JPS61289884A

JPS61289884A - リパ−ゼ類の製造方法

Info

Publication number: JPS61289884A
Application number: JP13019685A
Authority: JP
Inventors: Satoru Fujita; 哲藤田; Haruyuki Yamashita; 治之山下
Original assignee: Asahi Denka Kogyo KK
Current assignee: Adeka Corp
Priority date: 1985-06-14
Filing date: 1985-06-14
Publication date: 1986-12-19
Also published as: JPH0575385B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、糸状菌に属するカビを使用してリパーゼ類を
製造する方法、詳しく４才、糸状菌に属するカビを液体
培地中で培養し、リパーゼ類を多量に、且つ安定的に生
成させる方法に関するものである。

〔従来の技術〕

リパーゼは古くから膵臓を主とする動物資源やヒマ等の
植物資源から製造されており、微生物を利用する方法と
しても、特公昭４Ｏ−４４２１ｑ公報、同４０−４４２
２号公報、間４２−８９１２号公報、同５６−４２２６
６号公報、アグリ力ルチュアル・アンド・ビオロジカル
・ケミストリー（八ｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　　ａｎｄ
　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ、ａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
　　　３８巻６号１２４９（１９７４年）、同誌３９巻
５号１０６３頁（１９７５年）、同誌３３巻３号２９９
頁（１９６９年）等に記載されている如く、アスペルギ
ルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ゲオトリカム（Ｇ
ｅｏ　ｔｒ　ｉ　ｃｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ）属、リソープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）
属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属等の糸状菌を培養して製
造する方法が知られている。

リパーゼは古くから医薬品（消化剤）として用いられて
おり、又、乳脂を加水分解してフレー）＜−を生産する
ためにも使用されている。

また、リポプロテインリパーゼは、動物体内酵素として
知られていたが、リゾーブス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、
ムコール（ＭｕＣｏｒ）属によって類似の微生物リポプ
ロテインリパーゼが生産されることが知られ、血中脂肪
の測定に利用されている。微生物リポプロテインリパー
ゼの製造方法について目、特公昭４１−７８３６号公報
、同５Ｂ−３１８３４号公報、アグリ力ルチュアル・ア
ンｌ′・ビオロジカル・ケミストーリー（八ｇｒｉｃａ
１１．ｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）　４４　＠　４号７９９頁（１９８０
年）等に記載されている方法が知られている。

また、リゾフオスフオリバーゼについては、ノへイオケ
ミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ）７０巻５５９頁（１９５８年）にペニシリウ
ム・ツタ−タム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎｏＬａｔ
ｏｍ）による製法か知られており、レシチンからグリセ
ロフオスフォコリンを製造するのに利用できる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前述の従来の方法では、リパーゼ類を多量に且つ安定的
に製造することが難しく、そのためリパーゼ類は比較的
高価格なものとなっている。そのため、例えば、リパー
ゼを前述の医薬品等の用途に使用する場合は、リパーゼ
が比較的高価格でもコスト的に引き合うのであるが、最
近、油脂の分解、油脂のエステル交換にリパーゼを使用
する方法が開発され、特にカビ起源のリパーゼはトリグ
リセリドのα位に位置特異性があり、油脂のエステル交
換に有用とされており、この様な用途に使用する場合は
、リパーゼの価格が高価格では企業化する際に支障とな
るのでコスト的に安価なリパーゼの製造方法が要求され
る。

従って、本発明の目的は、リパーゼ類を簡単な手段で安
価且つ多量に製造する方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、上記目的を、糸状菌に属しリパーゼ類を生産
するカヒを液状培地で培養し、培養物中からリパーゼ類
を取得するに際し、培地中の基質がほぼ消費されて溶存
酸単濃度が増加し始める時点から糸状菌が利用しろる基
質を菌体濃度が増加しない程度に流加し、培養物中のリ
パーゼ類濃度を増加させることによって達成したもので
ある。

以下に本発明のリパーゼ類の製造方法について詳述する
。

本発明のリパーゼ類の製造方法により生産されるリパー
ゼ類としては、リパーゼ（酵素番号３゜１．１．３）、
微生物リポプロテインリパーゼ（酵素番号３．１．１．
３４．）　、又はリゾフオスフォリパーゼ（酵素番号３
．１．１．５）等が挙げられる。

本発明で使用される糸状菌としては、アスペルギルス・フラバス（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１，４９２、アスペルギルス
・オリ七ニー　（八ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｏｒｙｚ
ａｅ）　　ＡＴＣＣ］　　４　６０５、アスペルギルスｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｌ：ｉｃｕｓ）　Ａ　Ｔ
　Ｃ　Ｃ　　２　６　８　５　０等のアスペルギルス（
＾ｓｐｅｒｇ　ｉ　ｌ　Ｉｕｓ）属、ヒューヘリア°ハ
ンアーナ（ＲｅａｌｌＶｅｒｌａ　Ｉ］ａＳＳＩａｎａ
）ＡＴＣＣ　　２６０３７、２６８５１等のビューへリ
ア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、ゲオＩ・リカム・キャンディダム　（Ｇｅｏｔｒｉｃｏ
ｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）　ＡＴＣＣ　　３　４　６　１
　４、ゲ第１〜リカム・クレハニイ　（Ｇｅｏｔｒｉｃ
ｕｍ　ｋｌｅ）＋ａｈｎｉｉ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　２
　０００１等のゲ第１・リカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）
属、メタリジウム・アニスプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚ
ｉｕｍ　ａｎｉｓｐｌｉａｅ）　ＡＴＣＣ　　２　６　
８　５　２等のメタリジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ
）属、ムコール・フラハス（Ｍｕｃｏｒ　ｆｌａνｕｓ）　Ｉ
　ＡＭ　　６　］４３、ムコール・ミニヘイ（Ｍｕｃｏ
ｒ　ｍｉｅｈｅｉ）　Ｉ　Ａ　Ｍ９７４１、ムコール・
ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ　、Ｉａｖａｎｉｃｕｓ）　
　Ｔ　ＡＭ　　６　１　０　８、６０８９等のムコール
（Ｍｕｃｏｒ）属、ペシロミセス・ファリノザス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅ
ｓ　ｆａｒｉｎｏｓｕｓ）　ＡＴＣＣ　　２　６　８　
５　３等のペシロミセス（Ｐａｅｃ目ｏｍｙｃｅｓ）屈
、ペニシリウム・カセイコラム（Ｐｅｎｉｃ目１ｉｕｍ　
ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ）　ＡＴＣＣ　　２　４　９　３
　６、ペニシリウム・シクロピウム　（Ｐｅｎｉｃｉｌ
目ｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ３４６
１３等のペニシリウム（１’ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属
、リゾープス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅ
ｍｅｒ）　Ｔ　Ｆ　０４６９７、４７２６、４７７１、
４７７３、ＡＴＴＣ　　３４６］２、リゾープス・キネ
ンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）　Ｆ
　Ｅ　Ｒ　Ｍ　　２　７　６　７、リゾープス・ニベウ
ス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ）　　Ｔ　Ｆ　０
　　４　７５９、リゾープス・ジャバニカス（Ｒｈｉｚ
ｏｐｕｓ　ｊａｐ。

ｎｉｃｕｓ）　Ｉ　Ｆ　０　　５　３　１　８、４７５
８等のリゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、フェルティシリウム・レカニー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ　ｌｅｃａｎｉｉ）　ＡＴ　ＣＣ　　２　６　８　
５　４等のフェルティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉ　ｌ　
ｌｉｕｍ）属等が挙げられる。

尚、ＴＰＯは財団法人醗酵研究所保存菌株、ＡＴＣＣは
アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション保存
菌株、Ｆ　Ｅ　Ｒ　Ｍは工業技術院微生物工業技術研究
所保存菌株、ＩＡ．Ｍは東京大学応用微生物研究所保存
菌株を示し、いずれも一般に入手可能である。

本発明で流加される基質としては、グルコース、シュー
クロース、マルトース、フラクトース、グリセリン、デ
キストリン、可溶性デンプン等の水溶性炭水化物；界面
活性剤、燐脂質、蛋白等によって安定に乳化された動植
物油脂の水中油型乳化油脂や豆乳、牛乳等の天然の乳化
油脂類；ポリペプトン、トリプトン、イーストエキス、
魚肉又は畜肉のエキス等の蛋白分解物；コーンステイー
プリカー、脱脂大豆粉又はその抽出液、カゼインソーダ
、その他アルブミンの如き水溶性蛋白質、及びこれらの
混合物等の蛋白質を、単独又は適宜組み合わせて使用で
きる。

基質を流加して微生物を培養すること＆；１号＞知であ
るが、従来の流加培養法は、例えばパン酵母の生産の場
合に連続的に糖液を流加し、アルコール醗酵を避ｉＪつ
つ菌体を増殖させるとか、特開昭６０−４９７９２号公
報に記載の如くバクテリアに糖を自動的に間歇的に流加
して菌体を増殖させるとかのように菌体の増殖を目的と
したもので、本発明の場合は、そのような従来の方法よ
りもはるかに少ない量の流加しか行わないのが特徴であ
る。

而して、本発明のリパーゼの製造方法を実施するに際し
ては、先ず、上記糸状菌に属しリパーゼ類を生産するカ
ビをポテトシュークロース寒天培地等で培養して菌体を
増殖させる。次いで、胞子を形成する場合は胞子を、胞
子を形成しない場合は菌体を、適当な培養器中の液状培
地に接種し、培養する。接種量は特に限定されないが、
胞子の場合はおよそ１０　　〜１０’個／１００ｍｌ、
菌体の場合はおよそ１白金耳／１００ｍｌである。

本発明で使用される液状培地には、通常、Ｋ　Ｉ−（２
ｐｏ４やＭｇＳＯ４等の無機塩が０．０１〜０．２重量
％程度添加されており、その他に必要に応じてグルコー
ス、シュークロース、可溶性デンプン等の糖類が０〜４
重量％程度添加されていてもよく、更にコーンステイー
プリカー、豆乳、大豆粉、イーストエキス、ポリペプト
ン等が添加されていてもよい。

培養は、ｐｌ＋５．０〜６．５程度で適当な温度例えば
２０〜３３°Ｃで振需培養、通気攪拌培養等によればよ
い。

そして、溶存酸素濃度が上昇し始めた時点から上記基質
の流加を開始し、溶存酸素濃度、ｐＨ、菌体量がほぼ一
定に推移するように上記基質の流加量を設定する。一般
的には、必要な基質の流加量ば糖類を基準とすると、蛋
白は多めに、乳化油脂類は少なめとなる。しかしながら
、過少すぎては添加効果が見られないので各々の菌株と
基質の組合せにより適宜定めればよいが、実際」−は培
養系内の菌体乾物重量に対して毎時１〜６重量％、好ま
しくは毎時１．５〜４．５重量％程度とするのがよい。

流加方式は、一定時間を区切って間歇的に流加する方法
、グリコースセンサーや溶存酸素濃度センサー等を使用
してコンピュータ制御によりほぼ連続的に流加する方法
等が用いられる。

培養物中からのリパーゼ類の取得は、培養中随時リパー
ゼ活性を測定し、リパーゼ活性がほぼ最大となる時点で
菌体を濾過等の常法により除去し、濾液を更に限外濾過
し又はせずに、硫酸アンモニウム沈殿法、アセトンやア
ルコール等による有機溶媒沈澱法、イオン交換樹脂によ
る吸着法等で処理しリパーゼ類を回収する方法により行
うことができる。また、培養時間が長い場合や人容■の
場合４ｆ　、基質を流加しつつ培養液を抜き出して菌体
分離及びその後の処理を行っても。Ｌい。

本発明の方法により得られたリパーゼｉｌｌは、各種用
途に、従来法により得られたリパーゼ類と同様にして使
用できる。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例、及び比較例を示すが、本発明は
これらに限定されるものではない。

尚、実施例及び比較例において、リパーゼ活性の測定及
びリポプロテインリパーゼ活性の測定は、それぞれ以下
のように行った。

〔リパーゼ活性の測定〕

リパーゼ活性の測定は、農化誌３６巻１０号８６０頁（
１９６２年）に記載の山田等の方法に基づき以下のよう
に行った。

力□広１００ｍ１の三角フラスコにｐＨ６，０の０．１Ｍリン
酸緩衝液４ｍｌとオリーブ油乳化液（８０°Ｃ以下で熔
解した２％ポリビニルアルコール水溶液と日周オリーブ
油を３＝１に混合乳化したもの）５ｍ１を加え、３７±
０．２°Ｃで５分間予熱する。これにリパーゼを含む試
料１ｍｌを加え、３７±０．２°Ｃで正確に３０分間反
応させる。直ちにアセトン・エタノール（１：１）液１
０ｍ１を加えて反応を停止させた後、０．０５　Ｎ苛性
ソーダ液１０ｍ１とアセ１−ンパエタノール（１：１）
液１０ｍ１を加え、フェノールフタレーンを指示薬とし
て０．０５Ｎ塩酸溶液で逆滴定する。（ブランクとして
０．１Ｍリン酸緩衝液とオリーブ油乳化液にアセトン・
エタノール液を加えた後、試料１ｍｌを加えたものを用
いる。）０．６註）Ｔｂ・・・ブランク滴定値；Ｔｓ・・・試料滴定値
；ｆ・・・０．０５　Ｎ塩酸力価；　ｎ・・・試料希釈
倍数（このリパーゼ活性は、脂肪酸０．１μｅｑ／ｍｉ
ｎを遊離させる酵素量を１単位（ＬＪ　）とする。）〔
リポプロテインリパーゼ活性の測定〕基質として、２％
ポリビニルアルコール溶液２２．５ｍｌにオリーブ油２
．０ｇを加えて１０°Ｃ以下で乳化したちの１ｍｌと成
牛血清５０ｍ１を加えて３７°Ｃで３０分間インキュへ
−１・したものを作成する。

この基質溶液２ｍｌに０．２Ｍリン酸緩１重ｉ液（ｐｌ
＋　２．０）２ｍｌを加え３７℃で５分間予熱する。こ
れに」１記の緩衝液で適当に希釈した酵素液１ｍｌを加
え３７℃で１０分間反応させ、濁度の減少を６６０ｎｍ
の吸光度を測定することにより求める。濁度の減少量と
脂肪酸の生成間とは比例関係が成り立つことが一般に知
られているので、予めダンコンベの方法〔ジャーナル・
オフ・バイオケミストリ＝（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　８８．８　（１１６３年）
〕により生成脂肪酸量と潤度減少の関係を調べた結果か
ら酵素量を知る。即ち、ここで示す酵素量１車位（ｔ、
Ｊ　）とは、脂肪酸μｅｑ／ｍｉｎを遊島１１させる酵
素量である。

実施例１及び比較例１グルコース２％、コーンステイープリカー１０％、Ｋ　
Ｈ２Ｐ　０４０．１％、及０１ｇ５０４　　・７１１２
００．０５％を含有するｐＨ５，８の培地６０７！に、
同一の培地４００ｍ１で培養したリゾープス・デレマー
Ｉ　Ｆ○　４７５４菌を胞子数として１０’＋ｌ？ｉｌ
／１００ｍ１を接種し、通気培養した。その培養経過を
第１図及び第２図に示す。第１図及び第２図中、１は醗
酵時間と培養液の溶存酸素濃度（ＤＯ１飽和値を１００
とする）との関係を示すグラフ、２ば醗酵時間と培養液
のｐＨとの関係を示すグラフ、３は醗酵時間と培養液の
菌体濃度（乾重量％）との関係を示すグラフ、４は醗酵
時間と培養液のグルコース濃度との関係を示すグラフ、
及び５は醗酵時間とリパーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）との関係
を示すグラフである。

第１図は、培養に際し、溶存酸素濃度の上昇開始直後か
らグルコースの３０Ｗ／Ｖ％溶液をグルコース分として
１時間毎に３２ｇづつ流加（１２回、即ち１１時間）し
た場合（実施例１）の培養経過を示す。また、第２図は
、流加を行わなかった場合（比較例１）の培養経過を示
す。

第１図及び第２図から明らかな如く、実施例１及び比較
例１の何れの場合も、醗酵開始後２０時間でグルコース
が消費され、次いで蛋白質等の資化が始まり、菌体量は
依然として増加するが、醗酵開始後３１時間で基質が消
費しつくされ、急激に溶存酸素濃度とｐｌ＋の上昇が始
まる。しかし、実施例１において基質の流加を開始した
時点以後においては、何れの場合も、菌体濃度は殆ど増
加しないが、基質を流加しなかった比較例１の場合は、
醗酵開始後３４時間でリパーゼ活性が最大（２６ＩＵ／
ｍｌ）となり、以後は分解されて減少したのに対し、基
質を流加した実施例１の場合は、溶存酸素濃度がほぼ同
一水準を維持しており、醗酵開始後４５時間でリパーゼ
活性が最大（５１０Ｕ／ｍ＋）となり、基質の流加によ
りリパーゼ活性はほぼ２倍となった。

実施例２〜３及び比較例２リゾープス・デレマーＡＴＣＣ３４６１２菌を、ポリペ
プトン４％、グルコース２％、ＫＩ（２ＰＯ４０，１％
、及びＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０゜０５％を含有する培
地４００ｍ１を含む２１の三角フラスコ中で２８°Ｃで
２日間回転培養し、種菌とした。また、それぞれ下記表
−１に示す各種培地６０ｎを含む１００ｐの醗酵槽を１
２１°Ｃで２０分間殺菌量０．５　ＶＶＭとし、溶存酸
素濃度（以下Ｄｏという）が１１５となった以降はＩ　
ＶＶＭとし、２５０回転／分の攪拌を行って、２８℃で
培養した。比較例２は流加を行わず、実施例２及び３は
、培地中の基質が菌体によって消費しつくされ、ＤＯが
上昇しだした直後から流加を開始し、それぞれ９時間及
び７時間の流加を行ったものである。実施例２はグルコ
ースのみ（流加量３０ｇ／時）、実施例３はグルコース
（流加量２０ｇ／時）とポリペプトン（流加量１５ｇ／
時）をそれぞれ水溶液として流加した。比較例２の最大
リパーゼ活性が２０４Ｕ／ｍｌに対し、実施例２でば５
０８Ｕ／ｍｌ、実施例３では４２７Ｕ／ｍｌの最大リパ
ーゼ活性が得られた（下記表−１参照）。

実施例４〜７及び比較例３菌株としてリゾープス・デレマー　ＩＦｏ　　４６９７
菌を用い、且つそれぞれ下記表−１に示す各種培地を用
いた以外は実施例２と同様にして実施した。但し、比較
例３は流加を行わず、実施例４はシュークロース（流加
量２８ｇ／時、流加時間５時間）、実施例５ばシューク
ロース（流加量２６ｇ／時、流加時間１０時間）、実施
例６は乳化油脂（流加量２０ｇ／時、流加時間７時間）
、実施例７はポリペプトン（流加量４５　ｇ／時、流加
時間７時間）をそれぞれ流加した。実施例においては、
比較例３に対して、流加時間の短いもので１．７倍、長
いもので２倍程度のリパーゼ活性が得られたく下記表−
１参照）。

実施例８〜１０及び比較例４〜６下記表−２の菌種前に示す菌を用いた以外は、実施例８
〜１０は実施例２の培養条件と、比較例４〜６は比較例
２の培養条件と同様にして実施した。流加開始時間は菌
種によって異なったが、流加時間は全て７時間とした。

その結果を下記表−２に示す。何れの菌を用いた場合も
、実施例は比較例に対してそれぞれ流加により２倍程度
のリパーゼ活性の向上が認められた。

表−２１主）＊１；リソ゛−ブス・キネンシス　ＦＥＩＩＭ　
２７６７＊２：リゾープス・ニへウス　ＩＦＯ４７５９
＊３：リゾーブス・ジャボニカスＩＦ０５３１８尚、培
養系に蓄禎されたリパーゼは、全ての実施例につき、菌
体を濾過又は遠心背高１（によって除去し、培養濾液を
限外濾過濃縮を行うか又は行わずに、硫酸アンモニウム
沈鍛法、アセトンやアルコール等による有機溶媒沈澱法
、イオン交換樹脂による吸着法等、常用的な手段で粗精
間又は精製して用いることができる。

実施例１１〜１２及び比較例７〜８実施例１１及び比較例７はゲオトリカム・キャンディダ
ム　ＡＴＣＣ３４６１４菌を用い、実施例１２及び比較
例８はアスペルギルス・オリゼ工−　ＡＴＣＣ１４６０
５菌を用いた。培地は、米ヌカ４％、コーンステイープ
リカー５％、グルコース１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、及び消泡剤アデカノ
ール５Ｘ２９４（無電化工業（１１８製＞０．０５％を
含有するもの（ｐ１１５．８）を用いた。上記菌をそれ
ぞれ上記培地１００和１を含む５００ｍ１三角フラスコ
中で２８°Ｃで２日間培養し、種菌とした。また、それ
ぞれ−に記培地６βを含む１０ρのジャーファーメンタ
−を１２１°Ｃで３０分間殺菌した。次いで、これらの
殺菌済の培地にそれぞれ−に記種菌を胞子数として１０
６個／１００ｍ１接種し、実施例は基質が消費されてＤ
Ｏが上昇し始めた直後から６時間、毎時３ｇのグルコー
スを流加し、流加後１時間後に培養を終了した。比較例
ば流加を行わず、Ｄｏが上昇し始めてから１時間後に培
養を終了した。培養終了後、菌体を遠心分離した後、常
法によってリパーゼを回収した。

ＤＯ−上昇後１時間後のリパーゼ活性は下記表−３の通
りであり、何れの菌を用いた場合でも、実施例は比較例
に対してそれぞれ流加により２倍程度のリパーゼ活性の
向上が認められた。

表−３実施例１３及び比較例９ポテトシュークロース寒天培地に生育したムコール・ジ
ャバニカス　ＴＡＭ　　６１０８菌を、ボリペプ１〜ン
１．５％、グルコース１％、ハイプロトン（日本蛋白（
株製、粉末豆乳）０．５％、ＫＨ２ＰＯ４０，２％、Ｋ
Ｃｌ０．０５％、及びＭｇ５ｏ４　　・７１１２００．
０５％を含有するｐｌ＋６．０の培地を含む５００ｍ１
坂ロフラスコ中で２８°Ｃで２日間培養し、種菌とした
。次いで、ハイプロトン３％、ＫＨ２ＰＯ４０，２％、
ＫＣｌ０．０５％、Ｍｇ５Ｏ，・７１１２００．０５％
、及びアデカノール５Ｘ２９４　０．０５％を含有する
ｐｌ＋未調整の培地６１を含む１０ρのシャーファーメ
ンタ−に、上記種菌を胞子数として１０６個／１００ｍ
１接種し、ＩＶＶＭ、３５０ｒｐｍ、２ｇ℃で培養した
。随時サンプリングしてリポプロテインリパーゼ活性を
測定し、ｐｌ＋及びＤＯはファーメンタ−にイ］属した
センサーによってｉｌｌ＋Ｉ定した。

実施例１３は、培養開始後、３１．５時間より培　　　
　　　　“地中のグルコースをグルコースセンサーによ
って測定しながらグルコースが０．０３％となる毎にグ
ルコースを３ｇづつ流加した。比較例９は流加を行わな
い以外は実施例１３と同様にして実施した。

最大リボプロティンリパーセ活性は、比較例９では培養
３５時間後に９１３Ｕ／ｍｌとなったのに対し、実施例
１３では培養３９時間後に２０３０Ｕ／ｍｌとなった。

これらのリポプロテインリパーゼは、常法により精製し
、粗酵素とした。

実施例１４及び比較例１０実施例１３及び比較例９で用いたムコール・ジャバニカ
ス　ＩＡＭ　　６１０８菌の代わりにリゾーブス・ジャ
バニカス　ＴＰＯ４，７５８菌を用いた以外は全て実施
例１４は実施例１３と、比較例１０は比較例９と同様に
して実施した。

最大リポプロテインリパーゼ活性は、比較例１０では培
養３５時間後に６６７　Ｕ／ｍｌとなったのに対し、実
施例１４では培養４１時間後に１４９０Ｕ／ｍｌとなっ
た。

〔発明の効果〕

本発明のリパーゼ類の製造方法によれば、リパーゼ類を
簡単な手段で安価且つ多量に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における培養経過を示すグラフ、及び
第２図は比較例１における培養経過を示すグラフである
。 ■・・・醗酵時間と培養液の溶存酸素濃度（ＤＯ、飽和
値を１００とする）との関係を示すグラフ２・・・醗酵時間と培＃液のｐｎとの関係を示すグラフ３・・・醗酵時間と培養液の菌体濃度（乾重量％）との
関係を示すグラフ４・・・醗酵時間と培養液のグルコース濃度との関係を
示すグラフ５・・・醗酵時間とリパーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）との関係
を示すグラフ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）糸状菌に属しリパーゼ類を生産するカビを液状培
地で培養し、培養物中からリパーゼ類を取得するに際し
、培地中の基質がほぼ消費されて溶存酸素濃度が増加し
始める時点から糸状菌が利用しうる基質を菌体濃度が増
加しない程度に流加し、培養物中のリパーゼ類濃度を増
加させることを特徴とするリパーゼ類の製造方法。
（２）流加される基質が、水溶性炭水化物、乳化油脂類
、蛋白分解物、又は蛋白質から選ばれた１種又は２種以
上の混合物であることを特徴とする特許請求の範囲第（
１）項記載のリパーゼ類の製造方法。
（３）流加される基質の量が、培養系内の菌体乾物重量
に対して毎時１〜６重量％であることを特徴とする特許
請求の範囲第（１）項記載のリパーゼ類の製造方法。
（４）リパーゼ類が、リパーゼ（酵素番号３．１．１．
３）、微生物リポプロテインリパーゼ（酵素番号３．１
．１．３４）、又はリゾフォスフォリパーゼ（酵素番号
３．１．１．５）のいずれかであることを特徴とする特
許請求の範囲第（１）項記載のリパーゼ類の製造方法。
（５）糸状菌が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ）属、ビューベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、ゲ
オトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）属、メタリジウム（
Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）
属、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、ペ
ニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾープス
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、又はフェルティシリウム（Ｖ
ｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属のいずれかに属する菌であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のリ
パーゼ類の製造方法。
（６）糸状菌が、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属又はリゾー
プス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属のいずれかに属する菌であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第（５）項記載のリ
パーゼ類の製造方法。
（７）糸状菌が、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ）属に属する菌であることを特徴とする特許請求の範
囲第（５）項記載のリパーゼ類の製造方法。