JPH0292281A - 新規リパーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なリパーゼ、該リパーゼの製造方法、及び
該リパーゼを生産する新規な微生物に関する。

〔従来の技術〕

リパーゼは、乳製品のフレーバー形成のための食品加工
用酵素、消化剤としての医療用酵素、血中脂質の測定の
ための試薬用酵素、油脂の加水分解や油脂の改質のため
の工業用酵素等として広範に使用されている。

近年においてはさらに、洗剤用酵素としてリパーゼが洗
浄力の向上に有効であるといわれ注目されている。この
用途は、アントレー（Ｈ，Ａｎｄｒｅｅ）らによるＬｉ
ｐａｓｅ　ａｓ　ｄｅｔｅｎｇｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅ
ｎｔｓ’　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ　２２１８−２２９　（１９８）などに記載
されている。洗剤用リパーゼは、通常の洗濯条件では洗
浄液のｐｌ＋が高アルカリであるため、高アルカリで機
能するアルカリリパーゼでなければならない。さらに一
般に脂質汚れは高温高アルカリ条件下では比較的除去さ
れやすいが、我国等において主として行われている室温
洗浄では十分に脂質汚れを除けないため、洗剤用酵素と
してのリパーゼは低温で十分に機能しなければならない
。また洗剤成分の一つである、陰イオン性界面活性剤に
対して安定に機能しなければならないが、一般にリパー
ゼは安定性が低いことが知られている。

微生物の生産するリパーゼは、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）ａ、アルカリゲネス（八１ｋａｌｅ
ｎｅＳ）属、アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃ
　ｔｅｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アスペルギ
ルス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ−属、等に由来すること
が知られている。しかしながら、これらから得られた大
部分のリパーゼは至適ｐｌ＋が中性である。またキャン
デイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物がリパーゼ
を生産することも多く知られているがその至適ｐＨはす
べて中性付近である。たとえば、それぞれ活性測定法は
異なるが、Ｆｅｔｔｅ　ｓｅｉｆｅｕａｕｓｔｒｉｃｈ
ｍ　８７５　Ｐ２Ｓ５　（１９８５）に記載されている
キャンディダ・クルバータ（Ｃａｎｄｉｄａｃｕｒｖａ
　ｔａ）の生産するリパーゼの至適ｐＨは６．０である
。また八ｇｒｉ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ　３１コ、　（６
）　Ｐ５７６　（１９６６）及びＪ、Ａｍ、　Ｏ４１，
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ　６２　（６）　Ｐ４Ｏ１０に記載さ
れている、それぞれキャンデイダ・シリンドナセア（Ｃ
ａｎｄｉｄａ　ｃ　ｌ１ｎｄｎａｃｅａ）、キャンディ
ダデフオルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｄｅｆｏｒＩＩｌ
ａｎｓ）の生産するリパーゼの至適ｐ）１は７であり、
＾ｇｒｉ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、　３４　（９）ｐ１３
６８　（１９７０）に記載されているキャンデイダ・パ
ラリポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｈμ状印剋Ｌ１９）の
生産するリパーゼの至適ｐＨは８．０である。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、至適ｐＨが高アルカ側にあり、そして
至適温度が比較的低く、そして好ましくは陰イオン性界
面活性剤に対して安定なリパーゼを提供しようとするも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、前記のような性質を有するリパーゼを得
るべく、多数の微生物を分離・培養して検索した結果、
東京部下の土壌中より分離した菌株５Ｄ−７０１に代表
されるキャンディダ属酵母が求めるリパーゼを生産する
ことを見出し、そしてさらに驚くべきことに零株菌５Ｄ
−７０１により生産されるリパーゼは直鎖アルキルベン
ゼンスルホン７１　（ＬＡＳ）、アルファオレフィンス
ルホン酸（ＡＯ５）等のごとき陰イオン性界面活性剤に
安定であることを見出し、本発明を完成するに至った。

従って、本発明は、トリオレーンエマルジョンを基質と
した場合の至適ｐｉ（が９．０〜１０．０であり、トリ
オレーンエマルジョンを基質とした場合の至適温度が３
７℃〜４０℃であり、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動法により測定した分子量が３５０００±２０００で
あり、ゲル濾過法によって測定した分子量が４３０００
であり、そして等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によって測定した等重点が４．８±０．２である新規
なリパーゼ；キャンデイダ（Ｃａｎｄｔｄａ）属に属す
る酵母より生産され、トリオレーンエマルジョンを基質
とした場合の至適ｐｌ＋が９．０〜１０．０であり、そ
してトリオレーンエマルジョンを基質とした場合の至適
温度が３７℃〜４０℃である新規なリパーゼ；キャンデ
イダ属に属し前記リパーゼを生産することができる酵母
を培地に培養し、そして培養物から該リパーゼを採取す
ることを特徴とする前記リパーゼの製造方法；及び前記
のリパーゼを生産することができるキャンディダ属の新
規な酵母を提供するものである。

〔具体的な記載〕

生童皿 本発明の新規リパーゼの製造のために使用する微生物は
、前記の性質を有するリパーゼを生産することができる
キャンディダ属酵母であれば特に限定されない。この様
な酵母は、保存菌株中から、又は自然界から新たに分離
した微生物中から選択することができる。酵母菌株は土
壌その他の分離源から常法に従って分離することができ
る。目的とする菌株の選択は、被検微生物を例えば通常
の酵母用培地中で培養し、そして培養物（培地又は菌体
）中の高ｐｌ＋常温条件下でのリパーゼ活性を常法に従
って測定することにより行うことができる。

新規なリパーゼが生産菌の一例として、本発明者等が東
京部下の土壌中より分離した５Ｄ−７０１株が上げられ
る。

この菌株は下記の性質を有する。

（ａ）各培地における生育状態 （１）ＭＹ液体培地 栄養細胞の形態　　　楕円形 栄養細胞の大きさ 増殖の形式 皮膜の形成 沈殿物の生成 （２〜？　）　　ｔｒｍ　Ｘ　　（３〜９　）　　ｔｎ
ｎ多極出芽 形成する。

粉状沈殿物を生成 （２）ＮＹ寒天培地における生育 コロニーの状態 周縁の状態 隆起状態 表面の状態 光沢 性状 色調 イド培養 菌糸の有無 仮性菌糸の有無 菌糸を形成する。

仮性菌糸を形成する。

乱糸状 凸状 粗面 鈍光 強じん 白色 トウモロコシ抽出液寒天培地によるスラ（ｂ）子のう胞
子の形成 ゴロドコワ培地、石コウ・醋酸ソーダ培地、醋酢ソーダ
培地、Ｖ−８、ニンジン片麦芽抽出液寒天培地、野菜汁
寒天培地で子のう胞子を形成しない。

（ｃ）射出胞子の形成 ＭＹ培地で射出胞子を形成しない。

（ｄ）生理学的性質 硝酸塩の同化 脂肪の分解 尿素の分解 ゼラチンの？夜化 ＋ ＋ ＋ （９）有機酸の生成 （１０）デンプン様物質 の生成 庄 （ｅ）発酵性と同化性 発酵性 （１）Ｄ−グルコース （２）Ｄ−ガラクトース （３）麦芽糖 （４）ショ糖 （５）乳糖 （６）ラフィノース 同化性 （１）Ｄ−アラビノース （２）Ｌ−アラビノース （３）Ｄ−リポース （４）Ｄ−キシロース （５）Ｄ−グルコース （６）Ｄ−ガラクトース （７）Ｌ−ラムノース ＋Ｓ ＋ Ｌ−ソルボース 麦芽糖 ショ糖 乳専唐 メソビオース セロビオース トレハロース ラフィノース メレジトース アルブチン 可溶性デンプン イヌリン エタノール アドニソト エリトリット イノシソト Ｄ−マンニット Ｄ−ソルビツト ズルシフト 輸 ＋ ＋ ＋５ （２８）グリセリン　　　　＋ 上記の菌学的性質を有する本閑の分類学上の性質の位置
を”Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔｓ”　（Ｌｏｄｄｅｎ　ｅｔａ
ｌ　３ｒｄ　ｅｄｉｔ）（１９８４）及び“酵母の分類
同定法”　（後杯昭二著）を参照すると、大部分はキャ
ンディダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ旦肌旦旦９）
の性質と類似するが本菌株は、ＭＹＩＪ天培地等におい
て褐色の水溶性色素を大量に生成する。さらに、本菌株
の生産するリパーゼは至適ｐＨが９−１０と高く、従来
のものとはまったく異なる。本発明者等はこれをキャン
ディダ・リボリテイカの一変種と考える。本菌株は工業
技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第１０１３７号と
して寄託されている。

隻１１法 本発明のリパーゼを製造するにあたってはキャンディダ
属に属するリパーゼ生産菌を培地に培養する。

培地の栄養源としては通常培養に用いられているものが
広く利用できる。炭素源としては同化できる炭素化合物
またはこれを含有するものであればよく、例えばブドウ
糖、グリセリン、油脂、コーンステイープリカーなどが
用いられる。窒素源としても同化可能な窒素化合物、ま
たはこれを含有するものであればよく、例えば尿素、ア
ンモニウム塩、大豆粉、脱脂大豆粉、ペプトン、コーン
ステープリカーなどが用いられる。また、無機塩類とし
てはリン酸塩、マグネシウム塩などの塩類が使用される
。その他、酵母の生育および酵素生産に必要な各種の有
機物や無機物またはこれを含有するもの、例えばビタミ
ン類、非イオン性界面活性剤酵母エキス、リン脂質等を
培地に添加することができる。

培養の形態は液体、固体培養いずれでも良いが液体培養
の方が好ましい。液体培養における培養条件は培地組成
により多少異なるが、生産の目的物であるリパーゼの生
産に最も有利な条件を選択する。培養温度は１５℃〜３
７℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲であり、培養時間
は１２時間から３日程度であり、リパーゼ生産が最高に
達した時に培養を終了すればよい。培地のｐＨは中性付
近がよく、６〜７がリパーゼ生産に好適である。この様
な培養により、目的とするリパーゼに主として培養液中
菌体外に得られる。

単崖櫂袈広 このようにして得られた培養液からのリパーゼの採取は
、リパーゼを採取するための常法に従って分離、精製す
ることにより行うことができる。

すなわち、固体培養の場合には、公知のように水その他
の抽出剤方どで抽出を行って抽出液を得、また液体培養
の場合には濾過法、遠心分離法などの公知の適当な方法
により菌体や培地固形物を分離して、上澄液または濾液
を得ることができる。

これらの分離液を濃縮し、または濃縮することなく可溶
性塩類を添加し沈殿させる塩析法、親水性有機溶剤を添
加して酵素の沈殿を生せしめる沈殿法、安定補助剤を加
えて又は安定補助剤なしに噴霧乾燥する方法、凍結乾燥
法、あるいはイオン交換樹脂等を用いた吸着脱離法、等
の精製手段を単独または複数組み合わせて、リパーゼを
得ることができる。

、　　の濱　　法 リパーゼ活性の測定は、本発明においてはトリオレイン
−ポリビニルアルコール（ＰＶ＾）エマルジョンを基質
とする乳化系測定法を用いて実施する。

具体的には、酵素液０．１　ｍｌ、１００ｍＭグリシン
緩衝液（ｐＨ９，０）　　０．４　ｍｌ、及びトリオレ
ーンエマルジョン０．５−からなる反応液を共栓付試験
管中で３７℃にて１０分間反応させ、反応停止液として
１規定塩酸０．２−を用いて反応を停止させる。ここで
トリオレーンエマルジョンは、ポリビニルア／Ｌ／　Ｄ
　−／Ｌ／　（ＰＶＡ）　　２％水溶液（クラレ製ＰＶ
Ａ１１７　：　ＰＶ八へ０５＝　９　：　１）　　１５
ｍ７に１．５ｇのトリオレインを加え、氷冷し、１０℃
以下に保ちながら１６０００ｒｐ＋ｍ１０分間ホモジナ
イズしたものである。反応停止後、ｎ−ヘキサン：イソ
プロピルアルコール＝１＝１の混合液４−を加え、激し
く撹拌し、静置後ヘキサン層をサンプリングし、ＴＬＣ
−ＦＩＤ法（Ｍｉｎａｇａｗａｅｔ　ａｌ　Ｌｉｐｉｄ
ｓ、　１８７３２．１９８３）にてオレイン酸を定量す
る。活性の単位は１分間に１マイクロモ、ルのオレイン
酸を生成する酵素量を１ユニツト　（Ｕ）とする。

酊素坐血１ 本発明に属するリパーゼの一例として、前記５０７０１
株が生産するリパーゼについて、その詳細な性質を記載
する。

（１）作用 グリセライドに作用し、エステル結合を加水分解する。

（２）基質特異性 各種グリセライド、エステルなどを広範にわたり加水分
解する。オリーブ油分解力を１００とすると、およそ、
ココナツツ油９５、ヒマシ油３２、牛脂３７の相対活性
を示す。この分解力は基質エマルジョン５−１１００ｍ
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，０）４−１及び酵素液１ｍ
ｌの混合物を３７℃にて１０分間反応せしめ、生成した
遊離脂肪酸をアルカリ滴定法により定量することにより
測定した。

（３）至適ｐＨ トリオレーンエマルジョンを基質として測定した場合、
ｐＨ９，０〜１０．０である。反応温度と相対活性との
関係を第１図に示す。この結果は、前記の力価測定法に
より、但し、ｐＨ７，０〜１１．０の範囲（緩衝液：　
ｐｌ＋７〜９　Ｔｒｉｓ−１１ｃ１；ｐＨ９〜１１　Ｇ
ｌｙＮａＯＩｌ　；　）で異なるｐｌ＋を用いて得たも
のである。

（４）安定ｐＨ範囲 ｐｔ１２〜１２において、３０℃にて２４時間処理した
後の残存活性を調べたところ、ｐＨ３〜１０の範囲では
ほとんど不活性化しない。この結果を第３図に示す。こ
れは緩衝液として、ｐＨ２〜４クエン酸緩衝液；ｐ１１
４〜６酢酸栓緩衝液；ｐ）１７〜９Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐ
ｌ＋９〜１２グリシン緩衝液を使用して得た結果である
。

（５）作用適温の範囲 トリオレインを基質として測定した場合、至適温度は３
７℃〜４０℃である。２０℃及び５０℃において、至適
温度における活性に対して約５０％の相対活性を示す。

反応温度と相対活性の関係を第２図に示す。この結果は
、前記の力価測定法により、但し２０℃〜５０℃の範囲
内で異なる反応温度を用いて得たものである。

（６）温度、ｐＨなどによる失活の条件至適ｐＨにおい
て３０℃及び４０℃にて２時間の処理ではほとんど失活
しないが、７０’Ｃにて２時間の処理でほぼ失活する。

（７）分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔分子量標
準：チトクロームＣ（モノマー、ダイマー、トリマー、
テトラマー、ヘキサマー）〕により得られた分子量は３
５０００±２０００であり、セファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−７５ｅ分子量標準：チトクロームＣ１リ
ゾチーム、牛血清アルブミン、トリプシン、卵白アルブ
ミン）により得られた分子量は４３０００である。

（８）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られ
た等電点は４．８±０．２である。

（９）界面活性剤に対する耐性 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸１５００ｐｐｍの存在
下（ｐＨ９，Ｏ１温度３０℃）において、第３図に示す
ごとく非常に安定である。

〔発明の効果〕

本発明のリパーゼは至適ｐＨが９．０−１０．０と高く
、また洗剤成分である各種陰イオン系界面活性剤に対す
る安定性が高いため、洗剤用酵素として使用でき、洗浄
力の増強を図ることができる。さらに低温側に至適温度
を有するため特に脂質汚れが落ちにくい室温洗浄におい
て顕著な効果を示す。

次に本発明を実施例を挙げて説明する。

実施炎上 小麦でんぷん１％、可溶性でんぷん１％、脱脂大豆粉２
％、リン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．
０５％、リン酸二アンモニウム０．１％、及びレシチン
０．３％を含む液体培地２ｍｌを１８０φの試験管に分
注し、そして１２０℃２０分蒸気殺菌を行った。これに
５Ｄ−７０１株を接種し、３５℃で２４時間振盪培養し
た。培養液を遠心分離し、その上澄のリパーゼ活性を測
定したところ５．４Ｕ／−であった。

次屓ｌ九谷 精製大豆粉２％、コースフチイーブリカー３％、オリー
ブ油０．７％、リン酸二アンモニウム０．１％、リン酸
二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．１％、及び
炭酸カルシウム０．３％を含む液体培地２−を１８鳳鳳
φ試験管に分注し、そして１２０℃２０分蒸気殺菌を行
った。これに５Ｄ−７０１株を接種し、そして３５℃で
１９時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、そしてそ
の上澄のリパーゼ活性を測定したところ３１．ＯＵ／ｍ
Ｚであった。

尖施炭１ 精製大豆粉１％、コーンステイープリカー５％、リン酸
二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．１％、オリ
ーブ油１％、及びリン酸二アンモニウム０．１％を含む
培養液５００１を１ｒ＋？容培養槽に入れ、蒸気殺菌し
、これにあらかじめ培養しておいた５Ｄ７０１株を接種
し、３５℃にて１６時間通気撹拌培養を行った。この培
養液を遠心分離機で菌体を除去し、上澄を得た。この上
澄のリパーゼ力価値は１７０　Ｕ　／−であった。この
上澄液４５０１を限外濾過膜で濃縮し、噴霧乾燥してリ
パーゼ比活性７Ｕ／■の調製物を１４００　ｇ得た。

本粗酵素を用いて、ｐｌ＋９．０　、３０℃条件下にお
ける直鎖アルキルヘンガンスルホン酸（ＬＡＳ）　１５
００ｐｐｍとの接触時間に対する残存活性を調べた結果
を第４図に示す。

尖膳炎土　ユバニ亙少猜裂 実施例３で得られた酵素原末から本発明のリパーゼを精
製した。

原末２０ｇを５００　ｍｌの２５　ｍＭ−Ｔｒｉｓ−１
（Ｃｌ　ｉｌｌ液液ｐ）１７．２）に溶かし、硫酸アン
モニウム沈殿法にて３０−６０％画分の沈殿を得た。こ
の沈殿を２５ｍＭＴｒｉｓ−ＩＩｃ　／ｌ　緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）に溶かし、４℃にて２４時間、２５ｎ＋Ｍ　
Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ！緩衝液（ｐＨ７，２）で透析後、
同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｄｅｘ八５
０カラム（φ５Ｘ１８ｃｍ）に吸着させ、ＮａＣ（ｌに
て溶出させた。本リパーゼは１００ｍＭ　ＮａＣ１にて
？容出し、得られた活性画分をさらに、同ＤＥＡＥＳｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０カラムにて精製を行った。

同操作で溶出した活性画分を次いで５ｅｐｈａｄｅｘ　
Ｇ−７５（φ３Ｘ２０ＣＩ１１）にて脱塩を行い、凍結
乾燥後２５００Ｕ／■の酵素５■を得た。

この精製過程は次の通りであった。

この凍結乾燥標品は白色であり、ポリアクリルアミド電
気泳動法により試験したところ、単一であることが確認
された。なお、この酵素は結晶化が困難であった。

実施例５．使■炭 本発明リパーゼの洗浄試験を実施した。汚染布には成年
男子２〜３日間着用した天然衿垢布を用い、洗浄はＴｅ
ｎｇ−０−Ｔｏｗｅｔｅｒにて行った。末法は、Ｊ、Ｃ
，ｌ＋ａｎｎｉｓ、　ＤｅＬｅｎｇｅｎｃｙ　ｅｖａｌ
ｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｅｓｔｉｎｇ（Ｉｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｎｓ　Ｌｔｄ）　１９
５４６０−６１に記載されている。洗浄条件は回転数１
２Ｏｒｐｍにて２５℃１５分間、洗剤（ＪＩＳ無りん）
濃度１３３０ｐｐｍとした。本発明リパーゼ濃度２０Ｕ
／ｌで添加すると無添加に比べ、白変で３％、洗濯効率
で５％の向上がみられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフ
である。 第２図は酵素反応温度と相対活性との関係を示すグラフ
である。 第３図は種々のｐＨにて３０℃で２４時間処理した場合
の残存活性を示すグラフである。 第４図は直鎖アルキルベンゼンスルホン酸１５００ｐｐ
ｍの存在下での本発明のリパーゼの安定性を示すグラフ
である。 （’／、） 第 図 （’／、） （’／、） 温度（０Ｃ） （’／、）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有する新規リパーゼ： （１）トリオレーンエマルジョンを基質とした場合の至
   適ｐＨが９．０〜１０．０であり； （２）トリオレーンエマルジョンを基質とした場合の至
   適温度が３７℃〜４０℃であり；（３）ＳＤＳ−ポリア
   クリルアミド電気泳動法により測定した分子量が３５０
   ００±２０００であり、ゲル濾過法によって測定した分
   子量が４３０００であり；そして （４）等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
   て測定した等電点が４．８±０．２である。 ２、下記の性質を有する新規リパーゼ： （１）キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母
   により生産され； （２）トリオレーンエマルジョンを基質とした場合の至
   適ｐＨが９．０〜１０．０であり；そして （３）トリオレーンエマルジョンを基質とした場合の至
   適温度が３７℃〜４０℃である。３、請求項１又は２に
   記載するリパーゼの製造方法であって、キャンディダ属
   に属し前記リパーゼを生産することができる酵母を培地
   に培養し、そして培養物から該リパーゼを採取すること
   を特徴とする方法。 ４、請求項１又は２に記載のリパーゼを生産することが
   できるキャンディダ属酵母。 ５、前記キャンディダ属酵母がキャンディダＳＤ−７０
   １株（微工研菌寄第１０１３７号）である請求項４に記
   載の酵母。