳清蛋白溶解于水中，透析除去未反应的糖和盐，再次冷冻干燥，即得到所述的低敏性糖基化乳清蛋白水解物。

进一步的，步骤(1)中所述的乳清蛋白是浓缩乳清蛋白WPC-8000。

进一步的，步骤(2)中所述的复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶M的混合物，所述各个酶的重量份数比为：

进一步的，步骤(3)所述的糖是低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖中的一种或几种的混合物。

进一步的，所述低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖的重量份数比为：

低聚麦芽糖 1～2

葡萄糖 1～5

磷酰基低聚糖 0.5～1。

所述乳清蛋白购于北京银河路经贸有限公司；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶购于诺维信公司提供；木瓜蛋白酶购于广西南宁杰沃利生物制品有限公司；胰蛋白酶购于美国Amresco公司；蛋白酶A、蛋白酶M购于日本天野酶制品株式会社；低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖购于Supelco公司。

本实施例中所用重量单位为千克，也可以为克；

本实施例中所述的各个原料均为食用级；

在本实施例中，所述各原料可以在给出的配比范围内灵活组合，在此不一一枚举。

实施例2

本实施例是实施例1基础上的优选方案，所用的原料的品质与实施例1相同，其中与实施例1相同的部分不再次重复，请参照实施例1。

一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)按照5％的重量比将乳清蛋白溶于水中，得到乳清蛋白溶液；

(2)水解：将所述乳清蛋白溶液的pH值调节至7.5，按照4000U／g蛋白的比例加入复合酶，在65℃温度下，水解1.5h，得到水解乳清蛋白溶液；

(3)按照5％的重量比将糖溶解于上述水解乳清蛋白溶液中，配制成混合液，将所述混合液的pH值调至7.5，冷冻干燥得到蛋白糖混合物；

(4)糖基化：将所述蛋白糖混合物在65％相对湿度(KBr饱和溶液)、65℃温度下，进行糖基化处理48h，得到糖基化水解乳清蛋白；

(5)将上述糖基化水解乳清蛋白溶解于水中，透析除去未反应的糖和盐，再次冷冻干燥，即得到所述的低敏性糖基化乳清蛋白水解物。

进一步的，步骤(1)中所述的乳清蛋白是浓缩乳清蛋白WPC-8000。

进一步的，步骤(2)中所述的复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶M的混合物，所述各个酶的重量份数比为：

进一步的，所述低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖的重量份数比为：

低聚麦芽糖 1

葡萄糖 2

磷酰基低聚糖 1。

利用SDS-PAGE(具体方法参见Laemmli UK.Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4.nature1970227(5259)680-685.)测定所述低敏性糖基化乳清蛋白水解物的分子量分布情况，结果参见图1。

利用间接竞争ELISA方法测定所述低敏性糖基化乳清蛋白水解物的抗原性，具体方法如下：

(1)抗原包被

以α-LA、β-LG分别作为抗原，用包被液稀释至一定质量浓度包被96孔酶标板，每孔100μL4℃冰箱中过夜。同时设置空白，空白不包被抗原，只加包被液。

(2)洗涤

次日倾去孔内液体，用洗涤液洗板4次，每孔250μL，每次3min，于干净吸水纸上拍干。

(3)封闭

加封闭液进行封闭，每孔100μL，37℃孵育1h。反应结束后，倾去孔内液体，洗涤液洗板4次，拍干。

(4)加样

在反应孔中加入0.1mg／mL待测样品(低敏性糖基化乳清蛋白水解物)和一定稀释度的兔抗血清各50μL。不加样品的反应管作为无竞争反应体系。37℃孵育0.5h。反应结束后，倾去孔内液体，洗涤液洗板4次，拍干。

(6)加酶标抗抗体

用封闭液稀释HRP-羊抗兔IgG(1∶10000)，每孔100μL，置于湿盒中，37℃孵育1h。反应结束后，倾去孔内液体，洗涤液洗板4次，拍干。

(7)显色

加新鲜配制的TMB底物溶液，每孔100μL，置于湿盒中，37℃孵育10min，显示蓝色。

(8)终止反应

加2mol／L H₂SＯ₄终止反应，每孔50μL，颜色变黄。

(9)比色

用酶联免疫检测仪双波长(450nm)测定各孔的吸光值。

(10)数据处理

抗原性的大小用抑制率来表示，计算公式如下：

抑制率(％)=(B₀-B)／B₀×100％

其中B表示各被测样的吸光值，B₀为无竞争体系的吸光值。抑制率表征样品抑制抗血清与酶标板上包被的抗原结合的能力的大小，记为抑制率。抑制率越低，低敏性糖基化乳清蛋白水解物的抗原性越低，二者成正比关系。

具体抑制率结果参见图2。经本实施例制备方法得到的低敏性糖基化乳清蛋白水解物为实验组，不经处理的乳清蛋白为对照组。与对照组相比，实验组蛋白的抗原性明显下降。其中，实验组α-LA、β-LG的抗原性抑制率分别为5％和2％。

实施例3

本实施例是实施例1基础上的优选方案，所用的原料的品质与实施例1相同，其中与实施例1相同的部分不再次重复，请参照实施例1。

所述步骤(2)中所述的复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶M的混合物，所述各个酶的重量份数比为：

进一步的，所述低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖的重量份数比为：

低聚麦芽糖 2

葡萄糖 1

磷酰基低聚糖 0.5。

具体抑制率结果参见图3。经本实施例制备方法得到的低敏性糖基化乳清蛋白水解物为实验组，不经处理的乳清蛋白为对照组。与对照组相比，实验组蛋白的抗原性明显下降。其中，实验组α-LA、β-LG的抗原性抑制率分别为35％和32％。

实施例4

本实施例是实施例1基础上的优选方案，所用的原料的品质与实施例1相同，其中与实施例1相同的部分不再次重复，请参照实施例1。

所述步骤(2)中所述的复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶M的混合物，所述各个酶的重量份数比为：

进一步的，所述低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖的重量份数比为：

低聚麦芽糖 1

葡萄糖 3.5

磷酰基低聚糖 0.5。

具体抑制率结果参见图4。经本实施例制备方法得到的低敏性糖基化乳清蛋白水解物为实验组，不经处理的乳清蛋白为对照组。与对照组相比，实验组蛋白的抗原性明显下降。其中，实验组α-LA、β-LG的抗原性抑制率分别为30％和27％。

Claims (3)

1.一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)按照5～8％的重量比将乳清蛋白溶于水中，得到乳清蛋白溶液；

(2)水解：将所述乳清蛋白溶液的pH值调节至7.0～8.0，按照3000～5000U/g蛋白的比例加入复合酶，在55℃～75℃温度下，水解1～2h，得到水解乳清蛋白溶液；

(3)按照10～15％的重量比将糖溶解于上述水解乳清蛋白溶液中，配制成混合液，将所述混合液的pH值调至7.0～8.0，冷冻干燥得到蛋白糖混合物；

所述的糖是低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖的混合物，所述低聚麦芽糖、葡萄糖、磷酰基低聚糖的重量份数比为：

低聚麦芽糖 1

葡萄糖 2

磷酰基低聚糖 1；

(4)糖基化：将所述蛋白糖混合物在60％～70％相对湿度、55℃～65℃温度下，进行糖基化处理24h～48h，得到糖基化水解乳清蛋白；

(5)将上述糖基化水解乳清蛋白溶解于水中，透析除去未反应的糖和盐，再次冷冻干燥，即得到所述的低敏性糖基化乳清蛋白水解物；

步骤(2)中所述的复合酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶M的混合物，所述各个酶的重量份数比为：

2.根据权利要求1所述的低敏性糖基化乳清蛋白水解物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的乳清蛋白是浓缩乳清蛋白WPC-8000。

3.一种低敏性糖基化乳清蛋白水解物，其特征在于，所述低敏性糖基化乳清蛋白水解物是按照权利要求1或2所述低敏性糖基化乳清蛋白水解物的制备方法得到的水解物。