JPS5838149B2 - コレステロ−ル定量用酵素の精製方法 - Google Patents
コレステロ−ル定量用酵素の精製方法Info
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- JPS5838149B2 JPS5838149B2 JP53045889A JP4588978A JPS5838149B2 JP S5838149 B2 JPS5838149 B2 JP S5838149B2 JP 53045889 A JP53045889 A JP 53045889A JP 4588978 A JP4588978 A JP 4588978A JP S5838149 B2 JPS5838149 B2 JP S5838149B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、コレステロール定量用酵素の精製方法に関す
るものであり、更に詳細には、シュードモナス属に属す
る微生物を培養して生産されるコレステロール・オキシ
ダーゼ（以下Ｃ．０．と略する）およびコレステロール
・エステラーゼ（以下Ｃ．Ｅ．と略する）をそれぞれ単
独にあるいはＣ．Ｏ．とＣ．Ｅ．の混合物を分別精製す
る方法に関するものである。
るものであり、更に詳細には、シュードモナス属に属す
る微生物を培養して生産されるコレステロール・オキシ
ダーゼ（以下Ｃ．０．と略する）およびコレステロール
・エステラーゼ（以下Ｃ．Ｅ．と略する）をそれぞれ単
独にあるいはＣ．Ｏ．とＣ．Ｅ．の混合物を分別精製す
る方法に関するものである。
Ｃ．Ｅ．は、コレステロール・エステルを分解してコレ
ステロールと脂肪酸を生成する酵素であり、Ｃ．Ｏ．は
コレステロールを酸化してコレスト−４−エンー３−オ
ンと過酸化水素を生成する酵素である。
ステロールと脂肪酸を生成する酵素であり、Ｃ．Ｏ．は
コレステロールを酸化してコレスト−４−エンー３−オ
ンと過酸化水素を生成する酵素である。
従来、血中のコレステロールは硫酸、氷酢酸などを使用
した化学法によって定量が行われていたが、反応操作が
煩雑でしかも硫酸、氷酢酸といった腐触性や刺激臭の強
い試薬を用い危険なため、簡単で安全な測定方法の登場
が望まれていた。
した化学法によって定量が行われていたが、反応操作が
煩雑でしかも硫酸、氷酢酸といった腐触性や刺激臭の強
い試薬を用い危険なため、簡単で安全な測定方法の登場
が望まれていた。
最近になって、ようやく、Ｃ．Ｅ．，Ｃ．Ｏ．が血中の
コレステロールの定量分析に応用されるようになり、こ
れら酵素の臨床検査用試薬としての需要が大巾に伸びて
来る一方、安師で高純度のＣ．Ｅ，Ｃ．０．の供給が切
望されている。
コレステロールの定量分析に応用されるようになり、こ
れら酵素の臨床検査用試薬としての需要が大巾に伸びて
来る一方、安師で高純度のＣ．Ｅ，Ｃ．０．の供給が切
望されている。
従来、Ｃ．Ｅ．，Ｃ．０．の精製方法としてイオン交換
クロマトグラフイー、ゲル炉過などが行われているが、
大量生産するうえで十分な工業性を持つとはいえないの
である。
クロマトグラフイー、ゲル炉過などが行われているが、
大量生産するうえで十分な工業性を持つとはいえないの
である。
即ち、イオン交換クロマトグラフイーの場合、イオン交
換体と酵素との吸着がイオン交換の作用に基づいている
ため吸着時のイオン強度に大きく影響されるので微生物
培養液や微生物・動物臓器抽出液、又これらヲ硫安塩析
、有機溶媒処理したものはイオン強度が高くイオン交換
体に直接吸着させることはできず、透析、限外済過など
の煩雑な脱塩操作が必要となり酵素の収率の低下をもた
らす事になる。
換体と酵素との吸着がイオン交換の作用に基づいている
ため吸着時のイオン強度に大きく影響されるので微生物
培養液や微生物・動物臓器抽出液、又これらヲ硫安塩析
、有機溶媒処理したものはイオン強度が高くイオン交換
体に直接吸着させることはできず、透析、限外済過など
の煩雑な脱塩操作が必要となり酵素の収率の低下をもた
らす事になる。
又、ゲル炉過においては分子量の差によって分離するの
であるが、効果的に分離するために酵素液をできるだけ
濃縮することが必要であり、硫安塩析、有機溶媒処理、
限外済過などの操作が必要となり、又、少量のサンプル
しか処理できず工業的な精製法としては適さないのであ
る。
であるが、効果的に分離するために酵素液をできるだけ
濃縮することが必要であり、硫安塩析、有機溶媒処理、
限外済過などの操作が必要となり、又、少量のサンプル
しか処理できず工業的な精製法としては適さないのであ
る。
そこで、本発明者らは、前記のような欠点を解決するた
め研究を行い、メタアクリル酸系ポーラス型陽イオン交
換樹脂を用いた精製方法を見い出した。
め研究を行い、メタアクリル酸系ポーラス型陽イオン交
換樹脂を用いた精製方法を見い出した。
本発明は、Ｃ．Ｅ，およびＣ．Ｏ．のそれぞれ単独又は
それらの混合物を含む微生物培養ｐ液もしくはそれを処
理して得られる粗酵素液をメクアクリル酸系ポーラス型
陽イオン交換樹脂に接触させ、微生物培養液中のＣ．Ｅ
．およびＣ．Ｏ．を疎水結合によりメタアクリル酸系ポ
ーラス型陽イオン交換樹脂に吸着せしめた後、静電気的
な斥力および疎水結合を弱める力を利用して該樹脂より
Ｃ．Ｅ．もしくはＣ．０．を単独に溶離するか又はＣ．
Ｅ．とＣ．０．を分別・溶離する方法である。
それらの混合物を含む微生物培養ｐ液もしくはそれを処
理して得られる粗酵素液をメクアクリル酸系ポーラス型
陽イオン交換樹脂に接触させ、微生物培養液中のＣ．Ｅ
．およびＣ．Ｏ．を疎水結合によりメタアクリル酸系ポ
ーラス型陽イオン交換樹脂に吸着せしめた後、静電気的
な斥力および疎水結合を弱める力を利用して該樹脂より
Ｃ．Ｅ．もしくはＣ．０．を単独に溶離するか又はＣ．
Ｅ．とＣ．０．を分別・溶離する方法である。
即ちメタアクリル酸系陽イオン交換樹脂をｐＨ４．８以
下好ましくはｐＨ４．５の緩衝液で緩衝化しておき、Ｃ
．Ｅ．およびＣ．Ｏ．のそれぞれ単独又はそれらの混合
物を含む微生物培養済液もしくはそれを処理して得られ
る粗酵素液を該樹脂に通液し、Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．
を吸着させる。
下好ましくはｐＨ４．５の緩衝液で緩衝化しておき、Ｃ
．Ｅ．およびＣ．Ｏ．のそれぞれ単独又はそれらの混合
物を含む微生物培養済液もしくはそれを処理して得られ
る粗酵素液を該樹脂に通液し、Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．
を吸着させる。
次いで、この吸着樹脂を緩衝液で十分洗浄した後、Ｃ．
Ｅ．とＣ．Ｏ．と樹脂との間の静電気的斥力および樹脂
との間の疎水結合を弱める力とを利用してＣ．Ｅ．およ
びＣ．Ｏ．を純粋な状態で溶離する。
Ｅ．とＣ．Ｏ．と樹脂との間の静電気的斥力および樹脂
との間の疎水結合を弱める力とを利用してＣ．Ｅ．およ
びＣ．Ｏ．を純粋な状態で溶離する。
たとえば、Ｃ．Ｅ．は、５φプロピレングリコールを含
むｐＨ ５． ２の０．２Ｍ酢酸緩衝液で溶離され、（
，０．は、５饅プロピレングリコールを含むｐＨ ６．
０の０． ２ Ｍ酢酸緩衝液で溶離される。
むｐＨ ５． ２の０．２Ｍ酢酸緩衝液で溶離され、（
，０．は、５饅プロピレングリコールを含むｐＨ ６．
０の０． ２ Ｍ酢酸緩衝液で溶離される。
本発明における溶離は、このような溶離剤に限られるも
のでなく、Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．と樹脂との間の静電
気的斥力と疎水結合を弱める力とを増加させ、Ｃ．Ｅ．
あるいはＣ．Ｏ．が丁度溶離してくるｐＨまたは／およ
び有機溶剤の濃度に調節された溶離剤であればいかなる
ものでも良い。
のでなく、Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．と樹脂との間の静電
気的斥力と疎水結合を弱める力とを増加させ、Ｃ．Ｅ．
あるいはＣ．Ｏ．が丁度溶離してくるｐＨまたは／およ
び有機溶剤の濃度に調節された溶離剤であればいかなる
ものでも良い。
又、使用する樹脂としては、メクアクリル酸系ポーラス
型陽イオン交換樹脂であればいつれでもよいが、例えば
、アンバーライトＣＧ−５０、アンバーライトＩＲＣ−
５０、ダイアイオンＷＫ−１０、ダイアイオンＷＫ−１
１などが適している。
型陽イオン交換樹脂であればいつれでもよいが、例えば
、アンバーライトＣＧ−５０、アンバーライトＩＲＣ−
５０、ダイアイオンＷＫ−１０、ダイアイオンＷＫ−１
１などが適している。
アンバーライトＣＧ−５０の滴定曲線を求めるとｐＨ４
．８以下に於で本樹脂のイオン交換基であるカルボキシ
ル基がほとんど解離していないことが認められる。
．８以下に於で本樹脂のイオン交換基であるカルボキシ
ル基がほとんど解離していないことが認められる。
従ってｐＨ４．８以下においてはイオン交換作用を示さ
ない。
ない。
又アンバーライｌ−Ｃ’Ｇ−５０は、メタアクリル酸と
ジビニルベンゼンの共重合体でメチル基、ベンゼン環な
どの疎水性部分を豊富に持っている。
ジビニルベンゼンの共重合体でメチル基、ベンゼン環な
どの疎水性部分を豊富に持っている。
アンバーライ｝ＣＧ−５０の交換基がほとんど解離して
いないｐＨ ４． ８以下における樹脂と蛋白質との吸
着は疎水結合によるものと考えられる。
いないｐＨ ４． ８以下における樹脂と蛋白質との吸
着は疎水結合によるものと考えられる。
ｐＨ４．８以下における樹脂と蛋白質との吸着が疎水結
合に基づいているために、通常のイオン交換クロマトグ
ラフイーの場合と異なり、吸着力は吸着時のイオン強度
に影響されない。
合に基づいているために、通常のイオン交換クロマトグ
ラフイーの場合と異なり、吸着力は吸着時のイオン強度
に影響されない。
従って酵素含有液の透析、限外炉過などによる脱塩操作
を必要とせず、微生物培養液あるいは、これを硫安塩析
有機溶媒処理して得られる粗酵素の溶液から直接樹脂に
吸着させることができる。
を必要とせず、微生物培養液あるいは、これを硫安塩析
有機溶媒処理して得られる粗酵素の溶液から直接樹脂に
吸着させることができる。
一方、ｐＨ４．８以上では交換基が解離し始め、樹脂は
解離したカルボキシル基による負電荷を持つようになる
。
解離したカルボキシル基による負電荷を持つようになる
。
このカルボキシル基の負電，荷とＣ．Ｅ．あるいはＣ．
Ｏ．の負電荷との間に静電気的斥力が働くようになり、
この斥力が上述の疎水結合力よりも大きくなった場合に
Ｃ．Ｅ．あるいはＣ．Ｏ．が溶離されてくる。
Ｏ．の負電荷との間に静電気的斥力が働くようになり、
この斥力が上述の疎水結合力よりも大きくなった場合に
Ｃ．Ｅ．あるいはＣ．Ｏ．が溶離されてくる。
又、溶離の際に緩衝液に適当な濃度の疎水性化合物（例
えばプロピレングリコール）を加えておくと、この疎水
性化合物により樹脂とＣ．Ｅ．あるいはＣ．０．との間
の疎水結合力が弱められ、比較的弱い静電気的斥力でも
溶離されてくるようになる。
えばプロピレングリコール）を加えておくと、この疎水
性化合物により樹脂とＣ．Ｅ．あるいはＣ．０．との間
の疎水結合力が弱められ、比較的弱い静電気的斥力でも
溶離されてくるようになる。
以上のように、本発明はシュードモナス属に属するＣ．
Ｅ．および／またはＣ．Ｅ．生産菌を培養して得られる
培養ｐ液もしくは培養済液を処理して得られる粗酵素液
中に含まれるＣ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．のそれぞれ単独又
はそれらの混合物をｐＨ４．８以下好ましくはｐＨ４．
５において同じｐＨで緩衝化したメタアクリル酸系ポー
ラス型陽イオン交換樹脂に接触させ疎水結合によって吸
着させたのちに、好ましくは疎水性化合物存在下でｐＨ
を上げて静電気的斥力及び疎水結合を弱める力を利用し
て（，Ｅ．およびＣ．０．単独にあるいは分別溶離する
コレステロール定量用酵素の精製方法である。
Ｅ．および／またはＣ．Ｅ．生産菌を培養して得られる
培養ｐ液もしくは培養済液を処理して得られる粗酵素液
中に含まれるＣ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．のそれぞれ単独又
はそれらの混合物をｐＨ４．８以下好ましくはｐＨ４．
５において同じｐＨで緩衝化したメタアクリル酸系ポー
ラス型陽イオン交換樹脂に接触させ疎水結合によって吸
着させたのちに、好ましくは疎水性化合物存在下でｐＨ
を上げて静電気的斥力及び疎水結合を弱める力を利用し
て（，Ｅ．およびＣ．０．単独にあるいは分別溶離する
コレステロール定量用酵素の精製方法である。
本発明によって得られたＣ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．は以下
に示す様な酵素的性質をもつ。
に示す様な酵素的性質をもつ。
Ｃ．Ｅ・
１．至適ｐＨ ｐＨ ８
２．至適作用温度 ５０℃
３．ｐＨ安定性 ｐＨ４〜ｐＨ１０（３０℃、
２４時間処理） ４．温度安定性 ５０℃以下．（ｐＨ７ ， ３
０分処理） ５．分子量 ３０，０００（ゲル済過法によ
る） ６．等電点 ＰＩ４．５（等電点分画法によ
る） ７．界面活性剤の影響 ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によっ
て約２倍に活性化される Ｃ．０． １．至適ｐＨ ｐＨ ５ （ ｐＨ７では
約７５％の活性を示す） ２．至適作用温度 ５０℃ ３．ｐＨ安定性 ｐＨ６〜ｐＨ１０（３７℃、
１時間処理） ４．温度安定性 ６０℃以下（ｐＨ７，１時間処
理） ５．分子量 ３ ５，０ ０ ０ （ゲルＰ
過法による） ６．等電点 ＰＩ ６．２，ＰＩ ６．９（
：等電点分画法による） ７．Ｋｍ １．２ Ｘ １ ０−４Ｍ８
，界面活性剤の影響 ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって
約４倍に活性化される 次に、本発明に用いるコレステロール・オキシダニゼ゛
、及びコレステロール・エステラーゼの活性測定法を示
す。
２４時間処理） ４．温度安定性 ５０℃以下．（ｐＨ７ ， ３
０分処理） ５．分子量 ３０，０００（ゲル済過法によ
る） ６．等電点 ＰＩ４．５（等電点分画法によ
る） ７．界面活性剤の影響 ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によっ
て約２倍に活性化される Ｃ．０． １．至適ｐＨ ｐＨ ５ （ ｐＨ７では
約７５％の活性を示す） ２．至適作用温度 ５０℃ ３．ｐＨ安定性 ｐＨ６〜ｐＨ１０（３７℃、
１時間処理） ４．温度安定性 ６０℃以下（ｐＨ７，１時間処
理） ５．分子量 ３ ５，０ ０ ０ （ゲルＰ
過法による） ６．等電点 ＰＩ ６．２，ＰＩ ６．９（
：等電点分画法による） ７．Ｋｍ １．２ Ｘ １ ０−４Ｍ８
，界面活性剤の影響 ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって
約４倍に活性化される 次に、本発明に用いるコレステロール・オキシダニゼ゛
、及びコレステロール・エステラーゼの活性測定法を示
す。
コレステロールーオキシダーゼの場合はコレステロール
と反応によって生成した△４−コレステノン、または過
酸化水素を定量することによって測定することが出来る
。
と反応によって生成した△４−コレステノン、または過
酸化水素を定量することによって測定することが出来る
。
本酵素の活性の表示を説明すること、コレステロール・
オキシダーゼ１単位はｐＨ７．ｏ ｔ ３ ０℃の条件
で、１分間に１マイクロモルの△４−コレステノン、ま
たは過酸化水素を生成するに要する酵素量を示す。
オキシダーゼ１単位はｐＨ７．ｏ ｔ ３ ０℃の条件
で、１分間に１マイクロモルの△４−コレステノン、ま
たは過酸化水素を生成するに要する酵素量を示す。
△４−コレステノンの量はその２４５ｍμの吸光度を測
定することによって求めることが出来、また、過酸化水
素の量は例えばパーオキシダーゼと色原体を組合わせた
試薬と反応させることによって測定することが出来る。
定することによって求めることが出来、また、過酸化水
素の量は例えばパーオキシダーゼと色原体を組合わせた
試薬と反応させることによって測定することが出来る。
コレステロール・エステラーゼの酵素活性は、例えばコ
レステロールリノレートとの反応によって生成した遊離
型コレステロール量を定量することによって測定できる
。
レステロールリノレートとの反応によって生成した遊離
型コレステロール量を定量することによって測定できる
。
本発明におけるコレステロール・エステラーゼの活性の
表示を説明すると、コレステロール・エステラーゼ１単
位は、コレステロールリノレートを基質として、ｐＨ７
．０ ． ３ ７゜Ｃの条件で、１分間に１マイクロモ
ルの遊離コレステロールを生戒するに要する酵素量とし
た。
表示を説明すると、コレステロール・エステラーゼ１単
位は、コレステロールリノレートを基質として、ｐＨ７
．０ ． ３ ７゜Ｃの条件で、１分間に１マイクロモ
ルの遊離コレステロールを生戒するに要する酵素量とし
た。
以下に本発明における実施例を示す。
実施例 １
５０７容ジャーファメンターにグリセリン１咎、尿素０
、５０ｌ）、肉エキス０．２饅、ＫＨ２ＰＯ４０．１％
、ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．０５係、ｐＨ ４． ５の
組成を有する培地３５ｌをいれ、常法により１２０℃、
２０分間加熱殺菌した後、シュードモナス・フルオレツ
センスＮｏ． ０ ３−１ ９ ， ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎ
０．４３６７を接種し培養温度２８゜Ｃ、撹拌数３００
ｒｐＩＩ１、通気量０． ４ ｖｖｍの条件下で２４時
間培養し、培養液を除菌後、Ｃ．Ｏ−を含む培養炉液（
活性として１３６単位のもの）３０ｌを得る。
、５０ｌ）、肉エキス０．２饅、ＫＨ２ＰＯ４０．１％
、ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．０５係、ｐＨ ４． ５の
組成を有する培地３５ｌをいれ、常法により１２０℃、
２０分間加熱殺菌した後、シュードモナス・フルオレツ
センスＮｏ． ０ ３−１ ９ ， ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎ
０．４３６７を接種し培養温度２８゜Ｃ、撹拌数３００
ｒｐＩＩ１、通気量０． ４ ｖｖｍの条件下で２４時
間培養し、培養液を除菌後、Ｃ．Ｏ−を含む培養炉液（
活性として１３６単位のもの）３０ｌを得る。
該炉液をＩＮ＝酢酸でｐＨ ４． ５に調整後あらかじ
め０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で緩衝化したアン
バーライトＣＧ−５０のカラム１，５ｌに通液しＣ．Ｏ
．を吸着させる。
め０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で緩衝化したアン
バーライトＣＧ−５０のカラム１，５ｌに通液しＣ．Ｏ
．を吸着させる。
吸着後同じ緩衝液で洗浄し、ついで５％プロピレングリ
コールを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０，）でＣ
．０．を溶出し、溶出液３ｌを得る。
コールを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０，）でＣ
．０．を溶出し、溶出液３ｌを得る。
Ｃ．Ｏ．の活性収率８６饅、比活性は３８倍上昇する。
実施例 ２
５０７容ジャーファメンターに大豆油１ｆ０、肉エキス
０．３％、ポリペプトン１． ５ ％．尿素０．６％、
ＫＨ２ＰＯ４０．２覧ＭｇＳ０４．７Ｈ２００．０５係
、ＫＣｌＯ．０５饅ｐＨ６．０の組成を有する培地３５
ｌをいれ、常法により１２０°Ｃ，２０分間加熱殺菌し
た後、シュードモナス・フルオレツセンスＩＡＭ１０５
７ ，ＦＥＲＭ−ＰＮＣＬ １４６０を接種し、培養温
度２８℃、撹拌数３００ｒｌ）Ｉｌｌ、通気量０．４ｖ
ｖｍの条件下で２４時間培養し、培養液を除菌後Ｃ．Ｅ
．を含む培養済液（活性として１２０単位のもの）３０
ｌを得る。
０．３％、ポリペプトン１． ５ ％．尿素０．６％、
ＫＨ２ＰＯ４０．２覧ＭｇＳ０４．７Ｈ２００．０５係
、ＫＣｌＯ．０５饅ｐＨ６．０の組成を有する培地３５
ｌをいれ、常法により１２０°Ｃ，２０分間加熱殺菌し
た後、シュードモナス・フルオレツセンスＩＡＭ１０５
７ ，ＦＥＲＭ−ＰＮＣＬ １４６０を接種し、培養温
度２８℃、撹拌数３００ｒｌ）Ｉｌｌ、通気量０．４ｖ
ｖｍの条件下で２４時間培養し、培養液を除菌後Ｃ．Ｅ
．を含む培養済液（活性として１２０単位のもの）３０
ｌを得る。
該炉液をＩＮ−酢酸でｐＨ４．５に調整後あらかじめ０
． ２ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で緩衝化したアン
バーライトｃＧ−５０のカラム１．５ｌに通液しＣ．Ｅ
．を吸着させる。
． ２ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で緩衝化したアン
バーライトｃＧ−５０のカラム１．５ｌに通液しＣ．Ｅ
．を吸着させる。
吸着後、同じ緩衝液で洗浄し、ついで５係プロピレング
リコールを含む０． ２ Ｍ酢酸緩衝液（． ｐＨ５．
２）でＣ．Ｅ．を溶出し溶出液３ｌを得る。
リコールを含む０． ２ Ｍ酢酸緩衝液（． ｐＨ５．
２）でＣ．Ｅ．を溶出し溶出液３ｌを得る。
Ｃ．Ｅ，の活性収率は９２％であり比活性は１８倍上昇
する。
する。
実施例 ３
５０７容ジャーファメンターにオレイン酸１％、尿素０
．５％、グルタミン酸ナトリウム０．５％、肉エキス０
．２優、ＫＨ２ＰＯ４０．１優、ＭｇＳＯ，７ Ｈ２０
０．０ ５％、ｐＨ ５． ０の組戒を有する培地３
５ｌを入れ、常法により１２℃、２０分加熱殺菌した後
、シュードモナス・フルオレツセンスＮＯ．０ ３−
１ ９ ，ＦＥＲＭ−ＰＮ０．４３６ ７を接種し、培
養温度２８゜Ｃ、撹拌数３００ｒｐＩｎ、通気量０．４
ｖｖｍの条件下で２４時間培養し、培養液を除菌後Ｃ．
Ｅ．およびＣ．０．を含む培養炉液（活性としてＣ．Ｅ
．１ １ ０単位、Ｃ．０．７６単位のもの）３０ｌを
得る。
．５％、グルタミン酸ナトリウム０．５％、肉エキス０
．２優、ＫＨ２ＰＯ４０．１優、ＭｇＳＯ，７ Ｈ２０
０．０ ５％、ｐＨ ５． ０の組戒を有する培地３
５ｌを入れ、常法により１２℃、２０分加熱殺菌した後
、シュードモナス・フルオレツセンスＮＯ．０ ３−
１ ９ ，ＦＥＲＭ−ＰＮ０．４３６ ７を接種し、培
養温度２８゜Ｃ、撹拌数３００ｒｐＩｎ、通気量０．４
ｖｖｍの条件下で２４時間培養し、培養液を除菌後Ｃ．
Ｅ．およびＣ．０．を含む培養炉液（活性としてＣ．Ｅ
．１ １ ０単位、Ｃ．０．７６単位のもの）３０ｌを
得る。
該炉液をＩＮ一酢酸でｐＨ ４． ５に調整後あらかじ
め０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で緩衝化したアン
バーライトＣＧ−５０のカラム１．５ｌに通液し、Ｃ．
Ｅ．およびＣ．Ｏ．を吸着させる。
め０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で緩衝化したアン
バーライトＣＧ−５０のカラム１．５ｌに通液し、Ｃ．
Ｅ．およびＣ．Ｏ．を吸着させる。
吸着後同じ緩衝液で洗浄し、５饅プロビレングリコール
を含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）でＣ．Ｅ．を
溶出し溶出液３ｌを得る。
を含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）でＣ．Ｅ．を
溶出し溶出液３ｌを得る。
Ｃ．Ｅ．の活性収率は９０饅比活性は１５倍上昇する。
ついで５φプロピレングリコールを含む０．２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ６．０）でＣ．Ｏ．を溶出し、溶出液３ｌを
得る。
衝液（ｐＨ６．０）でＣ．Ｏ．を溶出し、溶出液３ｌを
得る。
Ｃ．Ｏ．の活性収率は８８係、比活性は４０倍上昇する
。
。
実施例 ４
実施例３に準じて得られるＣ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．を含
む培養済液２０１をＩＮ−酢酸でｐＨ ４． ５に調整
後あらかじめ０．５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．５で緩衝化し
たアンバーライｌ−ＣＧ−５０のカラム１ｌに通液し、
Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．を吸着させる。
む培養済液２０１をＩＮ−酢酸でｐＨ ４． ５に調整
後あらかじめ０．５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．５で緩衝化し
たアンバーライｌ−ＣＧ−５０のカラム１ｌに通液し、
Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．を吸着させる。
吸着後同じ緩衝液で洗浄し、ついでｐＨ ５． ２の０
． ５ Ｍ酢酸緩衝液でＣ．Ｅ．を溶出し、溶出液２．
５ｌを得る。
． ５ Ｍ酢酸緩衝液でＣ．Ｅ．を溶出し、溶出液２．
５ｌを得る。
Ｃ．Ｅ．の活性収率は９０饅で比活性は２０倍上昇する
。
。
ついでｐＨ ６． ０の０．５Ｍ酢酸緩衝液でＣ．Ｏ．
を溶出し溶出液２．５ｌを得る。
を溶出し溶出液２．５ｌを得る。
Ｃ．Ｏ．の活性収率は８１％で比活性は４５倍上昇する
。
。
溶出パターンは第１図に示す通りである。
実施例 ５
実施例３に準じて得られるＣ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．を含
む培養済液２５ｌから減圧濃縮により濃縮液２．５ｌを
得、該濃縮液に撹拌下硫酸アンモニウム粉末を除々に添
加溶解し、１６％飽和の濃度にした。
む培養済液２５ｌから減圧濃縮により濃縮液２．５ｌを
得、該濃縮液に撹拌下硫酸アンモニウム粉末を除々に添
加溶解し、１６％飽和の濃度にした。
数時間放置後生威した凝集物を分離回集し、得られた凝
集物を精製水に溶解して１ｌの粗酵素液を得、ＩＮ＝酢
酸でｐＨ ４、５に調整した。
集物を精製水に溶解して１ｌの粗酵素液を得、ＩＮ＝酢
酸でｐＨ ４、５に調整した。
一方、０． ５ Ｍ酢酸緩衝液（ ｐＨ ４．５）であ
らかじめ緩衝化したダイヤイオンＷＫ−１１のカラム１
ｌに上記籾酵素液を通液し、Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．を
吸着させる。
らかじめ緩衝化したダイヤイオンＷＫ−１１のカラム１
ｌに上記籾酵素液を通液し、Ｃ．Ｅ．およびＣ．Ｏ．を
吸着させる。
吸着後同じ緩衝液で洗浄し、ついで０． ５ Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ ５． ２ ）でＣ．Ｅ．を溶出し、溶出液
２．５ｌを得る。
衝液（ｐＨ ５． ２ ）でＣ．Ｅ．を溶出し、溶出液
２．５ｌを得る。
Ｃ．Ｅ．の活性収率は８５％で比活性は３倍上昇する。
ついで０．５Ｍ酢酸緩衝液でＣ．Ｏ．を溶出し、溶出液
２．５４を得る。
２．５４を得る。
Ｃ．Ｏ．の活性収率は７９φで比活性は５倍上昇する。
第１図は実施例４におけるＣ．Ｏ．とＣ．Ｅ．の溶出パ
ターンを示す図である。 ａ・・・・・・０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、ｂ
・・・・・・０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、ｃ・
・・・・・０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）。
ターンを示す図である。 ａ・・・・・・０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、ｂ
・・・・・・０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、ｃ・
・・・・・０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）。
Claims (1)
- １ ノユードモナス属に属するコレステロール・オキシ
ダーゼおよび／またはコレステロール・エステラーゼ生
産菌を培養して得られる培養ｐ液もしくは培養済液を処
理して得られる粗酵素液中に含まれるコレステロールー
オキシダーゼおよびコレステロール・エステラーゼのそ
れぞれ単独又はそれらの混合物をメタアクリル酸系ポー
ラス型陽イオン交換樹脂に疎水結合により吸着せしめた
後、静電気的な斥力および疎水結合を弱める力を利用し
て、該樹脂よりコレステロール・オキシダーゼもしくは
コレステロール・エステラーゼを単独に溶離するか、又
はコレステロール・オキシダーゼとコレステロール・エ
ステラーゼを分別・溶離することを特徴とするコレステ
ロール定量用酵素の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53045889A JPS5838149B2 (ja) | 1978-04-20 | 1978-04-20 | コレステロ−ル定量用酵素の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53045889A JPS5838149B2 (ja) | 1978-04-20 | 1978-04-20 | コレステロ−ル定量用酵素の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54138188A JPS54138188A (en) | 1979-10-26 |
| JPS5838149B2 true JPS5838149B2 (ja) | 1983-08-20 |
Family
ID=12731801
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53045889A Expired JPS5838149B2 (ja) | 1978-04-20 | 1978-04-20 | コレステロ−ル定量用酵素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5838149B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6055334A (ja) * | 1983-09-06 | 1985-03-30 | Kato Denki Kk | 原稿圧着板の開閉装置 |
| JPH0676950U (ja) * | 1991-12-11 | 1994-10-28 | 加藤電機株式会社 | 原稿圧着板の開閉装置 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2631099B2 (ja) * | 1987-01-19 | 1997-07-16 | オリエンタル酵母工業株式会社 | イソクエン酸脱水素酵素の精製法 |
| US4923810A (en) * | 1988-08-24 | 1990-05-08 | Genzyme Corporation | Resolution of glycidyl esters to high enantiomeric excess |
| JP3241712B2 (ja) * | 1998-03-03 | 2001-12-25 | 明治製菓株式会社 | コレステロールオキシダーゼ |
-
1978
- 1978-04-20 JP JP53045889A patent/JPS5838149B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6055334A (ja) * | 1983-09-06 | 1985-03-30 | Kato Denki Kk | 原稿圧着板の開閉装置 |
| JPH0676950U (ja) * | 1991-12-11 | 1994-10-28 | 加藤電機株式会社 | 原稿圧着板の開閉装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS54138188A (en) | 1979-10-26 |
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