JPS5942888A - 術生物によるエステル結合加水分解酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はｉ館生物によるエステル結合加水分解酵素の製
造法に関し、より詳しくはノカルディア属に庇し、エス
テル結合ＩＪ１１水分解酵累生産能を有する穿［生物を
培卆：し、培地中にＨｈ酢素を産生せしめこれを採取す
るものである１、 質の生産量が増大している。

しかしながら従来の天然油脂にイ′１川４゛６リパーゼ
や−［ステラーセではおのづから限界かあり、合成エス
テル系に対しては作用しないか又は作用が認められても
微弱なものが多い、。

そこで、本発明者らは天然エステル系から合成エステル
系にわたり強力に作用するニス−ノールツノ１１水分解
酵素生産能を有する微生物を自然界より検索を行、たと
ころ、ノカルデＩ゛ア机にｊＦＪ４する１１１１体が菌
体外に生産することを見出し本発明を完成さげたもので
ある。

すなわち、ノカルデｒア属に属し、エステル結解酵素の
製造法に関するものである。

閑学的性Ｉｔ１ ダラム染色　　　　　　　　　　　子 連動性　　　　　− コローーーーブイヨン培地 色　　　　　　　　　　　　ピンクの入った白色クリー
ム 光　沢　　　　　　　　　湿光沢 形　　　　　　　　　　　なめらか、円形Ｒ−培地（３
）　　　　　　　　なめしが、円１１つＰ−」６池＋４
１　　　　　　　　　　　　　ｌｌべん毛　　　　　　
　　　　　’Ｊ　　　　し細胞壁中のアミノ酸 ！ソーージアミノピメリン酸 ＬＬ−ジアミノビトリ７′酸　　　　　　　　　　　−
−−細１包分裂形態　　　　　　　　　゛７ラクメンテ
ーシヨ、・好気ににＦ生ａ カフラーゼ　　　　　　　　　　　　１オキシターゼ　
　　　　　　　　　− 菌体外ＤＮアーゼ　　　　　　　　（−ウレアーゼ　　
　　　　　　　　＋ セルラーゼ　　　　　　　　　　　− Ｃ−［゛テスト　　　　　　　　　　０ゼラチン液化　
　　　　　　　　　− 硝酸還元 す口・し１トガ５．他　　　　　　　　　　　−コハク
西トナイトレイト＠１１＋、　　　　　　　　　　十硝
酸呼吸 抗り■帽ｌｌ　　　　　　　　　　　　　　−リｉ・マ
スミルク　　　　　　　　アルカリリゾチート耐性　　
　　　　　　　十 カゼイン分解　　　　　　　　　　− デキストリン分解　　　　　　　　− ｎ−・ギザデカシ資化性　　　　　　　　　　１−イイ
機酸資化性 酢酸 クエン酸　　　　　　　　　　　　ト ギ酸　　　　　　ト 乳酸　　　　　十 オキザロＩＡ＋’＋＋酸 −）・〜り酸　　　　　　　　　　　　　（糖より酸の
生成 １）−−アラビノース　　　　　　　　−上りスリトー
ル　　　　　　　　　− Ｄ−７ラクトース　　　　　　　　ト Ｄ−ガラクトース　　　　　　　　− グルコース　　　　　　　　　　← ｔノシトール　　　　　　　　　− ラクトース　　　　　　　　　　− マニ　トー・ル　　　　　　　　　　　　　（〜う”Ａ
ノース　　　　　　　　　− Ｌ−ＬＬノース　　　　　　　　　　−Ｌ−−・Ｉルボ
ース　　　　　　　　　−シュークロース　　　　　　
　　− トレトロース　　　　　　　　　　一 １〕−キソロース　　　　　　　　　−以１．（）８自
’ｊ’：　＋白’ｉ’ｌｆｔからバーシトマーアル＋　
Ｂｅｒｇｙ　Ｍａｎｏｕａｌ　　第８　１，’ＩＪより
ノカルデ・ｆアエリスロボレスけＪｃ＋ｃａｒｄｉｎ　
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　）Ｋｌ？　−　８−１と命
名し微工仙閑６］°第３５３０　−号として可託されて
いる。

次に、；、１　、’　ｊｉ’ｌ’：！　、Ｐｌ，により
生産される酵素の理化学的（１質は次のどおりであるっ ０作用 該物質のエステル結合部位に作用し、加水分解反応を行
わせしめ、該物″ｔ１の酸を生成する。

■　基質１“６１冗性 各・タル酸エステルをイオン強度０．０５のｐＨ　８，
０のトリス−塩酸緩衝液に加えたものを２．５容気に０
、５％塩化カルシウムを含む同関術１°ｒ）ｊ，　（１
，５容爪を更に積装酵素液（トリス−塩酸緩衝液ＩＪＩ
−１　８．０　１　０．０５２容１ｒＩをＬ字テトにと
り、３０℃にで１う（盪さ＋：ｊ　Ｉ；’；扇ｉＪｚ’
一応を行わｆｌ−釈　定“Ｓ間接９°パ“；素１・ｌ　
ｉ’．Ｉ：ｒ！：＋＋定法１′１従，て、ブｆスクロマ
トグラ７　４　−、、−　１こｆＪ：、’（２市′Ｉξ
“１ 基＋（、７串を、アノにカリ適定（０．０５ＮｆぐＯ）
υにより酸ノ１成最を測定し、酵素活性を測定した，な
Ｊ）、名，ノタル酸エステルの基質最終濃度は２５ｆ）
０　１’Ｆ・１て．ｙ）Ｓｏこの結果、本酵素はｎ−ア
ルキル型、枝分れ型、レートへＤＮＰＩジーノニルフタ
レートノ、ＤＤＰｌジー　ドデシル７タレート）及びＤ
ＴＩ）Ｐ　（ジートリデシルブタレ−１・）に、枝分れ
型では・；ソアルキルタ・プのＤＩＰＰ　ｆジーイア・
プロピルフタレート）、ＤＩＢＰＩジー１　°ブチル？
タレー　ト）、ＤＩＤＰ　（ジー・１′ノデシルー°夕
１／−１・・に２−エチルタイプではＤＥＨＰＤＥＨＩ
”ＩＰｔ　　ジー２−エチルへキシルヘキサハイドロタ
リルエチルグリコレート）、ＤＰＩ’３Ｇ　（ブチルフ
タリルブチルグリコレート）に作用する，、また、オキ
シ型ではＤＭＥ円ンー２−メンキジエチルフタレート）
レート）、ＤＰｅＰ　（ジ−フェニルフタレート）、Ｄ
ＣＩＩＰ（ジ−シクロへキシル７クレート）に作用し、
二重結合型ではＤＡＬＰ　（ジーアリルノタレ−１・）
に、メタ型ではＤＭＩＰ　（ジ−メチルイソフタレート
）に作用し、上述のように現在人手ｉｊＪ能なすべての
７タル酸エステルに本酵素は作用し、そのエステル結合
を加水分解することが判明した。これらソタル酸エステ
ルのうちＤＥＨＰ　、　ＤＢＰ　、　ＤｎＯＰ　、　Ｄ
ＩＢＰ　、　１３ＰＢＧには非常に良く働きその活性は
高かー，た。

に代えて本酵素反応を行わせたところ、相対酵素活性値
はＤＥＨＰを１００とするとオリーブオイルＣル結合を
持つ一般的な物質にも非常に良く作用することが分かっ
た。

以上の結果を要約すると本酵素は、すべての７タル酸エ
ステルのみではな（オリーブオイル等の一般的な天然油
脂にも良（作用し、エステル結合を加水分解することが
判明した。

■　至ｊａｐＦｉ及び安定ｐＨ範囲 代表的な基質であるＤＥＨＰ　（ジー２−エチルへキシ
ルフタレート）を最終濃度２５００１？ｎとなるように
０．１％塩化カルシウムを含む各緩衝液（イオン強度０
．０５　）に／Ｊｌｌえ、酵素液（脱イオン水中）と容
量比で酵素液１に対して３容を混合し、酵素反応を３０
℃で行わせ、酵素活性を測定し、至適ｐＨを求めた。

特開昭５９−４２８８８（４） なお、用いた緩衝液はｐｌ−Ｉ　５はコハク酸緩衝液、
ｌ１Ｎ（６，６，６，７，０，７，６はリン酸緩衝液、
ｐｌ−Ｉ８．８，６．９．９．６はトリス−塩酸緩衝液
、ｐＨ１０は炭酸緩１ＩｉＩｉ　７１にである。

この結果、最適（至適）作用ｐＩｌは８．６であった。

また、本酵素はｐＨ１０においてイ）５０％ｊＬ（（の
活性を示した。次にｐＨ安定性においては至適ｐＨで示
した各緩衝液に精製酵素を加えた後、−昼（ｋ　４”Ｃ
にて静置後、常法に従ってｐＨを８．６に仄して酵素活
性を測定した。

この結果、本酵素はＩ）Ｈ６，ｓ〜８において安定であ
ったが、ｐＨ５以下になるとその活性は４０％程度に低
減し、またｐＨ８，６では８５％位の残（Ｙ活性を示す
が、ｐＨ１０を超えると４０％に低減した。

■　作用温度の範囲 至ＩＬ！ｉ及び安定ＩＪＩ−１であるｐＨ８，０、トリ
ス−塩酸緩衝液にて花θ−に従、て酵系活性を測定した
。なお月１いたンム、ｊｌ田は２０−Ｃ，３０’Ｃ１３
７℃、４２”Ｃ、５０’Ｃ。

６０’Ｃ，：　、’７（１’ｃである。この結果、最適
作用温度は４２“ＣてＪ’）す、作用温度としては３０
０〜４２℃であり、２０（、および５０’ｌｃ、におい
でも本酵素は８〇九近い活１／１を、６０゛″Ｃにおい
ても７０％古い活性を示した。

■　ｐｌ（、温度などによる失活の条件ｐＩ−１による
失活の条件については、■の安定ｐＨ範囲にも記したよ
うにｐＨ５以下になるとその活！Ｌは一〕、♀夜１１（
直後で４０％程度に、またｐＨ１０を超えると同様に４
０％に低下し失活する１、また、温度による失活は、至
適及び安定ｐｉ−１を考え、ｐＨ８，０トリス−１：Ａ
酸緩衝液丁で酵素を′８温度（２０“Ｃ１３０°Ｃ１３
６℃、４２℃、５０℃、６０’Ｃ及び７０’（１；にて
３０分処理後、作用温度３０′℃に直しに戻しで常法に
従い酵素活性を測定した。この五′ｉ呆、本ｎｆ索は３
６℃以下では完全に安定であるが、４２Ｃを超えると失
活をはじめ、５０”（：を超えると急速な失活がみられ
、７０”Ｃ３０分処理で本６）素は完全に失活する。

■　阻害、活性化及び安定化 精製酵素液に各種阻害剤、活性化／Ｉｌｌ　”＋’ｊを
最終濃度が１．Ｘ１０−４　Ｍになるように添加した後
、基１ｕＥＨＰ（ジー２−エチルへキシルツクレート）
を最終譲＋（（２５００距ＩＩになるように加え１．・
；臂〕、３（（１り酵素員応を行わせしめて阻害及び活
性化効果を調・＼た１、その結果、本酵素はＣａイオノ
により活性化されることが判明した。しかしながらカド
ミウム、水銀、ヒ素にｊ；り阻害を受ける。

次に、最終、ＦＡ度１ｘｌＯ−４Ｍのカルシウムイオン
を八−むイオン強度０．０５　　ｐ）１８．０　　のト
リス−塩酸縁１：Ｉ’ｉ　液にコ・−ルｔ１夕の代表的
なものとしてタウロコレ−１−を最終１ｉ４１Ｗ　０．
０２５％になるように添加する。その後、基ゲ：ｉ　Ｄ
ＥＨＰを最終濃度５０（１（ｌ　１ＩＩｌｌになるよう
に加え、さらに精製酵素を加え”Ｃ酵素反応を行わせた
。その結果、酵素反応系にコール酸（その代表的なもの
としてはタウロコレ−トンを入れると酵素活性力ｆ＋ｌ
ｌｉがＪ１？人する。

■　精製力法 培養液に（１，７５飽和イｙｊ安塩＋＋ｉを行い、次い
でＤｅｘｒａｎ　Ｔ　５００−Ｐ、Ｅ、Ｇ、　（ポリエ
チレングライコール６０００系にて水性二層分配法をわ
い本酵素をＤｅｘ−ｔｒ曲層に分配させる。その後、Ｉ
）ＥＡＥ−セファ１ツクスＡ−５０（７ア一マシア社製
）に本酵素を吸着（イオン強度０．０５　ｐＨ６，８、
リン酸緩衝液）させた後、同緩衝液に０．８　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１を添加し、グラジェント溶出をかけ本酵素活性画分
を集め、次いでセファデックスＧ　−１００（ファーマ
シア製）を用いてゲル濾過を行い精製酵素を得た。

■　分子量 七ソアデツクスＧ　−１００を用いたゲルｐ過法により
分子量を求めたところ約１５，０００であ−っだ。

■　ディスク電気泳動法による易動度 ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９，４ゲル）を用いて、
ディスク電気泳動法を常法に従って行・〕だところ、図
１に示す如（本酵素はディスク電気泳動的に均一であり
、その易動度は　　　であった。

［相］　本酵素作用の特色 エステル結合の片側にベンゼン核のようなものがついて
いるような合成エステルと植物性油脂等で代表される天
然エステルでは構造的に違いがある。そこで、本発明者
らは、本発明のエステル加水分解酵素と従来のエステル
加水分解酵素との比較検討を行った。従来のものとして
は微生物酵素としてｒ−１名なりゾップス・デレマー（
Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｍａｒ　）由来のリパーゼ（生
化学工業製）及び動物由来酵素として豚すい臓リパーゼ
（シグマ社製）を用いた。

比較検討試験法としては、」：ず、基質にオリーブオイ
ルを用いて檎常力常法通りリパーゼ活性峨測定し、３種
の酵素の単位ｍｌ　当りのリパーゼ活性をそろえた。こ
のようにしてリパーゼ活性をそろえた３種の酵素液に、
合成エステルの代表としてフタル酸エステルのうち最汎
用のＤＥＩ−ＩＰ　（シー２−エチルへキシルフタレー
ト：　、Ｉ、ｉｌｌ称ＬＪＯＩ勺を最終濃度５０００　
Ｆになるように添ＩＪＨＬ、３１１Ｌの［！、°索のＤ
ＥＨＰエステル加水分解１隻をｄＩＩｉ定した。この結
果、リパーゼ活性当りのＤＥＨＰニス′１”ル加７ＪＣ
分解度の割合（Ｊ本酵素を１とすると、イ１し１．：の
１ｉｊ販のｊ；ステル加水分解酵素であるリバー（目、
い４−れも０゜０５附；往であ−］だ。また、酵素反応
生成物として、Ａ。

酵素（４クタル酸を非常に高率で１１トだのに文１して
、従来市販酵素では極端に低か１．た。

ｌｆｆ１−の結果より、本酵素と従来の・般的なニスス
テルのような基質に対する作用は大きく　違−Ｃいるこ
とより、本酵素は従来型のＣ１イ；＋８とは」苗う力。

規エステル加水分解酵素である７、 本閑の培養は、通常の炭素源、窒素源を含有すが、！１
＋ｆに〔ステル結合を持つ化合物を添加するこして用い
てもよい１、 エステル化合物が添加されていないような培地では人（
ノカスの添加はイエ効である、ぞの添ＩＪ１．ＩｆＡは
０．０１％〜０．５％位いが適当である。

本酵素は菌体内外に産生されるが、培ｆ〔終了（ｉの本
酵素の回収は、培養液からの方が容易である、詳細に記
すと、まず培養液より培イＩＮ菌体を遠心またはＥ過等
により分けた後、該培養液より０．７５飽和硫安嘱析を
行い酵素蛋白を回収する。このＩＪｊに従、て精製する
と精製酵素標品を得ることかできる。

本酵素はエステル結合を加水分解するエステル加水分解
酵素であり、−・般的なリパービ・ニス７’ｆ６’を通
常の反応条件下にて良く加水分解し、なおかつ、フタル
酸エステルに代表されるような合成エステルにも良く作
用する。この７タル酸工ステル９二人テル力ＩＩＴ水介
牲Ｉこわｂ゛入７フダル駿、ｒ大月ルには２つのエステ
ル結合が存在するが、本酵素によるエステルｌＪ：＋水
分解が片方で止まるのではなくもう片方のエステル結合
もよく作用をうける。換言すれば、本ｔグ累の基質をフ
タル酸エステルにすると、その酵素反応生成物としては
、フタル酸モ、ノエステルに止まることなくすみやかに
７タル酸が検出されて（る。以りのことよりも、本酵素
はジエステル加水分解型酵素としての特徴を持−２てい
る。

さらに、エステル結合の片側が芳香族、例えば−？タル
酸エステルのような物質に対して、一般的な１？（末の
リパーゼはほとんど作用しないのに対して、（酵素の作
用力は大きく、かつ、前述の如く両エステル結合をすみ
やかに加水分解することより、本酵素は従来型のリパー
ゼ（エステラーゼを含む）とは異１．た新規エステルカ
１１水分子ｉｌ’ｈ１￥シ）−と、Ｊうえられる。

次に本酵素の一般的な作用形式を記すと、ＲＣＯＯＲ’
−−−−→ＲＣＯＯＩ［＋Ｒ’ＯＢとなり、基質が７タ
ル酸エステルの場合にはとなる。従って、本酵素の基￥
ａ’ｌ、）異１・１：は広９（【モ囲にわたっており、
ｎ−アルキル型１．ノエール型、二重結合型、メタ型等
のすべての７タル酸工ステル次に本酵素によってエステ
ル化合物を効率的にエステル加水分解させるためには、
温度は２０°Ｃ〜５０°Ｃで、好Ｊニジ（は２５〜４５
°Ｃで、ｐＨは５〜１０好ましくは６．５〜９に保持す
ることが望ましい。

なお、名定に法は次の方法により行った。

０本酵素活性の定量法： ガスクロマトグラフィー（ＦＩＤ　）による基質消失量
またはＫＯＨ（０，０５Ｎ　’）を用いたアルカリ遠足
による酸生成ａｔを指標とした１、なお、本酵素活性の
１ユニツトは１分間当りの１μｍｏｌｅの酸生成量に換
算しＣ求めた。また基質は代表的な基質として−・タル
ｉ１２エステルのうちでも最汎用されているＤＥＩ（Ｐ
　（、シー２−エチルへキシルフタレート）ヲ用い、濃
度は通常最終濃度で２５００１−とじた１、特に記載し
ない男合ノス外はイオン強度（１，０５、ｐＨ８，０の
トリス−塩酸緩衝液（塩化力ルンウノ、（１，０００１
Ｍを含む）を用い反応温度は３０゛Ｃにて行−だ。用い
たガスクロマトグラフィーは局部製ＧＣ−５Ａ型であり
検出方法はｌｉ’ＩＤ方式により、用いたカラノ、は５
ｉｌｉｃｏｎｅ　ＯＶ　−１７（カラム温１ｋ２２０′
Ｃ）である以下、実施例により本発明をより具体的に訂
述する。

実施例１ ジー２−エチルへキシルフタレート（ＤＥ）−ＩＰ　）
　０．５％、硫安０．１％　、リン酸１−カリ０６０２
％、リン酸２−カリ０．１６％、硫酸マグネシウム０．
０２％、塩化カルシウム０．０１％、食塩０．０１％、
　ｆｏｆ酸ｆｉ＜０．０００１％、モリブデ゛・酸フー
プ０．０００５％、１滝酸マノカフ０．０００５％、タ
ングステン酸ソーダ０．０００５％、パントチ２・酸カ
ルシウム０．０００４％、イノント−ル０．０００２％
、ニコチン０．０００４％、Ｐ−アミノ安息香酸０．０
００２％、ピリドキシン塩酸塩０．０００４％、チアミ
ン塩酸塩０．０００４％、リボフラビン（１，０００４
％、ビオチン０．０００００２％、ビタミンＢ　１２０
．００＋１０００５％の組成からなるＤＥＩ（Ｐ液体培
地３ｅを５ｅジヤーフアーメーターに入れ、これに同じ
ＤＥＨＰ寒天斜面培地（１ｉｉｒ記のＤＥＩ−ＩＰ培地
に寒天１．５％を加スたもの）で３　ＦＪ間前培養（３
０°Ｃ）　したところのＮｏｃａｒｄｉａｅｒｙｔｈｒ
ｏｐｏｌｉｓ　ＫＲ−Ｓ　−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−３５３
０）を１０白金耳移植してｐＨを７〜８に調整しながら
３０℃にて３日間培養する。３日面培養後、冷却遠心（
１８０００ｇＸ　３０分）を行い培養液と培養菌体を得
る。培養菌体を培養液と同量のイオン強度０．０５ｐＩ
−Ｉ　７のリン酸緩衝液（０，００１％塩化カルシウム
を含む）に再懸濁させ、酵素活性測定法に従って、酵素
活性を測定し、菌体内・外の酵素の存在比を求めた。結
果を表１に示す。

表１ この結果より、本酵素は菌体内は勿論のこと、菌体外に
も分泌されることが認められた。

さ 以下、精製及び利用のしやすヤより菌体外に分泌される
酵素にて本研究を進めた。

実施例２ 実施例１に示したのと同じＤＥＩ−ＩＰ完全合成液体培
地に大豆カス０．０１％を添加した後、実施例１と同じ
培養条件で同じ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｅｒｙｔｈｒｏｐ
ｏｌｉｓ　ＫＩ？−Ｓ　−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−３５３０
）を移植して実施例１と同様に菌を増殖させ、３日間の
培養液の酵素活性を測定した。結果を表２に示す。

表２ この結果より大豆カスを添加することより培養液中の酵
讃の生産ｉｔが増大することが明らかにな−）た。

実施例３ 実施例１に従って得られた培養液より本酵素の回収例を
示す 培養液１００−よりまず冷却遠心機を用いて１８０００
　ｆ、３０分間遠心をおこない培養上澄液と培養菌体を
分け、培養菌体を除去する。しかる後、得られた該培養
上澄液８５−に硫安を少量ずつ添加溶解させ、硫安飽和
度０．７５飽川にする。この後２時間静置させ、再び冷
却遠心機にて１００００　ｇ１５分遠心を行い、酵素蛋
白沈澱画分を集める。この沈澱画分を少量のリン酸緩衝
液（イオン強度０．０５　ｐＨ７）に溶かし、同リン酸
緩衝液にて一昼夜４℃にて透析を行い硫安を除去する。

こうして得られた透析内液（８Ｔｎｌ）に本酵素が仔在
し、回収できる。表３はこのようにして回収された本酵
素と回収０；Ｉの培養−上澄液との酵素活性、回収率、
精製度を示す。

衣　　３ 実施例４ の精製酵″４′、液を調整した。本精製酵素液２．０−
に０．０５％塩化カルシウムを含んだ同トリス塩酸緩衝
液０．５２を加え、さらに同トリス塩酸緩衝液にミセル
状に分散させたＤＥＩ−ＩＰ　（ジー２−エチルへキシ
ルフタレート）　５０００１Ｆ液２．５　ｍｌを加え、
Ｌ字試験管内にて３０℃（１８時間）にて本酵素反応を
行わせし７めた結果を表４に示す、Ｊ 表４ 実施例　５ イオン強度０．０５　ｐＨ８，０のトリス−塩酸緩衝液
２．５−に各基質を最終０度２５００１ヤ１１　にｌよ
るようにこれに、さらに０．５　ｍｌの同船）１Φｈｌ
？、　（、０，５％塩化）Ｊルシウム）を加え、ついで
同！ＪＩ　Ｉ’ＦＩ　；ｔｈに溶かした精製酵素液２．
０−を加えた後、３０℃でｌｌｉ￥に反応を行わせしめ
本酵素の基質特異性を測定した。

ＤＥＨＰ　（ジー２−エチルへキシルフタレート）にス
・１する粘性を１００として表示したのが表５である。

この結果、本酵素はすべてのフタル酸エステルに作用し
、又、天然由来のオリーブオイル等で代表される一般的
なエステル結合をもつ油脂に作用することが明らかにな
った。

表　５基質特異性

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ′カルブイア属に属し、エステル結合加水分特徴とする
   派生物によるエステル結合加水分解Ｒ寧の製哉法、。