CN102379359A - 酶法水解酪蛋白的方法及水解产物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酶法水解酪蛋白的方法，其中是利用复合酶技术水解酪蛋白降低其过敏原含量，所述的方法包括步骤：将欲进行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液，先添加碱性蛋白酶进行水解，然后再添加胰蛋白酶进行水解，控制最终水解产物的水解程度为10％～20％。本发明还提供了按照所述的方法制备得到的酪蛋白水解产物。按照本发明的方法所得酪蛋白水解产物中分子量在180～1000Dal的寡肽含量为50～90％，该水解产物吸收性好，且过敏原含量低，与原料相比过敏原含量降低99％以上。

Description

酶法水解酪蛋白的方法及水解产物

技术领域

本发明是关于一种酶法水解酪蛋白的方法及水解产物，具体是关于一种利用复合酶技术水解酪蛋白以降低其过敏原含量的方法，以及根据该方法制备得到的水解产物。

背景技术

牛乳是优秀的营养食品，蛋白含量为3.0％～3.5％，其中酪蛋白(CN)含量较高，约占总蛋白的80％。酪蛋白主要有αs、β-、κ-CN，牛乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为80∶20，而人乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为60∶40，且人乳中不含αs-CN。由于牛乳与人乳中的蛋白组成不同，有很多人饮用了牛乳后会引起消化不良，甚至会产生过敏现象。

众所周知，自然界的蛋白质大多是由一条或者多条多肽链组成的，有的再与其它物质结合形成复合形式的蛋白质。在动物体的消化过程中，通过消化道中不同的蛋白水解酶将其分解成肽和氨基酸。肽的分子量一般在10000以下，分子量段在5000～10000之间的称为大肽，分子量段在1000～180之间的称为小肽、寡肽、低聚肽或称为小分子活性多肽。从消化吸收的角度考虑，理想的酶解产物以寡肽含量较多为宜，即目标产物是分子量在1000～180的肽。

最早的婴儿抗过敏食品是以乳酪蛋白为蛋白源，通过酶的处理将其水解为分子量在1000以下的肽和氨基酸的混合物，但是由于酶法水解过程很难按照人的设计去发展，酶解时并不是按照从大到小的顺序去切割蛋白，所以有的水解物中有时游离氨基酸很高，而寡肽的含量却很少。此外，研究表明，过敏原含量高低与分子量的大小并没有直接的关系，并非分子量越小，过敏原含量就低。

目前在酶法水解酪蛋白的研究中，可以通过选择合适的蛋白酶、控制酶解工艺条件等措施来实现不同的目的，比如降低水解产物的致敏性，获得目标功能性肽等，使水解产物具有所期望的性能及组成。

CN1011008027A公开了一种利用碱性蛋白酶对牛乳酪蛋白进行水解制备磷酸肽和非磷酸肽的方法，以获得功能性原料；CN1566152A公开了一种利用胰蛋白酶水解酪蛋白制备多种功能活性肽的方法；CN1105818A公开了一种利用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶复合水解乳蛋白降低其抗原含量的方法，该方法水解底物为乳清蛋白和酪蛋白混合物，其中乳清蛋白占到50％以上。

孙浩等人在“碱性蛋白酶对酪蛋白水解的最适宜条件”(《大连轻工业学报》，2003，Vol.22，No.1)中公开了以Folin-酚法测定OD值间接表征水解度，优化出碱性蛋白酶水解酪蛋白最优工艺条件为：水解温度55℃，pH值为8.0，酪蛋白底物浓度为6％，碱性蛋白酶与酪蛋白最适质量比为7％；但是该正交实验结果中并没有包含最优方案，且未对其水解结果及水解物特征进行详细描述。

孔芳等人对枯草杆菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的条件进行了研究(“枯草杆菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的条件研究”，《湖南农业科学》，2009，No.6)，枯草杆菌碱性蛋白酶(Alacalase)是一种碱性内切酶，能较专一切断由芳香族氨基酸形成的肽键，而使芳香族氨基酸游离于肽链的末端。孔芳等人的研究是以水解度为指标得出水解优化工艺，并未描述其得到的水解产物的特性。

唐宁等人采用胃蛋白酶、胰蛋白酶对婴儿配方奶粉进行水解，通过动物实验得出经过水解的样品对小鼠的致敏作用均有所降低(“牛奶大分子蛋白的水解及其过敏原含量变化”，《中国临床药理学与治疗学》，2004年第9卷第12期)；张嘉芷等采用胰蛋白酶水解法改性酪蛋白的研究中所得酪蛋白分子量分布与乳清蛋白接近，因此可推断其寡肽含量并未达到50％(“酶法改性酪蛋白及婴儿配方乳粉的研究”，《食品工业科技》，1997年第2期)。

可以看出，目前酶解酪蛋白的研究主要集中在获得功能性活性肽以及获得较好的消化吸收效果等方面，而在深度水解酪蛋白并最大限度地降低其过敏原含量方面效果并不显著。在现有的酶法水解蛋白的过程中，除非采用膜滤的方法除掉水解物中部分游离氨基酸或者除掉部分大分子未水解的部分来达到低分子量物质含量高、游离氨基酸含量低的效果，其他的方法很难平衡以下几项：1、水解度适中；2、寡肽含量高，吸收性好；3、过敏原含量低，致敏性低；4、游离氨基酸含量低，渗透压低。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种酶法水解酪蛋白的方法，以使水解产物寡肽的含量较多，游离氨基酸含量较低，易于消化吸收，并最大限度地降低了过敏原含量。

本发明的另一目的在于提供一种酶法水解酪蛋白的水解产物，其中寡肽含量高、易于消化吸收，且具有低致敏性。

一方面，本发明提供了一种酶法水解酪蛋白的方法，主要利用碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合使用，在保证最低的酶用量的前提下，可对酪蛋白进行深度水解，并最大限度地降低了水解产物中过敏原含量，使水解产物与未被水解的酪蛋白原料相比过敏原含量降低了99％以上。

本发明所提供的酶法水解酪蛋白的方法，主要包括步骤：将欲进行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液，先添加碱性蛋白酶进行水解，然后再添加胰蛋白酶进行水解，控制最终水解产物的水解程度为10％～20％。

本发明中所用酪蛋白可以是通过本领域已知的方法得到的食品级酪蛋白，如酶凝酪蛋白、酸凝酪蛋白等。在本发明优选的实施方案中，可利用水，也可以利用缓冲溶液，优选利用缓冲溶液将酪蛋白溶解为5％～12％(w/w，按总固形物的含量计算)的蛋白溶液进行酶解，优选的酪蛋白溶液的浓度为8％～10％(除特别注明外，本发明中所述含量与比例均为重量含量与比例)。

根据本发明的具体实施方案，本发明是采用微生物蛋白酶对酪蛋白进行水解，更具体地，所述蛋白酶包括：碱性蛋白酶和胰蛋白酶。这些蛋白酶均可商购获得。

在确定所用蛋白酶之后，适合蛋白酶水解的pH值范围即可获知。本发明中即可将欲进行酶解的酪蛋白溶液的pH值调节到适合所用蛋白酶水解的值，适合碱性蛋白酶水解的pH值为8～10。调节pH值的调节剂可以采用所属领域中常用的调节剂，如NaOH溶液、HCl溶液等。

将酪蛋白溶液调节至适合酶解的温度，即可加入蛋白酶进行酶解。本发明中优选的酶解温度为50℃～60℃。

向酪蛋白水溶液中加入的蛋白酶的量一般根据所用酶的活性和酪蛋白溶液的性状来确定。本发明中，蛋白酶的活性以U(Unit)表示。一个U表示在最佳条件下，单位时间内(每分钟)水解酪蛋白释放出1g酪氨酸所需要的酶量。根据本发明的具体实施方案，复合蛋白酶的总添加量为每100mL酪蛋白溶液中添加酶活单位为10000～20000U，优选的实施方案中，添加的复合酶为12000～15000U/100mL酪蛋白溶液。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中是采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶依次添加进行水解，具体是先用碱性蛋白酶进行第一阶段水解，而后加入胰蛋白酶共同进行第二阶段水解。发明人在研究中发现，本发明所加入的复合酶中，碱性蛋白酶添加量及水解时间占优势的情况下，酪蛋白溶液的抗原含量降低的更为显著，同时水解后寡肽的含量也更多，利于消化吸收。根据本发明的优选实施方案，本发明中，碱性蛋白酶与胰蛋白酶的添加比例为9～0.5∶1(以酶活单位计)，优选为9～1∶1，更优选为8～1∶1。本发明中，胰蛋白酶的添加可以缩短整个酶解反应时间，并有利于控制水解度在适中的范围内。本发明以碱性蛋白酶和胰蛋白酶单酶水解酪蛋白试验结果为依据，以水解度作为第二阶段胰蛋白酶的添加标准，发现当碱性蛋白酶水解酪蛋白水解度控制在5％～10％左右时，再添加胰蛋白酶共同水解，此时水解效果最佳，抗原含量与酪蛋白原料相比降低了99％以上，并且酶添加量最少。本发明最终控制水解度在10％～20％左右(最终水解度大于碱性蛋白酶单独水解阶段的水解度)时，终止整个酶解过程。本发明在具体实施时，是先添加碱性蛋白酶50℃～60℃进行水解1～4小时(达到水解度5％～10％的要求)，然后再添加胰蛋白酶50℃～60℃进一步水解1～4小时(达到水解度10％～20％的要求)，且控制两个阶段水解时间共2～5小时。

根据本发明的具体实施方案，复合蛋白酶优选控制水解度达到10％～20％时，热灭活蛋白酶，终止酶解的进行。本发明中具体的热灭活温度为可控制为80℃～98℃，优选为85℃～95℃；热灭活时间5min～15min，优选为5min～10min。

灭活后迅速冷却到室温，即得到本发明的水解产物溶液，可将该水解产物溶液按照本领域的常规操作例如通过纳滤膜进行脱盐处理，最后通过喷雾干燥技术将水解产物制成水解粉的形式。

本发明中，采用高效液相色谱法对水解产物的分子量分布进行了测定。本发明的酪蛋白水解产物，其中分子量180～1000Dal的寡肽含量为50％～90％，游离氨基酸含量＜5％，本发明的水解产物易于消化吸收。

本发明中，水解产物的剩余抗原含量用酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。将未被水解的酪蛋白与特异性抗体结合，其浓度落入该试验中确定的线性剂量-反应范围内；水解产物制剂也类似的被结合，后续用酶标记物结合固定好的酪蛋白，添加TMB底物，根据颜色变化来判断是否有抗原性可识别的酪蛋白存在。以质量为基础将用水解产物得到的结果与用未被水解的酪蛋白原料得到的结果进行比较，然后计算水解产物的抗原性降低百分比。本发明水解产物的过敏原含量降低99％以上。在使水解产物具有良好吸收性的同时使其抗原性显著降低正是本发明的优点之一。

另一方面，本发明还提供了一种酪蛋白水解产物，其是按照本发明所述酶法水解酪蛋白的方法得到的水解产物。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酪蛋白水解产物中，分子量大于5000Dal的肽＜2％，分子量180～1000Dal的寡肽含量在50％～90％，分子量小于180Dal的游离氨基酸＜5％；过敏原含量与酪蛋白原料相比降低至少99％。

综上所述，利用本发明的酶解方法，可使水解产物同时实现水解度适中，寡肽含量高，游离氨基酸低，致敏性低，易于消化吸收。

具体实施方式

本以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的技术实质和所能产生的有益效果，不能理解为对本发明实施范围的限定。

实施例1

将酪蛋白用水溶解配制成8％的酪蛋白溶液，并用氢氧化钠将pH值调至8.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为9000U/100mL酪蛋白溶液，在50℃下水解1.0h后，水解度达到6.98％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为1000U/100mL酪蛋白溶液，在50℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1.0h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对本实施例的水解物进行分析得出：最终水解度达到11.23％，抗原含量由577663ppm降低到2835ppm，过敏原含量与酪蛋白原料相比降低99％以上；水解物分子量分布结果如表1。

表1  酶解产物的分子量分布

实施例2

将酪蛋白用水溶解配制成10％的酪蛋白溶液，并将pH值调至8.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为14400U/100mL酪蛋白溶液，在60℃下水解2.0h后，水解度达到6.12％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为3600U/100mL酪蛋白溶液，在60℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1.0h，然后在98℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对水解物分析得出：水解度为13.37％，抗原含量由721913ppm降低到3533.1ppm；水解物分子量分布结果如表2。

表2  酶解产物的分子量分布

实施例3

将酪蛋白用磷酸盐缓冲液溶解配制成8％的酪蛋白溶液，并将pH值调至9.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为9100U/100mL酪蛋白溶液，在55℃下水解3.5h后，水解度达到9.89％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为3900U/100mL酪蛋白溶液，在55℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1.0h，然后在98℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对水解物分析得出：水解度达到18.81％，抗原含量由577663ppm降低到1064.2ppm；水解物分子量分布结果如表3。

表3  酶解产物的分子量分布

实施例4

将酪蛋白用水溶解配制成5％的酪蛋白溶液，并将pH值调至8.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为10500U/100mL酪蛋白溶液，在50℃下水解3.5h后，水解度达到8.21％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为4500U/100mL酪蛋白溶液，在50℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1.5h，然后在98℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对水解物分析结果如下：水解度达到15.67％，抗原含量由358076ppm降低到1271.9ppm；水解物分子量分布结果如表4。

表4  分子量分布结果

实施例5

将酪蛋白用水溶解配制成12％的酪蛋白溶液，并将pH值调至8.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为12000U/100mL酪蛋白溶液，在55℃下水解2.0h后，水解度达到8.97％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为8000U/100mL酪蛋白溶液，在55℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1.5h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对水解物进行分析结果如下：水解度达到16.79％，抗原含量从854029ppm下降到3280.1ppm；肽分子量分布如表5。

表5  分子量分布结果

实施例6

将酪蛋白用水溶解配制成6％的酪蛋白溶液，并将pH值调至9.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为7200U/100mL酪蛋白溶液，在60℃下水解1.5h后，水解度达到5.45％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为4800U/100mL酪蛋白溶液，在60℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1.5h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对水解物进行分析结果如下：水解度达到10.23％，抗原含量从430048ppm下降到2265.2ppm；肽分子量分布如表6。

表6  分子量分布结果

实施例7

将酪蛋白用水溶解配制成8％的酪蛋白溶液，并将pH值调至9.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为7000U/100mL酪蛋白溶液，在60℃下水解2.5h后，水解度达到9.17％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为7000U/100mL酪蛋白溶液，在60℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解2h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对水解物进行分析结果如下：水解度达到17.56％，抗原含量从577663ppm下降到1163.4ppm；肽分子量分布如表7。

表7  分子量分布结果

实施例8

将酪蛋白用水溶解配制成9％的酪蛋白溶液，并将pH值调至10.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为8500U/100mL酪蛋白溶液，在60℃下水解4h后，水解度达到7.86％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为8500U/100mL酪蛋白溶液，在60℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本实施例的水解物。

对水解物进行分析结果如下：水解度达到14.98％，抗原含量从639871ppm下降到1931.5ppm；肽分子量分布如表8。

表8  分子量分布结果

从以上实施例1～8的过敏原含量降低情况来看，利用本发明的方法酶解酪蛋白溶液，过敏原含量可以降低到酪蛋白原料的99％以上，过敏原含量降低十分显著。

对比例1：复合蛋白酶水解试验结果

将酪蛋白用水溶解配制成8％的酪蛋白溶液，并将pH值调至9.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的添加量分别为7000U/100mL酪蛋白溶液，在60℃下水解4.5h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本对比例的水解物。

对该水解物进行检测，水解度为5.57％，抗原含量从577663ppm下降到70993.7ppm。

对比例2

将酪蛋白用水溶解配制成9％的酪蛋白溶液，并将pH值调至10.0；向上述酪蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为3400U/100mL酪蛋白溶液，在60℃下水解4h后，水解度达到6.79％；然后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶添加量为13600U/100mL酪蛋白溶液，在60℃、胰蛋白酶与先前添加的碱性蛋白酶共同作用下继续水解1h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本对比例的水解物。

对该水解物进行检测，水解度为10.23％，抗原含量从639871ppm下降到41950.0ppm。

对比例3

将酪蛋白用水溶解配制成12％的酪蛋白溶液，并将pH值调至8.0；向上述酪蛋白溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的添加量为12000U/100mL酪蛋白溶液，在55℃下水解2.0h后，水解度达到4.31％；然后加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶添加量为8000U/100mL酪蛋白溶液，在55℃、碱性蛋白酶与先前添加的胰蛋白酶共同作用下继续水解1.5h，然后在95℃水浴灭酶活10min，制得本对比例的水解物。

对该水解物进行检测，水解度为8.51％，抗原含量从854029ppm下降到47509.2ppm。

Claims (10)

1.一种酶法水解酪蛋白的方法，该方法包括步骤：

将欲进行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液，先添加碱性蛋白酶进行水解，然后再添加胰蛋白酶进行水解，控制最终水解产物的水解程度为10％～20％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的总添加量为10000～20000U/100mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，碱性蛋白酶与胰蛋白酶的添加比例为9～0.5∶1。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酪蛋白溶液的浓度为5％～12％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，先添加碱性蛋白酶进行水解，当水解程度为5％～10％时，再添加胰蛋白酶进行水解。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，水解初始pH值8.0～10.0，先添加碱性蛋白酶50℃～60℃进行水解1～4小时，然后再添加胰蛋白酶50℃～60℃进行水解1～4小时，且控制水解时间共2～5小时。

7.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括热灭活蛋白酶以终止水解的步骤；所述灭活温度80℃～98℃，时间5min～15min。

8.根据权利要求1所述的方法，该方法包括步骤：

将酪蛋白溶解，配制5％～12％的酪蛋白溶液；

将酪蛋白溶液的pH值调节到8.0～10.0；

在50℃～60℃条件下，于酪蛋白溶液中添加碱性蛋白酶进行水解1～4小时，待水解度达到5％～10％时，再向酶解液中添加胰蛋白酶进行复合酶水解1～4小时；

当水解度达到要求时，热灭活蛋白酶，灭活温度为80℃～98℃，时间5min～15min。

9.一种酪蛋白水解产物，其是按照权利要求1～8中任意一项所述酶法水解酪蛋白的方法得到的水解产物。

10.根据权利要求9所述的酪蛋白水解产物，该水解产物中分子量大于5000Dal的肽＜2％，分子量180～1000Dal的寡肽含量在50％～90％，分子量小于180Dal的游离氨基酸＜5％；过敏原含量与酪蛋白原料相比降低至少99％。