NO139353B - Fremgangsmaate til fremstilling av lipase - Google Patents
Fremgangsmaate til fremstilling av lipase Download PDFInfo
- Publication number
- NO139353B NO139353B NO349673A NO349673A NO139353B NO 139353 B NO139353 B NO 139353B NO 349673 A NO349673 A NO 349673A NO 349673 A NO349673 A NO 349673A NO 139353 B NO139353 B NO 139353B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- lipase
- activity
- enzyme
- medium
- parts
- Prior art date
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims description 57
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims description 57
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims description 57
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 241000134731 Phycomyces nitens Species 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 101000847788 Phycomyces blakesleeanus N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate isomerase Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 9
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 7
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235401 Phycomyces blakesleeanus Species 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 229940124568 digestive agent Drugs 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 3
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000179532 [Candida] cylindracea Species 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- -1 lead acetate Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M p-chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 2-[[bis(carboxymethyl)amino]methyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910017621 MgSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235400 Phycomyces Species 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000186334 Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Species 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- NHJPVZLSLOHJDM-UHFFFAOYSA-N azane;butanedioic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O NHJPVZLSLOHJDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGPGDYLVALNKEG-UHFFFAOYSA-N azanium;azane;2,3,4-trihydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O NGPGDYLVALNKEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ITHZDDVSAWDQPZ-UHFFFAOYSA-L barium acetate Chemical compound [Ba+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O ITHZDDVSAWDQPZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940112016 barium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000021149 fatty food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046892 lead acetate Drugs 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-IGMARMGPSA-N sodium-23 atom Chemical group [23Na] KEAYESYHFKHZAL-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- PBYZMCDFOULPGH-UHFFFAOYSA-N tungstate Chemical compound [O-][W]([O-])(=O)=O PBYZMCDFOULPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
- 229960000314 zinc acetate Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av en ny lipase hvis enzymaktivitet økes betraktelig i nærvær av galle.
Man har hittil beskrevet forskjellige typer mikrobielle lipaser. For eksempel beskrives lipaser fra Candida cylindracea og fra Propionibacterium shermanii i "Agricultural and Biological Chemistry", bind 30, nr. 6, side 576-584 (1966) og "Applied Microbiology", bind 20, nr. 1, side 16-22 (1970), respektivt. Disse lipaser vet man imidlertid inaktiveres med galle.
Fra britisk patent nr. 1.084.431 er. det kjent lipaser
fra algesopper av slektene Mucor og Rhizopus; de har optimal pH-verdi for enzymaktivitet ved pH 3,5 bg pH 6-7 og aktiveres i motsetning til de foran nevnte av galle. Den ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte lipase har kun en optimal pH-verdi, nemlig pH 6,0, og aktiveres i høyere grad av galle enn de som er kjent fra britisk patent nr. 1.084.431. Disses enzymaktivi-
tet stiger ved tilsetning av fortynnet galle til høyst 123% av den opprinnelige, mens enzymaktiviteten av den ifølge oppfinnelsen fremstilte lipase stiger til ca. 200% av den opprinnelige aktivitet ved tilsetning av fortynnet galle.
Fra tysk patent nr. 1.442.093 er det kjent en lipase
som fremstilles ved dyrking av Rhisopus delemar. Denne lipases forhold til galle er ikke opplyst, men enzymaktiviteten inhi-
beres bemerkelsesverdig av Fe++ og forsvinner helt eller nesten helt ved konsentrasjoner av Fe<++> på 5,0 ppm. I motsetning til dette inhiberes den ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte lipase, når den har en spesifikk, aktivitet på 3750 enheter/mg,
ikke ved en konsentrasjon på 120 ppm Fe<++> (1 x> 10 3 mol) ved
måling ved pH 5-8 ved 4°C i 60 minutter.
Fra US patent nr.13.634.195 er det kjent en lipase som er fremstilt fra algesopper av slekten Åbsidia. En nærmere sammenligning med den ifølge oppfinnelsen fremstilte lipase er ikke mulig siden dette US patent ikke inneholder opplysning om det isolerede og rensede* enzyms egenskaper. Patentet inneholder heller ikke opplysning om at enzymets aktivitet skulle forsterkes av galle.
Under forskning og bedømmelse åv lipaseproduserende mikroorganismer, har man funnet at mikroorganismer som hører til slekten Phycomyces produserer en lipase, hvis enzymaktivitet øker betraktelig i nærvær av galle.
Hovedhensikten med foreliggende oppfinnelse er å til-veiebringe en industriell';gunstig fremgangsmåte for fremstilling av en ny mikrobiell lipase med en enzymaktivitet som økes betraktelig i nærvær av galle. Denne lipasen kan anvendes i et farmasøytisk preparat sammen med et gallepulver som eventuelt også inneholder andre fordøyelseshjelpende midler, og å tilveie-bringe typer av fettholdig mat, som smør, med en smak som er forbedret ved hjelp av lipasen.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-bragt en fremgangsmåte til fremstilling av lipase ved dyrking av en mikroorganisme i et kulturmedium, hvoretter den akkumulerte lipase separeres fra kulturmediet, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man som mikroorganisme anvender en stamme av artene Phycomyces nitens eller Phycomyces blakesleeanus.
Typiske eksempler på mikroorganismer som kan.benyttes
er Phycomyces nitens IFO-5'694, Phycomyces nitens IFO-569 5, .Phycomyces nitens NRRL-2444, Phycomyces nitens NRRL-2678, Phycomyces blakesleeanus IFO-5822, Phycomyces blakesleeanus IFO-5823, Phycomyces blakesleeanus IFO-5870, Phycomyces blakesleeanus IFO-5871. Alle disse arter er kjente. Artene med IFO-nummerering er lagret i "Institute for Fermentation",. Osaka, Japan, og organismene med NRRL-nummerering er lagret hos "Northern Utilization Research and Development Division",
USA's Landbruksdepartement. . Dyrkingen av mikroorganismen kan gjennomføres enten på fast eller væskeformet medium og det anbefales å benytte flytende medium for industrielt formål. Når'man bruker flytende medium, kan dyrkingen skje under aerobe forhold under rysting eller om-røring .
Kulturmediet som benyttes omfatter assimilerbare karbonkilder, fordøyelige nitrogenkilder,uorganiske salter, vekstbefordrende faktorer osv. :.
Karbonkildene kan være forskjellige kjente stoffer, f.eks. glukose, sukrose, mannose, dekstrin, cellulose, stivelse, oppløselig stivelse, glycerol, sorbitol, hv.etekli, riskli, molasse.
Nitrogenkildene er også av kjent type og kan f.eks.
være naturlige produkter eller stoffer avledet av .disse .(f.eks. pepton, kjøttekstrakt, kasein, maisbløtningsvæske, avfettet soyabønnepulver, soyabønnemel, soyabønnekake, tørrgjær,. gjær--ekstrakt, bomullsfrømel, gluten, casaminosyre, ammoniumsalter av organiske syrer (f.eks. ammohiumsuccinat, ammoniumtar.trat, ammoniumacetat) , uorganiske rii.trogenf orbindelser (f.eks. ammoniumklorid, ammoniumsulfat, ammoniumfosfat, natriumnitrat).
De uorganiske salter kan f.eks. være fofskjellige•fos-
fater, sulfater, hydroklorider.
Vekstfaktorene kan f.eks. være vitaminer, nukleinsyrer
og deres beslektede forbindelser.
Avhengig av metode.og betingelser under.dyrkingen kan
det øke akkumuleringen av det aktuelle enzym og tilsette et naturlig eller syntetisk antiskummiddel som soyabønneolj.e, silikpnolje etc, til' kulturmediet. 1
Det er gunstig å lage én forkultur i liten målestokk og deretter pode gjæringsmediet med denne forkultur.
Kulturmediéts temperatur, dyrkingstid, pH, gjennom-luftnings-graden, omrøringshastigheten og andre dyrkingsbe-tingelser vil variere en. del. avhengig av faktorer som den anvendte mikroorganisme, mediets sammensetning etc.,.og alt man. behøver, å gjøre er å velge og opprettholde slike dyrkingsbe-tingelser at produksjonen av den ønskede lipase er maksimal..
F.eks. kan dyrkingen skje ved en temperatur mellom 15 og 45°C, fortrinnsvis 20-40°Ci. 10-240 timer, fortrinnsvis 15-168. timer, ved-en pH-vérdi i området 4-10, fortrinnsvis - 5, 5-8 - ... og helst 6-8,.gjennomlufting 0,5-5 l/min./l medium, fortrinnsvis 0,5-3 l/min./l medium, omrøring ved 50-400 omdreininger -pr. minutt..
Dyrket på ovenstående måte vil den lipaseproduserende art utvikle og oppsamle en lipase i dyrkningsmediet. Når man bruker flytende medium, oppsamles lipasen for det meste i kulturmediets væskefase. I dette tilfellet er det gunstig å fjerne cellene ved hjelp av; en filterpressé eller sentrifuge og opparbeide lipasen fra det resulterende filtrat eller klare væske.
Lipaseoppløshingen i form av filtrert kultur eller
-ekstrakt kan konsentreres under nedsatt trykk.
For utvinning av lipasen kan man bruke de kjente separa-sjons- og rense-prosesser og kan få lipasen i ønsket renhet. Det aktuelle produktet kan isoleres ved å underkaste den lipaseholdige oppløsning fraksjonert utfelling med. et uorganisk salt som ammoniumsulfat, natriumsulfat eller natriumklorid eller alternativt ved å tilsette et egnet hydrofilt organisk oppløsn-ingsmiddel som.alkoholer (f.eks. metanol, etanol eller isopro-panol) eller aceton, til den samme oppløsning. Fellingene kan renses ytterligere på forøvrig kjent måte. Man kan også an-vende slike rensemetoder som adsorbsjon-desorbsjon på kalsium-fosfatgel, aluminiumoksyd, bentonit, ionevekslerharpiks etc; kromatografi på dietylaminoetylcellulose, karboksymetyl-cellulose eller andre cellulosederivater; molekylsikting (f.eks. dekstrangel som "Sephadex" eller "Biogel"), etc; utfelling med et protein-fellingsmiddel som en nukleinsyre, tannin, fosfor wolframat etc; isoelektrisk utfelling; dialyse; elektrodia-lyse; elektroforese; fjerning av forurensninger med et tung-metallsalt som f.eks. blyacetat, sinkacetat, bariumacetat, kalsiumacetat osv. På denne måten kan man få lipasepreparater i ønsket renhetsgrad som<oppløsning, pulver eller krystaller.
Den fremstilte lipase skiller seg fra andre kjente lipaser ved den betraktelige økning av aktiviteten i nærvær av galle,, f.eks. øker aktiviteten til ikke mindre enn 150% av opprinnelig aktivitet ved nærvær av hundegalle fortynnet til 1/200, målt under forhold ved 37°C i 0,IM fosfatpuffer ved pH 7,0 mot olivenolje (japansk farmasøytisk kvalitet, forkortet J.P.) som substrat etter 50 minutters enzymreaksjon.
Den .fremstilte lipase egner seg f.eks. som bestanddel i fordøyelsesmidler for mennesker eller dyr. Lipasen benyttes for behandling av f.eks. dyspepsi, funksjonell dyspepsi, akutt etter-operativ dyspepsi og kronisk pancreatitis. Preparater kan,inneholde en større eller mindre del lipase sammen med eller uten andre fordøyelsesmidler. For-døyelsesmidler kan gis på den måten som er velkjent for admini-strasjon av kjente lipaseholdige fordøyelsesmidler. Vanlig daglig dose av lipasen ligger i området 20-6000 enheter pr. voksen. •- -'' r
For ytterligere illustrasjonCav oppfinnelsen gis neden-stående eksempler, hvor "deler" er basert på vekt, hvis ikke noe annet er angitt og forholdet mellom "deler" og "volumdeler" svarer til forholdet mellom gram og milliliter. Millimikron forkortes "my" og mikron forkortes "y".
Definisjon av lipase-enhet: Det skal bemerkes at styrken av lipase i eksemplene er bestemt etter følgende fremgangsmåte: Det fremstilles et substrat ved å blande 2% poly-vinylalkohol og olivenolje (J.P.). i forholdet 3:1 (v/v) og homogenisering av blandingen i en homogenisator ved 4°C i 10 minutter. Deretter fylles et L-rør med 5 ml av dette substrat og 4 ml 0,1M fosfatpuffer (pH 7,0), fulgt av tilsetning av 1 ml av den lipaseoppløsning som skal undersøkes. Man lar reaksjonen foregå i et rysteapparat av Monod-typen ved 37°C i 50 minutter. Etter dette tidsrom avsluttes reaksjonen ved tilsetning av 20 ml av en blanding av aceton og etanol (1:1 v/v) og reaksjons-systemet titreres umiddelbart med en 0,05 N vandig oppløsning av NaOH mot 1% fenolftalein som indikator. En lipaseenhet (1 U) defineres som den enzymméngde som produserer en mengde frie fettsyrer 'som er ekvivalent til en mikromol oljesyre pr. minutt, og lipasens spesifikke aktivitet uttrykkes som enheter pr. mg lipase (U/mg).
Eksempel
En fermenteringstank med innhold 200 volumdeler fylles med 40 volumdeler flytende medium (pH 6,0) inneholdende 2,0% hvetekli, 0,5% riskli, 8,0% maisbløtningsvann, 0,5% KH2P04# 0,2% CaCl2, 2H20 og 0,1% "Actcol" (polymer av glycerol og propylenoksyd). Etter sterilisering inokuleres tanken med en av de nedenfor angitte arter og inkuberes ved 24°C under om-røring ved 240 omdreininger pr. minutt og gjennomlufting i en mengde på 1,0 deler luft pr. minutt pr. 1,0 del medium. Den ovenstående væske av kulturmediet måles med hensyn på lipaseaktivitet. Resultatene er oppført nedenfor. Man finner at alle de nevnte mikroorganismer danner og oppsamler lipase som viste høy aktivitet, ved ca. pH 7.
Hver av artene angitt nedenfor dyrkes 72 timer på lignende måte som ovenfor beskrevet og man tilsetter ammoniumsulfat til den ovenstående væske til en konsentrasjon på 50%. Fellingen avsaltes ved dialyse mot destillert vann ved 4°C og dialyseoppløsningen prøves for lipaseaktivitet med hensyn på optimal pH og temperatur og,med hensyn på aktivitetsøkning ved tilsetning av hundegalle. Resultatene fremgår nedenfor. Man ser at de dannede og oppsamlede enzymer fra organismene alle er identiske.
Et medium (pH .6, 0, 20 000 volumdeler) inneholdende 2% dekstrin, 2% maisbløtningsvann, 0,5% KH2P04, 0,05% MgS04-7H20
og 0, l%"Actcol", inokuleres med 500 volumdeler medium av samme
sammensetning hvori man hadde suspendert Phycomyces nitens.
NRRL 2444.
I en beholder med volum 50 000 deler inkuberes det inokulerte medium ved 28°C i 24 timer. 6000 volumdeler av ovenstående podn ing skul tur tilsettes 100 000 volumdeler medium
(pH 6,0) som inneholder 1% hvetekli, 1% riskli, 5% po 1 y pep ton>;;.'
0,5% KH2P04, 0,2% CaCl2-2H20 og 0,1%"Actcol" i en tank med
voluminnhold 200 000 volumdeler. Mediet inkuberes under følgende
forhold: Inkuberingstemperatur: 24°C, gjennomlufting 2 l/minutt/,
medium, omrøring ved 200 omdreininger pr. minutt og 66 timer.
pH-verdiene for mediet og produksjonen av lipase målt med . ■ . bestemte mellomrom under dyrkingen fremgår nedenfor.
Kulturmediet etter 66 timers dyrking ifølge ovenstående fremgangsmåte,avkjøles til ca. 5°C og cellene fjernes gjennom filterpresse tilsatt diatomé-jord ("Hyflo Super-cel"), og man får ca. 80 000 volumdeler filtrat. Til filtratet settes '. ammoniumsulfat til en konsentrasjon på 50% og fellingen sentri-fugerer ved 9000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter.-.Sedi-mentet avsaltes ved dialyse mot kaldt vann, idet man benytter fiskehudmembran, og dialysatet frysetørkes til 178 deler rå-[ enzym som et gråhvitt pulver. Lipaseaktiviteten for denhe.;..' prøven er 55 U/mg.
I 2000 volumdeler 10%-ig vandig oppløsning av.ammoniumsulfat oppløses 178 deler råenzym fremstilt ovenfor og oppløs-ningen fylles på en kolonne som inneholder "Asmit 173 NP"
(styrenharpiks). Enzymene som holdes fast i kolonnen elueres med 6000 volumdeler 10%-ig vandig ammoniumsulfatoppløsning og gjennomløpet, samt eluatet kombineres. Til den samlede opp-løsning settes ammoniumsulfat til en konsentrasjon på 50% og den resulterende felling dialyseres mot 0,02 M acetatpuffere (pH 5,0). Derpå påsettes diålysérésten på en kolonne av dietylaminoetylcellulose ("Serva Entwicklungslabor") i likevekt med 0,02 M acetatpuffer, pH 5,0, og man tilsetter ammoniumsulfat
til gjennomløpsvæsken til en'konsentrasjon på 60%. Enzymfrak-sjonen fåes på denne måten som en felling og fellingen dialyseres
■ -3
mot 0,02 M acetatpuffer inneholdende 2 x 10 M CaCl2 (pH 5,0). Dialyseresten adsorberes på en kolonne fylt méd dekstrangel (karboksymetylcellulose, "Sephadex C-50") innstilt i likevekt med samme puffer. Derpå elueres kolonnen med 0,15 M NaCl-oppløsning i samme puffer og man får 600 volumdeler med 0,15 M NaCl-oppløsning i samme puffer og man får 600 volumdeler lipaserik fraksjon. Eluatet ,avsaltes ved dialyse Tiiot destillert vann gjennom cellofanmembran ved 4°C og dialysatet frysetørkes til 0,7 deler renset enzym. Dette produktets spesifikke aktivitet er 2400 U/mg. De alminnelige egenskaper for dette produktet er oppført nedenfor:
A) Farge og form: hvitt pulverformet
B) Typisk elementæranalyse:
C, 46,12% ±0,26 H, 6,51% ± 0,07 N, 13,80% ± 0,20 C) Typisk molekylvekt (Andrews metode, Biochem. J. 91, 222 (1964): 25 000 ± 1000.
D) UV-absorbsjonsspektrum: Som det fremgår av figur 1, maks
1%
absorbsjon ved 275 til 280 my, E_0l_ . = 7,7.
J p' 280my, 1 cm
E) IR-spektrum: Som det fremgår av figur 2 (KBr-skive), finnes tydelige IR-absorbsjonstopper, i mikron;
3,0 (kraftig), 3,38 (middels), 6,05 (bred,.kraftig),
6,55 (bred, kraftig), 6,88 (svak), 7,15 (bred, middels), 8,13 (middels) og 9,3 (bred, svak). r?;-/ F) Isoelektrisk punkt (elektrofokuseringsmetode): pH 6,3 til 7,0. G) Oppløselighet: Oppløselig i vann og vandige saltoppløs-ninger med ionestyrke 0,01 til 0,1: uoppløselig i alkoholer, aceton og eter.
H) Virkning av pH på aktiviteten:
Optimal pH ligger innenfor 5 til 8, målt ved 37°C i
.50 minutter mot olivenolje (J.P.) som substrat. Virkningen av pH på aktiviteten måles på samme måten som angitt tidligere under "definisjon av lipase-enhet" og fremgår av av figur 3.
I) Virkning av temperatur på aktiviteten:
Optimaltemperatur er;fra 35 til 41°C, som måles i 0,1 M
fosfatpuffer ved pH 7,0 i 50 minutter mot olivenolje (J.P.) som substrat. Virkningen av temperatur på stabiliteten måles på samme måten som tidligere angitt i "definisjon av
lipase-enhet" og fremgår av figur 4.
J) Virkning av pH på stabiliteten.
Rest-lipaseaktivitet (%) etter 2 timers henstand ved 23°C ved forskjellig pH fremgår av figur 5. Enzymet er
stabilt over området pH 4 til pH 10.
K) Termostabilitet:
Rest-lipaseaktivitet (%) etter 10 minutters oppvarming i nærvær av 0,1 M fosfatpuffer ved pH 7 og forskjellige temperaturer fremgår av figur 6. Enzymet er stabilt ved temperaturer opp til 40°C, men inaktiveres^ ved 30% ved 45°C
og er nesten helt inaktivert ved 50°C.
L) Virkning av galle:
Lipaseaktiviteten målt mot olivenolje (J.P.) øker opp til ikke mindre enn 150% sammenlignet med egenaktiviteten når man tilsetter hundegalle fortynnet i forholdet 1/200.
Typiske eksperimenter er oppført i det følgende.
Gallen oppsamles direkte fra galleblæren hos en krysnings-hund (han-hund) med en sprøyte og fortynnes til .1/50, 1/100 og 1/200, hvoretter disse oppløsninger settes til
prøvepartier av lipase-substratsystemet for. å sammenligne forandringene i enzymaktivitet.
Som det fremgår av tabellen nedenfor økes den foreliggende lipasens aktivitet tydelig ved tilsetning av galle. Om-vendt blir aktiviteten for en sammenligningslipase utvunnet av Candida cylindracea (Agr. Biol. Chem. 30, nr. 11, 1097
(1956) inhibert av galle.
H') Virkning av pH på aktiviteten: Optimal pH ligger innenfor
5 til 8, målt ved 37°C i 50 minutter mot olivenolje (J.P.)
som substrat. Virkning av pH på aktiviteten måles som beskrevet i "Definisjon av lipaseenhet" og fremgår av figur 9.
.1'.);, Virkning, av temperatur på aktiviteten: Optimal temperatur éf fra 35 til 41°C, målt i 0,1 M fosfatpuffer ved pH 7,0 i 50 minutter mot olivenolje (J.P.) som substrat. Virkning av temperaturen på aktiviteten måles på samme måten som ovenfor beskrevet under "Definisjon av lipaseenhet"
og fremgår av figur 10.
J<1>) Virkning av pH på stabiliteten: Rest-lipaseaktivitet(%)
etter 2 timers henstand ved 23°C ved forskjellig pH fremgår av figur 11. Enzymet er stabilt i området pH 4 til pH 10.
K') Temperaturstabilitet: Rest-lipaseaktivitet etter 10 minutters behandling av enzymoppløsningen ved pH 7 og forskjellige temperaturer fremgår av figur 12. Enzymet er stabilt ved temperaturer opp til 40°C, men inaktiveres 30% ved 40°C og
nesten fullstendig ved 50°C.
L<1>) Virkning av inhibitor: Lipase-aktiyiteten i oppløsning som _4 inneholder 0,05% (vekt/volum) lipase og 5 x 10 mol diisopropylfluorfosfat (DFP), metylendlamintetraeddiksyre (EDTA) eller p-klormercuribenzoat (PCMB) måles etter henstand ved pH 5 til 8 og 4°C i 1 time. Resultatene er som følger:
Som det fremgår ovenfor er lipasen stabil overfor disse reagenser. Derfor er lipasen ikke et såkalt metallenzym, SH-enzym eller serinenzym.
M<1>) Resultater av aminosyreanalysen:
(i) har ingen cysteinrest.
(ii) har to S-S-bindinger.
(iii) har to tryptofanrester.
I 24 volumdeler destillert vann oppløses 2,4 deler enzym fremstilt som ovenfor. Oppløsningen kjøres gjennom, en kolonne fylt med cellulosepulver, 200 til 300 mesh, cellulosen innstilles i likevekt med 0,02 M acetatpuffer (pH 5,0) som inne--3
holder 2 x 10 . M CaCl~. Derpå vaskes kolonnen med 0,02 M acetatpuffer (pH 5,0) som inneholder 2 x 10 M CaCl,,, og man får 200 volumdeler eluater. Til eluatet settes ammoniumsulfat opptil 50% (w/v) og det dannes en felling. Fellingen sentri-fugeres fra (9000 omdreininger pr. minutt, 10 minutter) og dialyseres mot acetatpufferen i 7 2 timer. 67 volumdeler av dialyseresten føres gjennom en kolonne fylt med dekstran (karboksymetyl-"Sephadex C-50", i likevekt med nevnte acetatpuffer) for adsorbsjon av enzymet.
Kolonnen elueres méd en oppløsning av 0,1 M natriumklorid og man får 23 volumdeler lipasefraksjon. Fraksjonen hensettes ved 4°C over natten og man kan oppsamle 0,185 deler krystaller av enzymet. Produktets spesifikke aktivitet er 37 50 U/mg.
Dette produktets generelle egenskaper er:
A'.) Farge: hvit
B<1>) Typisk elementæranalyse:
C, 47,05% 0,05
H, 6,48% ± 0, 02
N, 13,99% ±0,01
C) Typisk molvekt (Andrews metode, Biochem. J., 91, 222 (1964) og S.D.S.-polyakrylamidgelelektroforese, J. Biol. Chem., 244, 5074 (1969)
26 000 ± .1000
D1) UV-absorbsjonsspektrum: Som det fremgår av figur 7, maksimum
absorbsjon ved 275 til 280 my, ^280 my lem = 10,1.
E<1>) IR-spektrum (som det fremgår av figur 8 (KBr-skive):
absorbsjonstopper i mikron som følger:
3,0 (kraftig), 3,38 (middels), 6,05 (bred, kraftig),
6,55 (bred, kraftig), 6,88 (svak), 7,15 (bred, middels), 8,12 (middels) og 9,3 (bred, svak).
F') isoelektrisk punkt (elektrofokuseringsmetode):
pH 5,8 til 6,7.
G') Oppløselighet: Oppløselig i vann og vandige saltoppløs-ninger med ionestyrké 0,01 til 0,1, uoppløselig i alkoholer,
aceton og eter..
(iv) har ingen sacchariddel..
(v) har ingen lipidrest.
N<1>) Virkning av galle: Lipasevirkningen målt mot olivenolje (J.P.) økes opp til 150% sammenlignet med aktiviteten -
uten tilsetning, ved tilsetning av hundegalle fortynnet i forholdet 1/200.
De typiske eksperimenter utføres på samme måten som
tidligere beskrevet under "(L) virkning av galle".
Resultatene fremgår nedenfor:
Bemerk: Olivenolje (J.P.) brukes som substrat.
Claims (1)
1. Fremgangsmåte til fremstilling av lipase ved dyrking av en mikroorganisme i et kulturmedium, hvoretter den akkumu lerte lipase separeres fra kulturmediet, karakt er 1 sert ved at man som mikroorganisme anvender en stamme av artene Phycomyces nitens eller Phycomyces blakesleeanus.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP47094222A JPS5017559B2 (no) | 1972-09-20 | 1972-09-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO139353B true NO139353B (no) | 1978-11-13 |
NO139353C NO139353C (no) | 1979-02-21 |
Family
ID=14104274
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO349673A NO139353C (no) | 1972-09-20 | 1973-09-06 | Fremgangsmaate til fremstilling av lipase |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5017559B2 (no) |
AT (1) | AT322489B (no) |
BE (1) | BE804921A (no) |
CA (1) | CA996045A (no) |
CH (1) | CH585792A5 (no) |
CS (1) | CS185629B2 (no) |
DE (1) | DE2346335A1 (no) |
DK (1) | DK135384B (no) |
ES (1) | ES418898A1 (no) |
FI (1) | FI51951C (no) |
FR (1) | FR2199974B1 (no) |
GB (1) | GB1442677A (no) |
HU (1) | HU169794B (no) |
IT (1) | IT1014023B (no) |
NL (1) | NL7312936A (no) |
NO (1) | NO139353C (no) |
PH (1) | PH13554A (no) |
PL (1) | PL91581B1 (no) |
SE (1) | SE396963B (no) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4944944A (en) * | 1987-11-19 | 1990-07-31 | Oklahoma Medical Research Foundation | Dietary compositions and methods using bile salt-activated lipase |
JP2000026311A (ja) * | 1998-07-02 | 2000-01-25 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 胃排出能亢進剤組成物 |
EP1149585A1 (en) * | 2000-04-27 | 2001-10-31 | Warner-Lambert Company | Use of recombinant gastric lipase for treating functional dyspepsia |
CN101068565B (zh) | 2004-10-14 | 2010-11-17 | 胞囊纤维化基础治疗公司 | 治疗胰腺功能不全的包含脂酶、蛋白酶和淀粉酶的组合物 |
CN106715465B (zh) * | 2014-04-15 | 2021-10-08 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
TWI662131B (zh) * | 2018-11-27 | 2019-06-11 | 台灣中油股份有限公司 | 一種米糠脂肪酶的製備方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1332663A (en) * | 1969-10-14 | 1973-10-03 | Sugiura M | Lysosome labilizer preparation thereof and compositions including the same |
-
1972
- 1972-09-20 JP JP47094222A patent/JPS5017559B2/ja not_active Expired
-
1973
- 1973-09-06 NO NO349673A patent/NO139353C/no unknown
- 1973-09-14 DE DE19732346335 patent/DE2346335A1/de active Pending
- 1973-09-17 PH PH15029A patent/PH13554A/en unknown
- 1973-09-17 CS CS639473A patent/CS185629B2/cs unknown
- 1973-09-17 FI FI288073A patent/FI51951C/fi active
- 1973-09-17 HU HUTA001269 patent/HU169794B/hu unknown
- 1973-09-17 BE BE135703A patent/BE804921A/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-09-18 CH CH1337173A patent/CH585792A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-09-19 GB GB4394373A patent/GB1442677A/en not_active Expired
- 1973-09-19 CA CA181,452A patent/CA996045A/en not_active Expired
- 1973-09-19 FR FR7333640A patent/FR2199974B1/fr not_active Expired
- 1973-09-19 ES ES418898A patent/ES418898A1/es not_active Expired
- 1973-09-19 NL NL7312936A patent/NL7312936A/xx unknown
- 1973-09-19 DK DK511573A patent/DK135384B/da unknown
- 1973-09-19 IT IT6977173A patent/IT1014023B/it active
- 1973-09-19 SE SE7312777A patent/SE396963B/xx unknown
- 1973-09-20 AT AT809873A patent/AT322489B/de not_active IP Right Cessation
- 1973-09-20 PL PL16532773A patent/PL91581B1/pl unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL91581B1 (no) | 1977-03-31 |
SE396963B (sv) | 1977-10-10 |
IT1014023B (it) | 1977-04-20 |
HU169794B (no) | 1977-02-28 |
DK135384C (no) | 1977-10-03 |
NO139353C (no) | 1979-02-21 |
NL7312936A (no) | 1974-03-22 |
BE804921A (fr) | 1974-03-18 |
DK135384B (da) | 1977-04-18 |
JPS4948887A (no) | 1974-05-11 |
PH13554A (en) | 1980-06-26 |
FI51951B (no) | 1977-01-31 |
FI51951C (fi) | 1977-05-10 |
AT322489B (de) | 1975-05-26 |
ES418898A1 (es) | 1976-03-01 |
FR2199974A1 (no) | 1974-04-19 |
CH585792A5 (no) | 1977-03-15 |
AU6040573A (en) | 1975-03-20 |
JPS5017559B2 (no) | 1975-06-21 |
CA996045A (en) | 1976-08-31 |
GB1442677A (en) | 1976-07-14 |
FR2199974B1 (no) | 1977-01-28 |
DE2346335A1 (de) | 1974-03-28 |
CS185629B2 (en) | 1978-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4062732A (en) | Process of producing acid stable protease | |
EP0204284A2 (en) | A novel lipase | |
EP0104554B1 (en) | Preparation of an alkaline protease from flavobacterium arborescens | |
NO139353B (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av lipase | |
US4473644A (en) | Acid stable protease from mutants of genus Rhizopus | |
US3616234A (en) | Method of preparing protease from candida lipolytica | |
US3684658A (en) | Enzymes and process for their preparation | |
US4141791A (en) | Milk coagulating microbial enzyme | |
Ogundero et al. | The purification and activities of an alkaline protease of Aspergillus clavatus from Nigerian poultry feeds | |
US3186919A (en) | Process for preparing galactose oxidase by fermentation | |
CN100445369C (zh) | 一株吉兰泰嗜盐杆菌及其应用 | |
US3855065A (en) | Production of streptokinase | |
JP2525529B2 (ja) | リボフラビン発酵からの噴霧乾燥生成物中のリボフラビン含有量を増加する方法 | |
Sushma et al. | Isolation, production and purification of lipase from Aspergillus niger using gingerly oil cake as substrate | |
CN115232767B (zh) | 一种Parasphingorhabdus sp.菌株制备生物絮凝剂的方法 | |
NO134260B (no) | ||
RU2077577C1 (ru) | Штамм бактерии delcya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы | |
US4717665A (en) | Recovery of microbial lipase | |
DE2033822A1 (de) | Hydrolytisches Enzymgemisch und Ver fahren zu dessen Herstellung | |
Ogundero | Partial purification and activities of an extracellular lipase of Thermomyces lanuginosus from Nigerian palm produce | |
JPS5836953B2 (ja) | シンキナリパ−ゼノセイゾウホウ | |
SU1703689A1 (ru) | Штамм гриба РеNIсILLIUм caNeSceNS продуцент @ -фруктофуранозидазы | |
RU1804479C (ru) | Способ получени культуральной жидкости SеRRатIа маRсеSсеNS, обладающей хитиназной активностью | |
JPS5840466B2 (ja) | アシル−CoA・オキシダ−ゼの製造法 | |
SU1440921A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS меGатеRIUм-продуцент металлопротеиназы |