CN103966292A - 一种过敏原部分消除的适度水解酪蛋白肽工业化制造方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种过敏原部分消除的适度水解酪蛋白肽工业化制造方法及其应用，属于食品营养和生物技术领域。本发明以食品级酪蛋白为原料，采用复合酶解结合超滤工艺，制得适度水解酪蛋白肽粉。其平均分子量位于1500Da-3000Da之间，蛋白抗原性降低85％以上，主要过敏原α_s1-酪蛋白含量较酪蛋白降低95％以上。本发明制备的酪蛋白适度水解物与市场上其他蛋白水解物相比，不但致敏活性显著降低，而且苦味值较小，加工性能良好。可以作为新的功能性营养成分应用于普通食品、成年奶粉及食品、中老年奶粉及食品、婴幼儿配方奶粉及食品、运动功能食品、保健食品和药品，具有广阔的市场前景。

Description

一种过敏原部分消除的适度水解酪蛋白肽工业化制造方法及其应用

技术领域

本发明涉及以酪蛋白为原料，制备低致敏性酪蛋白适度水解物的工业化生产方法，产品可应用于普通食品、成年奶粉及食品、中老年奶粉及食品、婴幼儿配方奶粉及食品、运动功能食品、保健食品和药品，属生物技术领域。

背景技术

牛乳是世界上最主要的乳蛋白来源，牛乳因营养价值高而成为人类消费量最大的蛋白质资源之一，其最主要的营养功效体现在婴幼儿配方食品如作代母乳食品或老年人、病人的营养食品。同时，牛乳变态反应也是婴幼儿最常见的食物变态反应，存在于约2％-3％的婴幼儿中，可引发湿疹、瘙痒、皮疹、荨麻疹、水肿、、哮喘、咳嗽、过敏性鼻炎，有些患儿甚至还会出现急性过敏综合征，严重威胁着婴幼儿的身体健康。近年来，食物过敏的发病率呈上升趋势，婴幼儿的食物过敏发病率已高达6％-8％。因此，开发低敏牛乳蛋白配方对于改善和促进婴幼儿的营养和生长发育具有重要的意义。

蛋白酶催化乳蛋白具有表位的片段水解，可显著的降低其抗原性，防止牛奶过敏。根据水解程度的不同，可分为适度水解和深度水解。适度水解配方是对牛奶蛋白进行适度的水解，利用蛋白酶切断肽链，使之成为小肽段，改变牛奶蛋白过敏原表位，降低蛋白的抗原性，但同时保留微量的抗原活性。由于保留了部分抗原性，婴儿持续少量牛奶过敏原的摄入可以诱导免疫耐受。因此，适度水解配方常被推荐用于婴幼儿食物过敏的预防、特异性高风险婴儿的初级干预以及牛奶过敏婴儿的免疫耐受治疗。研究表明，食用具有部分及广泛水解的婴幼儿配方可以有效的降低婴幼儿自身变态反应的风险。

适度水解蛋白的水解程度比完全水解蛋白的略低，但有效地避免了苦味等问题，同时保留易消化吸收、不过敏等优点。适度水解配方奶粉在营养价值、口感方面与普通牛奶配方大致相同，故可以作为初生婴儿的母乳替代品并可长期使用。目前市场上已有部分水解配方销售，但大部分都基于乳清蛋白，酪蛋白的适度水解产品很少。目前乳蛋白水解产物普遍存在着原料来源单一、肽段控制困难、生产规模不大、致敏活性难以消除、特征肽段不清等方面的不足。

CN10163409A公开了生产蛋白质部分水解物的方法及含有水解物的婴儿配方，发明涉及的原料是乳清蛋白和酪蛋白的混合物。CN1596676A采用固定化酶结合离子调控蛋白质结构选择性水解过敏原蛋白，有效地控制水解程度，防止了苦味产生，但是原料依然是乳蛋白组分。CN101297674A中国农业大学罗永康则直接采用乳清蛋白进行复合水解，抗原性可降低90％以上。

在牛乳蛋白酶解过程中，控制水解产物的分子量尤其是肽链长度对于消化吸收来说是至关重要的。当牛乳蛋白水解后的肽分子量变小时，致敏活性也基本消失，但是蛋白质在水解达到一定程度时会产生苦味。CN102379359A提供了一种酶法水解酪蛋白的方法，其中是利用复合酶技术水解酪蛋白降低其过敏原含量， 水解产物吸收性好，且过敏原含量低，与原料相比过敏原含量降低99％以上。但是该发明未采用超滤等工艺手段进行处理，单纯的酶解并不能消除所有的大分子蛋白组分。

英国专利1595499，通过与稀硫酸一起煮沸来水解酪蛋白并将其喷雾干燥，产物无色、无气味。但是工艺使用无机酸，操作危险且工艺复杂，产物中可能引起氨基酸消旋作用产生有毒成分，难以进行工业化生产。

综上，经检索没有发现采用复合酶解结合超滤技术开发适度水解酪蛋白肽工业化制造方法的报道。

发明内容

本发明的目的提供一种制备低致敏性酪蛋白肽适度水解物的工业化生产方法。

本发明的另一个目的是提供一种低致敏性的酪蛋白适度水解物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

该发明以食品级分离酪蛋白为原料，蛋白含量应不低于80％，按6-12％的重量比将酪蛋白溶于水中，然后在80℃-95℃加热10-20min，降温至温度45～55℃，得酪蛋白溶液。

为避免调节pH值引入矿物盐，影响酪蛋白水解液渗透压，本发明采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行直接复合酶解，酪蛋白溶液无需调整pH值。按每克蛋白质2000～5000单位酶量加入蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的添加比例为1∶1，在温度50-55℃条件下水解2-5h。最后，将酶解液加热到115℃，灭酶10-15min。

酪蛋白酶解液用管式离心机离心，转速12000～16000r/min，留用离心清液，用孔径0.05～0.1μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.2～0.4MPa，温度30～80℃。透过液用双效降膜蒸发器蒸发，直到浓缩液的固含量为20～50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40～80℃。

按照浓缩液含量5％的比例加入活性碳粉进行脱色，加热到80℃，保温搅拌20～40min，然后采用卷式纳滤膜过滤。酪蛋白酶解浓缩液用离心喷雾干燥器进行干燥处理，条件为进口温度160～180℃，出口温度80～90℃，最后制成酪蛋白适度水解肽粉。

为了监控水解程度，可采用甲醛滴定法测定酪蛋白水解产物的水解度DH，其中可通过氢氧化钠滴定而评估蛋白水解期间游离氨基的增加量。酪蛋白水解产物的水解度为5％-12％之间。制备的适度水解酪蛋白肽粉经过化学成分分析确定基本的理化成分，并通过高效液相色谱检测适度水解酪蛋白肽粉成分的分子量分布，发现平均分子量位于1500Da-3000Da之间，且5000Da以下的占90％以上。

水解产物残留的抗原性及主要过敏原α_s1-酪蛋白含量通过酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。将水解产物得到的结果与用未被水解的酪蛋白原料得到的结果进行比较，本发明水解产物的抗原性较原料酪蛋白降低85％以上，主要过敏原α_s1-酪蛋白含量下降95％以上。

通过该方法生产的适度水解酪蛋白肽粉，消除了其大部分致敏活性，在营养价值、口感方面与普通牛 奶配方大致相同，且更易于消化吸收，可应用于普通食品、成年奶粉及食品、中老年奶粉及食品、婴幼儿配方奶粉及食品、运动功能食品、保健食品和药品等领域。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。其具体工艺路线由以下步骤构成：

1.适度水解酪蛋白肽粉的制备

将500kg酪蛋白粉加入反应罐中，以10％的重量比用水与酪蛋白混配调浆，加热至85℃，并保温搅拌20min。将温度降至50℃，按每克蛋白质3500单位酶量加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，温度50℃，酶解3.5小时。然后，将酶解液加热到115℃，灭酶10min。

用管式离心机将酶解液离心，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液。将清液用孔径0.06μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.3MPa，温度55℃，制得澄清的水解酪蛋白肽透过液。

用双效降膜蒸发器将上述透过液蒸发，直到浓缩液的固含量为40％，条件为蒸汽压0.1MPa，温度60℃。按照酪蛋白肽浓缩液总固含量5％的比例加入活性碳粉脱色，加热到80℃，保温搅拌半小时后，过滤。

用喷雾干燥器将浓缩液进行干燥处理。干燥条件设为进口温度170℃，出口温度85℃。最后，制得384.55kg酪蛋白适度水解肽粉。

2.适度水解酪蛋白肽粉的理化组成和分子量分布分析

适度水解酪蛋白肽粉的成分分析结果见表1，从中可以看出本发明制备的适度水解酪蛋白肽粉总蛋白质含量高达95％，具有很高的产品质量。采用甲醛滴定法测定酪蛋白水解产物的水解度DH为7％，将适度水解酪蛋白肽粉样品于GEL-HPLC中进样以后，得到其凝胶色谱图分析其分子量分布。用液相数据处理软件将适度水解酪蛋白肽粉的凝胶色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，得到样品的肽的相对分子质量及其分布范围。分子量越低，蛋白抗原性越小。本发明用峰面积归一化法计算了适度水解酪蛋白肽粉的相对分子质量分布范围，如表2所示。由分子量分布结果可以看出，适度水解酪蛋白肽粉平均分子量为1826Da，90％以上的肽段分子量小于5000Da。同时，分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值和生理功能，本发明小于1000Da分子量的肽段含量也高达56％。本发明通过超滤酶解技术优化肽段控制工艺，产品极大地消除致敏活性的同时可以保持良好的口感避免苦味的产生。

表1适度水解酪蛋白肽粉的基础理化成分数据

项目	含量/％
		总蛋白质(干基)	95.3±0.47
脂肪	0.15±0.05
		灰分	2.56±0.31

[0029] 表2适度水解酪蛋白肽粉分子量分布结果

3.适度水解酪蛋白肽粉抗原性测定

本发明采用间接竞争ELISA方法测定适度水解酪蛋白肽粉中残余的抗原性，步骤如下：

用包被液稀释酪蛋白抗原，100μL/孔加入酶标板中，4℃过夜。加封闭液进行封闭，每孔100μL，37℃放置1h。加入100μL PBS稀释的肽粉溶液和一定量稀释的兔血清，不加抗原孔作为无竞争反应体系，37℃放置2h。倾去孔内的液体，用250μL/孔清洗液4次洗板，甩干。用封闭液将HRP-羊抗兔IgG稀释，加入100μL/孔，37℃温育1h。用清洗液洗4次，甩干。加新鲜配制的TMB底物溶液100μL/孔，37℃暗处反应10min显示蓝色，加50μL/孔终止液以终止反应，颜色变黄，最后用酶联免疫检测仪双波长测定各孔的吸光值。

间接竞争ELISA中被测物和包被酪蛋白竞争与抗体结合，因此包被抗原与抗体生成复合物的量与被测物中抗原量成反比，被测物的抗原性大小可用抗原残留量表示。结果显示，适度水解酪蛋白肽粉抗原性较酪蛋白降低88％以上。

4.适度水解酪蛋白肽粉中主要过敏原α_s1-酪蛋白含量

本发明中，水解产物的剩余α_s1-酪蛋白含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)确定，步骤如下：

向包被有α_s1-酪蛋白抗体的酶标板孔中加入100μl标准品及100μL PBS稀释的肽粉溶液，在37℃孵育1h。倒出孔中的液体，每孔加入250μl稀释后的洗涤缓冲液洗涤微孔。向每一个微孔中加入100μl稀释后的酶标抗体溶液，在37℃继续孵育1h。倒出孔中的液体，每孔加入250μl稀释后的洗涤缓冲液。向每一个微孔中加入50μl底物和50μl发色剂，充分混合后在室温(20-25℃)条件下暗处孵育10分钟。 向每一个微孔中加入100μl反应终止液，充分混合。在加入反应终止液后30分钟内于450nm处测量吸光度值。

调整加入的肽粉浓度，使其显色反应落入该试验中确定的线性剂量-反应范围内。水解产物中的α_s1-酪蛋白与特异性抗体结合，根据颜色变化来判断水解产物中过敏原蛋白含量。结果显示，酪蛋白中主要过敏原α_s1-酪蛋白含量为159074mg/kg，适度水解肽粉为265.73mg/kg，水解后消除了99％以上的过敏原成分，α_s1-酪蛋白含量较酪蛋白原料降低几百倍。

5.采用适度水解酪蛋白肽制备婴幼儿配方奶粉

本发明得到的适度水解酪蛋白肽消除了大部分其致敏活性，易吸收且富含多种活性成分，适用于中老年奶粉，并可作为普通食品配料应用于食品工业本产品，可应用于普通食品、成年奶粉及食品、中老年奶粉及食品、婴幼儿配方奶粉及食品、运动功能食品、保健食品和药品，本实例系详述本发明，但不限制本发明。婴幼儿配方奶粉制备过程如下：

适度水解酪蛋白肽粉250-350g，低反式脂肪酸植物油180g，葡萄糖110g，浓缩乳清蛋白粉40-60g，低聚半乳糖15g，花生四烯酸3g，乳糖115g，二十二碳六烯酸2g，核苷酸0.4g，维生素2g，叶黄素0.0005g，肌醇0.03g，胆碱1g，矿物质3.5g，将上述原料混合，使用60℃的纯净水按混合原料∶水＝1∶5的重量比例溶解混合均匀，其中将原料脂肪酸植物油加热至70℃后，与溶解混合液一起泵至储罐中搅拌，混合均匀，得到混合液；得到的混合液在板式或管式杀菌器中进行巴式杀菌，温度控制在85-90℃，时间40秒，在双效或三效蒸发器中浓缩，使干物质含量达到50-60％，随后在干燥塔内雾化、干燥成含水量2.5-3.5％的产品，该产品由流化床收集、冷却，由振动筛去除团块后置于容器中待检验包装。

Claims (6)

1.一种利用酪蛋白粉制备适度水解酪蛋白肽的工业化酶解方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1)将酪蛋白加入反应罐中，以100∶2～20(L∶kg)的液料比用水与酪蛋白粉混配调浆，加热至50～90℃，保温搅拌20～90min。

2)温度调至40～60℃，按每克蛋白质1000～8000单位酶量加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的添加比例为1∶1～1∶2，酶解2～6h。最后，将酶解液加热到120℃，灭酶10min。

2.根据权利要求1所述的适度水解酪蛋白肽的工业化制备方法，其特征在于酶解后的料液通过分离、浓缩、脱色和干燥等工艺制得适度水解酪蛋白肽粉，具体步骤如下：

1)用管式离心机将如权利要求1所述酪蛋白酶解液离心，转速9000～16000r/min，留用离心清液，用孔径0.05～0.1μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.2～0.4MPa，温度30～80℃，制得澄清的适度水解酪蛋白肽粉透过液，然后采用卷式纳滤膜过滤。

2)用双效降膜蒸发器将上述透过液蒸发，直到浓缩液的固含量为20～50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40～80℃。按照浓缩液含量5～10％的比例加入活性碳粉进行脱色，加热到70～95℃，保温搅拌20～40min。

3)用离心喷雾干燥器将上述适度水解酪蛋白肽粉浓缩液进行干燥处理，条件为进口温度160～180℃，出口温度80～90℃，制成适度水解酪蛋白肽粉。

3.根据权利要求1、2所述方法制备的适度水解酪蛋白肽粉，其特征在于平均分子量位于1500-3000Da之间，游离氨基酸含量低于5％，分子量小于5000Da以上的肽段占90％以上。

4.根据权利要求1、2所述方法制备的适度水解酪蛋白肽粉，其抗原性较酪蛋白应降低85％以上。

5.根据权利要求1、2所述方法制备的适度水解酪蛋白肽粉，其主要过敏原α_s1-酪蛋白含量应降低95％以上。

6.根据权利要求1、2所述方法制备的适度水解酪蛋白肽作为产品或原料在普通食品、成年奶粉及食品、中老年奶粉及食品、婴幼儿配方奶粉及食品、运动功能食品、保健食品和药品中的应用。