CN116268174B - 一种低苦味的酪蛋白酶解物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低苦味的酪蛋白酶解物及其制备方法与应用。该酪蛋白酶解物的制备方法包括以下步骤：将酪蛋白加入水中，分散均匀，得到酪蛋白分散液；调节酪蛋白分散液pH为6.0‑9.0，加入适量蛋白酶进行限制性酶解；灭酶，离心，取上清液进行干燥得到所述酪蛋白酶解物。该方法通过限制性酶解技术控制酶解物中以碱性氨基酸为羧基端的肽，有60％以上长度小于10个氨基酸残基；以疏水性氨基酸为羧基端的肽，有50％以上长度大于或等于10个氨基酸残基，水解度不超过8.5％，苦味相对于同水解度下其他方法制备得到产物显著降低，可以广泛应用于功能性食品或保健品中。
Description
技术领域
本发明属于乳制品及食品生物技术领域，具体涉及一种低苦味的酪蛋白酶解物及其制备方法与应用。
背景技术
牛乳中富含蛋白质、钙、维生素A、维生素D和维生素B2等营养物质，是世界范围内最古老而流行的食品之一。每升牛乳大约含有35克蛋白质，其中80％为酪蛋白。利用酶对牛乳酪蛋白进行水解能够得到具有降血糖、降血压、抗氧化及促矿物质吸收等生物活性的酪蛋白酶解物，已被应用于功能性食品及保健品中。然而，酶解过程中释放的苦味肽会使得酪蛋白酶解物产生不同程度的苦味，限制其实际应用。
关于酶解物的脱苦，国内外已有众多研究，提供了多种脱苦方法，如分离法、掩盖法、微生物发酵法及外切酶酶解法等(丁建明,谢小冬,宋礼,纪银莉.酶解蛋白产物脱苦技术研究进展[J].粮食与油脂,2012,25(08):5-7.)。其中，利用活性碳(专利CN202211080801.4、专利CN201710070900.7)或柱分离(专利CN201910172267.1)的方法将酶解物中的疏水性组分除去，可以显著降低其苦味，但同时也会除去大量活性肽，降低其生物活性。掩盖法(专利CN201911354538.1、专利CN201810283751.7)主要是使用一些苦味掩盖剂包裹苦味肽阻止其与苦味受体结合，常见的苦味掩盖剂有环糊精和改性淀粉。微生物发酵法(专利CN201610701720.X)则是通过对酶解液发酵使其中苦味肽含量减少，细菌、霉菌以及酵母都可作为脱苦微生物，但这两类方法将引入其他成分，限制酶解物的工业应用。外切酶酶解法(专利CN202210409141.3)通过切割苦味肽末端的疏水性氨基酸达到脱苦目的，但是会导致大量游离氨基酸的产生，使产物产生不必要的鲜味，并且可能降低产物中肽的比例，导致生物活性下降。
综上，目前关于酶解物的各类脱苦方法在应用上均有一定的局限性。因此，开发一种在制备过程中不引入其他成分，不损失活性肽含量的低苦味酶解物制备方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种低苦味的酪蛋白酶解物及其制备方法与应用。
本发明提供了一种低苦味的酪蛋白酶解物，酶解物中，以碱性氨基酸为羧基端肽，有60％以上长度小于10个氨基酸残基；以疏水性氨基酸为羧基端的肽，有50％以上长度大于或等于10个氨基酸残基，水解度不超过8.5％。
本发明提供了一种低苦味的酪蛋白酶解物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将酪蛋白加入水中，分散均匀，得到酪蛋白分散液；
(2)调节步骤(1)所述酪蛋白分散液pH为6.0-9.0，加入蛋白酶进行限制性酶解，灭酶，得到酶解物；
(3)将步骤(2)所述酶解物离心，取上清液；
(4)将步骤(3)所述上清液进行冷冻干燥得到所述酪蛋白酶解产物。
进一步地，步骤(1)所述酪蛋白优选蛋白含量在85％以上的由牛乳分离纯化得到的酪蛋白。
进一步地，步骤(1)所述酪蛋白分散液的浓度为8％-15％(w/w)。
进一步地，步骤(2)所述蛋白酶由酶A与酶B复配而成。所述酶A为特异性切割碱性氨基酸羧基端的内切蛋白酶，如胰蛋白酶；所述酶B为能够切割疏水性氨基酸羧基端的内切蛋白酶，包括但不限于碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶。
进一步地，所述酶A与酶B的质量比为1:1-1:3。
进一步地，步骤(2)所述蛋白酶(包括酶A和酶B)的总加入量为酪蛋白质量的0.005％-0.05％，以控制水解度小于8.5％。
进一步地，步骤(2)所述酶解的温度为30-60℃，酶解的时间为3-6h。
进一步地，步骤(2)所述灭酶的温度为90-100℃，时间为15-30min。
进一步地，步骤(3)所述离心的离心力为8000-10000×g，离心时间为10-30min，离心温度为4-25℃。
本发明提供的上述制备方法制备得到的酪蛋白酶解物具有低苦味的特点，在功能性食品及保健品中有很好的应用前景。
本发明提供的一种低苦味的酪蛋白酶解物的制备方法中，酶A为特异性切割碱性氨基酸末端的内切酶，由酶A释放的羧基端为碱性氨基酸的肽被酶B水解为长度更短的肽。同时，相比单一酶酶解法来说，复配酶解达到相同的水解度所需的B酶浓度更低，因此由B酶释放的羧基端为疏水性氨基酸的肽长度更长。这样的酶解特征使得本发明方法制得的酶解物相对于相同水解度下其他方法制备得到的产物中羧基端为碱性氨基酸的肽长度更短，羧基端为疏水性氨基酸的肽长度更长。对于羧基端为碱性氨基酸的肽来说，短肽比长肽对酶解物苦味的贡献更大，而对于羧基端为疏水性氨基酸的肽来说，长肽比短肽对酶解物苦味的贡献更大。因此，这样的肽段特征(即羧基端为碱性氨基酸的肽长度短、羧基端为疏水性氨基酸的肽长度长)使得该酶解物在相似水解度水平下苦味值更低。同时，本发明使用的酶A和酶B的最适宜酶解温度、最适宜pH范围都有重叠，这使得本发明的制备方法仅需一步酶解，无需在过程中多次调节酶解环境。此外，相比于现有技术所使用外切酶脱苦，内切酶的使用限制了游离氨基酸的产生，因此产物中活性肽的比例能够得到保证。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明通过限制性酶解控制产物中肽段组成特征，产物的苦味较低，有利于其在功能性食品或保健品中的应用。
(2)本发明提供的制备方法，无需脱苦步骤，不造成活性成分的损失，不引入其他成分，安全，无毒副作用。
(3)本发明提供的制备方法，仅需一步酶解，酶解过程的条件温和可控，工艺简单，设备要求低，具有较好的工业化前景。
附图说明
图1为实施例和对比例的酪蛋白酶解物中羧基端为碱性氨基酸的肽长度分布图；
图2为实施例和对比例的酪蛋白酶解物中羧基端为疏水性氨基酸的肽长度分布图；
图3为实施例和对比例的酪蛋白酶解物苦味值图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若未有特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
本发明中，酶解物水解度、肽序列和苦味的测定方法如下：
(1)水解度测定
①OPA配制：将1.905g四硼酸钠和50mg SDS用40mL去离子水溶解，再加入40mg OPA(乙醇溶解)和44mg DDT，定容至50mL。
②向紫外96孔板中加入32μL样品/去离子水/丝氨酸标品，用排枪加入240μL OPA后震
荡均匀，反应2min后测定340nm处的吸光值。
③水解度的计算公式如下：
其中，htot为总肽键数，酪蛋白htot值为8.2。h为被水解肽键数，由以下公式得到：
其中酪蛋白α＝1.039，β＝0.383，Serine-NH2为丝氨酸当量，由以下公式得到：
其中，Asample为样品的吸光值，Astandard为丝氨酸标准品的吸光值，Ablank为去离子水的吸光值，0.9516为丝氨酸标准品的浓度，C为样品蛋白质量浓度(mg/mL)。
(2)肽序列鉴定
使用Waters Acquity UPLC系统(Waters Corporation,MA)与Impact II ESI-QTOF质谱(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)联用进行肽的鉴定。质谱参数如下：电离源为正离子模式，干燥气流流速与温度为8L/min与200℃，毛细管电压为1.5bar，扫描范围为100-1500m/z。UPLC系统使用的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3column(2.1mm×100mm,1.8μm,)。液相色谱条件如下：流动相A为含有0.1％甲酸的超纯水，流动相B为乙腈，流动相流速为0.2mL/min，进样量为2μL。梯度洗脱程序如下：0-10min，5-40％B；10-12min，40-90％B；12-14min，90％B；14-15min，90-5％B；15-18min，15％B。6肽以上的肽通过Mascot(Matrix Science Ltd.,London,U.K.)数据库鉴定，6肽及以下的肽使用DataAnalysis 4.4(Bruker Daltonics)辅助de novo手动解析得到。
(3)苦味值测定
将酶解物冻干粉在水中稀释成2％的溶液，用3位随机数编码，8名感官评定小组成员在室温下按随机顺序品尝样品。苦味使用非结构化连续直线标度进行评定，直线左端为无苦味(0，酪蛋白为参考)，右端为非常苦(5，DH＝13％酪蛋白木瓜蛋白酶酶解物为参考)。
实施例1
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.8，加入质量为蛋白质量0.012％的胰蛋白酶、以及加入质量为蛋白质量0.015％的alcalase碱性蛋白酶，在55℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为7.4％，苦味测定结果如图3，苦味值为0.87。
实施例2
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.8，加入质量为蛋白质量0.007％的胰蛋白酶、以及加入质量为蛋白质量0.02％的alcalase碱性蛋白酶，在55℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为7.6％，苦味测定结果如图3，苦味值为1.12。
实施例3
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.5，加入质量为蛋白质量0.01％的胰蛋白酶、以及加入质量为蛋白质量0.025％的NS37071碱性蛋白酶，在53℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为8.4％，苦味测定结果如图3，苦味值为1.49。
实施例4
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.5，加入质量为蛋白质量0.004％的胰蛋白酶、以及加入质量为蛋白质量0.005％的NS37071碱性蛋白酶，在53℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为5.5％，苦味测定结果如图3，苦味值为0.50。
实施例4与实施例3相比，酶A和酶B的用量都减少了，最终得到的酶解物苦味值明显降低。这是因为对于同一种酶来说，酶用量越多，苦味值会更重，因此在满足限制性酶解程度的前提下应当合理控制加酶量。
对比例1
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.5，加入质量为蛋白质量0.04％的胰蛋白酶，在37℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为7.7％，苦味测定结果如图3，苦味值为3.09。
对比例2
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至8，加入质量为蛋白质量0.04％的alcalase碱性蛋白酶，在55℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为7.8％，苦味测定结果如图3，苦味值为1.60。
对比例3
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.3，加入质量为蛋白质量0.008％的胰蛋白酶、以及加入质量为蛋白质量0.08％的风味蛋白酶，在50℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为7.5％，苦味测定结果如图3，苦味值为2.11。
对比例4
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.8，加入质量为蛋白质量0.02％的胰蛋白酶、以及加入质量为蛋白质量0.007％的alcalase碱性蛋白酶，在55℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为8.2％，苦味测定结果如图3，苦味值为2.85。
对比例5
(1)将酪蛋白以10％(w/w)分散于去离子水中，得到酪蛋白分散液；
(2)将步骤(1)中酪蛋白分散液pH调至7.5，加入质量为蛋白质量0.025％的胰蛋白酶、以及加入质量为蛋白质量0.03％的NS37071碱性蛋白酶，在53℃下酶解4h，沸水浴15min灭酶。
(3)在8000×g，4℃下离心15min，取上清液干燥，得到酪蛋白酶解物，水解度为9.07％，苦味测定结果如图3，苦味值为3.61。
图1为本发明实施例1-4与对比例1、对比例3-5中酪蛋白酶解物中羧基端为碱性氨基酸的肽长度分布图，图中以“2-4”、“5-9”、“10-14”、“15-30”来表示不同数量的氨基酸残基。可以看出，实施例中该类型肽长度小于10个氨基酸残基的占比超过60％，整体长度小于对比例。相比于仅使用酶A(胰蛋白酶)的对比例1、改变复合酶(酶A+酶B)种类和用量的对比例3、以及仅改变复合酶(酶A+酶B)质量比例的对比例4，使用本发明提供的复合酶酶解法能够在相似的水解度水平下显著降低羧基端为碱性氨基酸的肽段长度。
图2为本发明实施例1-4与对比例2-5中酪蛋白酶解物中羧基端为疏水性氨基酸的肽长度分布图，图中以“2-4”、“5-9”、“10-14”、“15-30”来表示不同数量的氨基酸残基。可以看出，实施例中该类型肽长度大于10个氨基酸残基的占比超过50％，整体长度大于对比例。相比于仅使用酶B(alcalase碱性蛋白酶)的对比例2、改变复合酶(酶A+酶B)种类和用量的对比例3、仅改变复合酶(酶A+酶B)质量比例的对比例4、以及仅改变复合酶(酶A+酶B)用量的对比例5，使用本发明提供的复合酶酶解法能够在相似的水解度水平下增加羧基端为疏水性氨基酸的肽段长度。虽然对比例5中羧基端为碱性氨基酸的肽长度小于10个氨基酸残基的占比超过60％，与实施例相当，但其羧基端为疏水性氨基酸的肽显著较短(图1)。因此，为控制酶解物中的肽段同时满足权利要求中的两个特征，应限定酶的种类、用量及质量比例在合适范围。
图3为本发明实施例1-4与对比例1-5中酪蛋白酶解物苦味值图。可以看出，实施例所得到的酪蛋白酶解物的苦味值远低于对比例的苦味值，说明本发明方法得到的酪蛋白酶解物对苦味有显著改善。这是因为：对于羧基端为碱性氨基酸的肽来说，短肽比长肽对酶解物苦味的贡献更大，而对于羧基端为疏水性氨基酸的肽来说，长肽比短肽对酶解物苦味的贡献更大。因此，实施例所得酪蛋白酶解物更低的苦味值是由其肽段特征所决定的。由图1-图2可知，肽段特征与酶解工艺有关。为实现本发明复配使用的效果，酶的种类、用量及质量比例是至关重要的，改变复合酶的种类、用量及质量比例都将影响效果。
上述实施例为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种低苦味的酪蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将酪蛋白加入水中，分散均匀，得到酪蛋白分散液；
（2）调节步骤（1）所述酪蛋白分散液pH为7.5-9.0，加入蛋白酶进行限制性酶解，灭酶，得到酶解物；
（3）将步骤（2）所述酶解物离心，取上清液；
（4）将步骤（3）所述上清液进行冷冻干燥得到所述酪蛋白酶解物；所述酶解物中，以碱性氨基酸为羧基端肽，有60%以上长度小于10个氨基酸残基；以疏水性氨基酸为羧基端的肽，有50%以上长度大于或等于10个氨基酸残基，水解度不超过8.5%；
步骤（2）所述蛋白酶由酶A和酶B复配而成；所述酶A为胰蛋白酶；所述酶B为碱性蛋白酶或中性蛋白酶；所述酶A与酶B的质量比为1:1-1:3；所述酶A为酪蛋白质量的0.004%-0.012%；所述碱性蛋白酶为酪蛋白质量的0.015%-0.02%；所述中性蛋白酶为酪蛋白质量的0.005%-0.025%；所述酶解的温度为53-60℃，酶解的时间为3-6 h。
2.根据权利要求1所述的低苦味的酪蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述酪蛋白选自蛋白含量在85%以上的由牛乳分离纯化得到的酪蛋白；步骤（1）所述酪蛋白分散液的浓度为8%-15%（w/w）。
3.根据权利要求1所述的低苦味的酪蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述灭酶的温度为90-100℃，时间为15-30 min。
4.根据权利要求1所述的低苦味的酪蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述离心的离心力为8000-10000×g，离心时间为10-30 min，离心温度为4-25℃。
5.权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的低苦味的酪蛋白酶解物，其特征在于，所述酶解物中，以碱性氨基酸为羧基端肽，有60%以上长度小于10个氨基酸残基；以疏水性氨基酸为羧基端的肽，有50%以上长度大于或等于10个氨基酸残基，水解度不超过8.5%。
6.权利要求5所述的一种低苦味的酪蛋白酶解物在功能性食品及保健品中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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