NO139353B - Fremgangsmaate til fremstilling av lipase - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av en ny lipase hvis enzymaktivitet økes betraktelig i nærvær av galle.

Man har hittil beskrevet forskjellige typer mikrobielle lipaser. For eksempel beskrives lipaser fra Candida cylindracea og fra Propionibacterium shermanii i "Agricultural and Biological Chemistry", bind 30, nr. 6, side 576-584 (1966) og "Applied Microbiology", bind 20, nr. 1, side 16-22 (1970), respektivt. Disse lipaser vet man imidlertid inaktiveres med galle.

Fra britisk patent nr. 1.084.431 er. det kjent lipaser

fra algesopper av slektene Mucor og Rhizopus; de har optimal pH-verdi for enzymaktivitet ved pH 3,5 bg pH 6-7 og aktiveres i motsetning til de foran nevnte av galle. Den ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte lipase har kun en optimal pH-verdi, nemlig pH 6,0, og aktiveres i høyere grad av galle enn de som er kjent fra britisk patent nr. 1.084.431. Disses enzymaktivi-

tet stiger ved tilsetning av fortynnet galle til høyst 123% av den opprinnelige, mens enzymaktiviteten av den ifølge oppfinnelsen fremstilte lipase stiger til ca. 200% av den opprinnelige aktivitet ved tilsetning av fortynnet galle.

Fra tysk patent nr. 1.442.093 er det kjent en lipase

som fremstilles ved dyrking av Rhisopus delemar. Denne lipases forhold til galle er ikke opplyst, men enzymaktiviteten inhi-

beres bemerkelsesverdig av Fe++ og forsvinner helt eller nesten helt ved konsentrasjoner av Fe<++> på 5,0 ppm. I motsetning til dette inhiberes den ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte lipase, når den har en spesifikk, aktivitet på 3750 enheter/mg,

ikke ved en konsentrasjon på 120 ppm Fe<++> (1 x> 10 3 mol) ved

måling ved pH 5-8 ved 4°C i 60 minutter.

Fra US patent nr.13.634.195 er det kjent en lipase som er fremstilt fra algesopper av slekten Åbsidia. En nærmere sammenligning med den ifølge oppfinnelsen fremstilte lipase er ikke mulig siden dette US patent ikke inneholder opplysning om det isolerede og rensede* enzyms egenskaper. Patentet inneholder heller ikke opplysning om at enzymets aktivitet skulle forsterkes av galle.

Under forskning og bedømmelse åv lipaseproduserende mikroorganismer, har man funnet at mikroorganismer som hører til slekten Phycomyces produserer en lipase, hvis enzymaktivitet øker betraktelig i nærvær av galle.

Hovedhensikten med foreliggende oppfinnelse er å til-veiebringe en industriell';gunstig fremgangsmåte for fremstilling av en ny mikrobiell lipase med en enzymaktivitet som økes betraktelig i nærvær av galle. Denne lipasen kan anvendes i et farmasøytisk preparat sammen med et gallepulver som eventuelt også inneholder andre fordøyelseshjelpende midler, og å tilveie-bringe typer av fettholdig mat, som smør, med en smak som er forbedret ved hjelp av lipasen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-bragt en fremgangsmåte til fremstilling av lipase ved dyrking av en mikroorganisme i et kulturmedium, hvoretter den akkumulerte lipase separeres fra kulturmediet, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man som mikroorganisme anvender en stamme av artene Phycomyces nitens eller Phycomyces blakesleeanus.

Typiske eksempler på mikroorganismer som kan.benyttes

er Phycomyces nitens IFO-5'694, Phycomyces nitens IFO-569 5, .Phycomyces nitens NRRL-2444, Phycomyces nitens NRRL-2678, Phycomyces blakesleeanus IFO-5822, Phycomyces blakesleeanus IFO-5823, Phycomyces blakesleeanus IFO-5870, Phycomyces blakesleeanus IFO-5871. Alle disse arter er kjente. Artene med IFO-nummerering er lagret i "Institute for Fermentation",. Osaka, Japan, og organismene med NRRL-nummerering er lagret hos "Northern Utilization Research and Development Division",

USA's Landbruksdepartement. . Dyrkingen av mikroorganismen kan gjennomføres enten på fast eller væskeformet medium og det anbefales å benytte flytende medium for industrielt formål. Når'man bruker flytende medium, kan dyrkingen skje under aerobe forhold under rysting eller om-røring .

Kulturmediet som benyttes omfatter assimilerbare karbonkilder, fordøyelige nitrogenkilder,uorganiske salter, vekstbefordrende faktorer osv. :.

Karbonkildene kan være forskjellige kjente stoffer, f.eks. glukose, sukrose, mannose, dekstrin, cellulose, stivelse, oppløselig stivelse, glycerol, sorbitol, hv.etekli, riskli, molasse.

Nitrogenkildene er også av kjent type og kan f.eks.

være naturlige produkter eller stoffer avledet av .disse .(f.eks. pepton, kjøttekstrakt, kasein, maisbløtningsvæske, avfettet soyabønnepulver, soyabønnemel, soyabønnekake, tørrgjær,. gjær--ekstrakt, bomullsfrømel, gluten, casaminosyre, ammoniumsalter av organiske syrer (f.eks. ammohiumsuccinat, ammoniumtar.trat, ammoniumacetat) , uorganiske rii.trogenf orbindelser (f.eks. ammoniumklorid, ammoniumsulfat, ammoniumfosfat, natriumnitrat).

De uorganiske salter kan f.eks. være fofskjellige•fos-

fater, sulfater, hydroklorider.

Vekstfaktorene kan f.eks. være vitaminer, nukleinsyrer

og deres beslektede forbindelser.

Avhengig av metode.og betingelser under.dyrkingen kan

det øke akkumuleringen av det aktuelle enzym og tilsette et naturlig eller syntetisk antiskummiddel som soyabønneolj.e, silikpnolje etc, til' kulturmediet. 1

Det er gunstig å lage én forkultur i liten målestokk og deretter pode gjæringsmediet med denne forkultur.

Kulturmediéts temperatur, dyrkingstid, pH, gjennom-luftnings-graden, omrøringshastigheten og andre dyrkingsbe-tingelser vil variere en. del. avhengig av faktorer som den anvendte mikroorganisme, mediets sammensetning etc.,.og alt man. behøver, å gjøre er å velge og opprettholde slike dyrkingsbe-tingelser at produksjonen av den ønskede lipase er maksimal..

F.eks. kan dyrkingen skje ved en temperatur mellom 15 og 45°C, fortrinnsvis 20-40°Ci. 10-240 timer, fortrinnsvis 15-168. timer, ved-en pH-vérdi i området 4-10, fortrinnsvis - 5, 5-8 - ... og helst 6-8,.gjennomlufting 0,5-5 l/min./l medium, fortrinnsvis 0,5-3 l/min./l medium, omrøring ved 50-400 omdreininger -pr. minutt..

Dyrket på ovenstående måte vil den lipaseproduserende art utvikle og oppsamle en lipase i dyrkningsmediet. Når man bruker flytende medium, oppsamles lipasen for det meste i kulturmediets væskefase. I dette tilfellet er det gunstig å fjerne cellene ved hjelp av; en filterpressé eller sentrifuge og opparbeide lipasen fra det resulterende filtrat eller klare væske.

Lipaseoppløshingen i form av filtrert kultur eller

-ekstrakt kan konsentreres under nedsatt trykk.

For utvinning av lipasen kan man bruke de kjente separa-sjons- og rense-prosesser og kan få lipasen i ønsket renhet. Det aktuelle produktet kan isoleres ved å underkaste den lipaseholdige oppløsning fraksjonert utfelling med. et uorganisk salt som ammoniumsulfat, natriumsulfat eller natriumklorid eller alternativt ved å tilsette et egnet hydrofilt organisk oppløsn-ingsmiddel som.alkoholer (f.eks. metanol, etanol eller isopro-panol) eller aceton, til den samme oppløsning. Fellingene kan renses ytterligere på forøvrig kjent måte. Man kan også an-vende slike rensemetoder som adsorbsjon-desorbsjon på kalsium-fosfatgel, aluminiumoksyd, bentonit, ionevekslerharpiks etc; kromatografi på dietylaminoetylcellulose, karboksymetyl-cellulose eller andre cellulosederivater; molekylsikting (f.eks. dekstrangel som "Sephadex" eller "Biogel"), etc; utfelling med et protein-fellingsmiddel som en nukleinsyre, tannin, fosfor wolframat etc; isoelektrisk utfelling; dialyse; elektrodia-lyse; elektroforese; fjerning av forurensninger med et tung-metallsalt som f.eks. blyacetat, sinkacetat, bariumacetat, kalsiumacetat osv. På denne måten kan man få lipasepreparater i ønsket renhetsgrad som<oppløsning, pulver eller krystaller.

Den fremstilte lipase skiller seg fra andre kjente lipaser ved den betraktelige økning av aktiviteten i nærvær av galle,, f.eks. øker aktiviteten til ikke mindre enn 150% av opprinnelig aktivitet ved nærvær av hundegalle fortynnet til 1/200, målt under forhold ved 37°C i 0,IM fosfatpuffer ved pH 7,0 mot olivenolje (japansk farmasøytisk kvalitet, forkortet J.P.) som substrat etter 50 minutters enzymreaksjon.

Den .fremstilte lipase egner seg f.eks. som bestanddel i fordøyelsesmidler for mennesker eller dyr. Lipasen benyttes for behandling av f.eks. dyspepsi, funksjonell dyspepsi, akutt etter-operativ dyspepsi og kronisk pancreatitis. Preparater kan,inneholde en større eller mindre del lipase sammen med eller uten andre fordøyelsesmidler. For-døyelsesmidler kan gis på den måten som er velkjent for admini-strasjon av kjente lipaseholdige fordøyelsesmidler. Vanlig daglig dose av lipasen ligger i området 20-6000 enheter pr. voksen. •- -'' r

For ytterligere illustrasjonCav oppfinnelsen gis neden-stående eksempler, hvor "deler" er basert på vekt, hvis ikke noe annet er angitt og forholdet mellom "deler" og "volumdeler" svarer til forholdet mellom gram og milliliter. Millimikron forkortes "my" og mikron forkortes "y".

Definisjon av lipase-enhet: Det skal bemerkes at styrken av lipase i eksemplene er bestemt etter følgende fremgangsmåte: Det fremstilles et substrat ved å blande 2% poly-vinylalkohol og olivenolje (J.P.). i forholdet 3:1 (v/v) og homogenisering av blandingen i en homogenisator ved 4°C i 10 minutter. Deretter fylles et L-rør med 5 ml av dette substrat og 4 ml 0,1M fosfatpuffer (pH 7,0), fulgt av tilsetning av 1 ml av den lipaseoppløsning som skal undersøkes. Man lar reaksjonen foregå i et rysteapparat av Monod-typen ved 37°C i 50 minutter. Etter dette tidsrom avsluttes reaksjonen ved tilsetning av 20 ml av en blanding av aceton og etanol (1:1 v/v) og reaksjons-systemet titreres umiddelbart med en 0,05 N vandig oppløsning av NaOH mot 1% fenolftalein som indikator. En lipaseenhet (1 U) defineres som den enzymméngde som produserer en mengde frie fettsyrer 'som er ekvivalent til en mikromol oljesyre pr. minutt, og lipasens spesifikke aktivitet uttrykkes som enheter pr. mg lipase (U/mg).

Eksempel

En fermenteringstank med innhold 200 volumdeler fylles med 40 volumdeler flytende medium (pH 6,0) inneholdende 2,0% hvetekli, 0,5% riskli, 8,0% maisbløtningsvann, 0,5% KH2P04# 0,2% CaCl2, 2H20 og 0,1% "Actcol" (polymer av glycerol og propylenoksyd). Etter sterilisering inokuleres tanken med en av de nedenfor angitte arter og inkuberes ved 24°C under om-røring ved 240 omdreininger pr. minutt og gjennomlufting i en mengde på 1,0 deler luft pr. minutt pr. 1,0 del medium. Den ovenstående væske av kulturmediet måles med hensyn på lipaseaktivitet. Resultatene er oppført nedenfor. Man finner at alle de nevnte mikroorganismer danner og oppsamler lipase som viste høy aktivitet, ved ca. pH 7.

Hver av artene angitt nedenfor dyrkes 72 timer på lignende måte som ovenfor beskrevet og man tilsetter ammoniumsulfat til den ovenstående væske til en konsentrasjon på 50%. Fellingen avsaltes ved dialyse mot destillert vann ved 4°C og dialyseoppløsningen prøves for lipaseaktivitet med hensyn på optimal pH og temperatur og,med hensyn på aktivitetsøkning ved tilsetning av hundegalle. Resultatene fremgår nedenfor. Man ser at de dannede og oppsamlede enzymer fra organismene alle er identiske.

Et medium (pH .6, 0, 20 000 volumdeler) inneholdende 2% dekstrin, 2% maisbløtningsvann, 0,5% KH2P04, 0,05% MgS04-7H20

og 0, l%"Actcol", inokuleres med 500 volumdeler medium av samme

sammensetning hvori man hadde suspendert Phycomyces nitens.

NRRL 2444.

I en beholder med volum 50 000 deler inkuberes det inokulerte medium ved 28°C i 24 timer. 6000 volumdeler av ovenstående podn ing skul tur tilsettes 100 000 volumdeler medium

(pH 6,0) som inneholder 1% hvetekli, 1% riskli, 5% po 1 y pep ton>;;.'

0,5% KH2P04, 0,2% CaCl2-2H20 og 0,1%"Actcol" i en tank med

voluminnhold 200 000 volumdeler. Mediet inkuberes under følgende

forhold: Inkuberingstemperatur: 24°C, gjennomlufting 2 l/minutt/,

medium, omrøring ved 200 omdreininger pr. minutt og 66 timer.

pH-verdiene for mediet og produksjonen av lipase målt med . ■ . bestemte mellomrom under dyrkingen fremgår nedenfor.

Kulturmediet etter 66 timers dyrking ifølge ovenstående fremgangsmåte,avkjøles til ca. 5°C og cellene fjernes gjennom filterpresse tilsatt diatomé-jord ("Hyflo Super-cel"), og man får ca. 80 000 volumdeler filtrat. Til filtratet settes '. ammoniumsulfat til en konsentrasjon på 50% og fellingen sentri-fugerer ved 9000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter.-.Sedi-mentet avsaltes ved dialyse mot kaldt vann, idet man benytter fiskehudmembran, og dialysatet frysetørkes til 178 deler rå-[ enzym som et gråhvitt pulver. Lipaseaktiviteten for denhe.;..' prøven er 55 U/mg.

I 2000 volumdeler 10%-ig vandig oppløsning av.ammoniumsulfat oppløses 178 deler råenzym fremstilt ovenfor og oppløs-ningen fylles på en kolonne som inneholder "Asmit 173 NP"

(styrenharpiks). Enzymene som holdes fast i kolonnen elueres med 6000 volumdeler 10%-ig vandig ammoniumsulfatoppløsning og gjennomløpet, samt eluatet kombineres. Til den samlede opp-løsning settes ammoniumsulfat til en konsentrasjon på 50% og den resulterende felling dialyseres mot 0,02 M acetatpuffere (pH 5,0). Derpå påsettes diålysérésten på en kolonne av dietylaminoetylcellulose ("Serva Entwicklungslabor") i likevekt med 0,02 M acetatpuffer, pH 5,0, og man tilsetter ammoniumsulfat

til gjennomløpsvæsken til en'konsentrasjon på 60%. Enzymfrak-sjonen fåes på denne måten som en felling og fellingen dialyseres

■ -3

mot 0,02 M acetatpuffer inneholdende 2 x 10 M CaCl2 (pH 5,0). Dialyseresten adsorberes på en kolonne fylt méd dekstrangel (karboksymetylcellulose, "Sephadex C-50") innstilt i likevekt med samme puffer. Derpå elueres kolonnen med 0,15 M NaCl-oppløsning i samme puffer og man får 600 volumdeler med 0,15 M NaCl-oppløsning i samme puffer og man får 600 volumdeler lipaserik fraksjon. Eluatet ,avsaltes ved dialyse Tiiot destillert vann gjennom cellofanmembran ved 4°C og dialysatet frysetørkes til 0,7 deler renset enzym. Dette produktets spesifikke aktivitet er 2400 U/mg. De alminnelige egenskaper for dette produktet er oppført nedenfor:

A) Farge og form: hvitt pulverformet

B) Typisk elementæranalyse:

C, 46,12% ±0,26 H, 6,51% ± 0,07 N, 13,80% ± 0,20 C) Typisk molekylvekt (Andrews metode, Biochem. J. 91, 222 (1964): 25 000 ± 1000.

D) UV-absorbsjonsspektrum: Som det fremgår av figur 1, maks

1%

absorbsjon ved 275 til 280 my, E_0l_ . = 7,7.

J p' 280my, 1 cm

E) IR-spektrum: Som det fremgår av figur 2 (KBr-skive), finnes tydelige IR-absorbsjonstopper, i mikron;

3,0 (kraftig), 3,38 (middels), 6,05 (bred,.kraftig),

6,55 (bred, kraftig), 6,88 (svak), 7,15 (bred, middels), 8,13 (middels) og 9,3 (bred, svak). r?;-/ F) Isoelektrisk punkt (elektrofokuseringsmetode): pH 6,3 til 7,0. G) Oppløselighet: Oppløselig i vann og vandige saltoppløs-ninger med ionestyrke 0,01 til 0,1: uoppløselig i alkoholer, aceton og eter.

H) Virkning av pH på aktiviteten:

Optimal pH ligger innenfor 5 til 8, målt ved 37°C i

.50 minutter mot olivenolje (J.P.) som substrat. Virkningen av pH på aktiviteten måles på samme måten som angitt tidligere under "definisjon av lipase-enhet" og fremgår av av figur 3.

I) Virkning av temperatur på aktiviteten:

Optimaltemperatur er;fra 35 til 41°C, som måles i 0,1 M fosfatpuffer ved pH 7,0 i 50 minutter mot olivenolje (J.P.) som substrat. Virkningen av temperatur på stabiliteten måles på samme måten som tidligere angitt i "definisjon av

lipase-enhet" og fremgår av figur 4.

J) Virkning av pH på stabiliteten.

Rest-lipaseaktivitet (%) etter 2 timers henstand ved 23°C ved forskjellig pH fremgår av figur 5. Enzymet er

stabilt over området pH 4 til pH 10.

K) Termostabilitet:

Rest-lipaseaktivitet (%) etter 10 minutters oppvarming i nærvær av 0,1 M fosfatpuffer ved pH 7 og forskjellige temperaturer fremgår av figur 6. Enzymet er stabilt ved temperaturer opp til 40°C, men inaktiveres^ ved 30% ved 45°C

og er nesten helt inaktivert ved 50°C.

L) Virkning av galle:

Lipaseaktiviteten målt mot olivenolje (J.P.) øker opp til ikke mindre enn 150% sammenlignet med egenaktiviteten når man tilsetter hundegalle fortynnet i forholdet 1/200.

Typiske eksperimenter er oppført i det følgende.

Gallen oppsamles direkte fra galleblæren hos en krysnings-hund (han-hund) med en sprøyte og fortynnes til .1/50, 1/100 og 1/200, hvoretter disse oppløsninger settes til

prøvepartier av lipase-substratsystemet for. å sammenligne forandringene i enzymaktivitet.

Som det fremgår av tabellen nedenfor økes den foreliggende lipasens aktivitet tydelig ved tilsetning av galle. Om-vendt blir aktiviteten for en sammenligningslipase utvunnet av Candida cylindracea (Agr. Biol. Chem. 30, nr. 11, 1097

(1956) inhibert av galle.

H') Virkning av pH på aktiviteten: Optimal pH ligger innenfor

5 til 8, målt ved 37°C i 50 minutter mot olivenolje (J.P.)

som substrat. Virkning av pH på aktiviteten måles som beskrevet i "Definisjon av lipaseenhet" og fremgår av figur 9.

.1'.);, Virkning, av temperatur på aktiviteten: Optimal temperatur éf fra 35 til 41°C, målt i 0,1 M fosfatpuffer ved pH 7,0 i 50 minutter mot olivenolje (J.P.) som substrat. Virkning av temperaturen på aktiviteten måles på samme måten som ovenfor beskrevet under "Definisjon av lipaseenhet"

og fremgår av figur 10.

J<1>) Virkning av pH på stabiliteten: Rest-lipaseaktivitet(%)

etter 2 timers henstand ved 23°C ved forskjellig pH fremgår av figur 11. Enzymet er stabilt i området pH 4 til pH 10.

K') Temperaturstabilitet: Rest-lipaseaktivitet etter 10 minutters behandling av enzymoppløsningen ved pH 7 og forskjellige temperaturer fremgår av figur 12. Enzymet er stabilt ved temperaturer opp til 40°C, men inaktiveres 30% ved 40°C og

nesten fullstendig ved 50°C.

L<1>) Virkning av inhibitor: Lipase-aktiyiteten i oppløsning som _4 inneholder 0,05% (vekt/volum) lipase og 5 x 10 mol diisopropylfluorfosfat (DFP), metylendlamintetraeddiksyre (EDTA) eller p-klormercuribenzoat (PCMB) måles etter henstand ved pH 5 til 8 og 4°C i 1 time. Resultatene er som følger:

Som det fremgår ovenfor er lipasen stabil overfor disse reagenser. Derfor er lipasen ikke et såkalt metallenzym, SH-enzym eller serinenzym.

M<1>) Resultater av aminosyreanalysen:

(i) har ingen cysteinrest.

(ii) har to S-S-bindinger.

(iii) har to tryptofanrester.

I 24 volumdeler destillert vann oppløses 2,4 deler enzym fremstilt som ovenfor. Oppløsningen kjøres gjennom, en kolonne fylt med cellulosepulver, 200 til 300 mesh, cellulosen innstilles i likevekt med 0,02 M acetatpuffer (pH 5,0) som inne--3

holder 2 x 10 . M CaCl~. Derpå vaskes kolonnen med 0,02 M acetatpuffer (pH 5,0) som inneholder 2 x 10 M CaCl,,, og man får 200 volumdeler eluater. Til eluatet settes ammoniumsulfat opptil 50% (w/v) og det dannes en felling. Fellingen sentri-fugeres fra (9000 omdreininger pr. minutt, 10 minutter) og dialyseres mot acetatpufferen i 7 2 timer. 67 volumdeler av dialyseresten føres gjennom en kolonne fylt med dekstran (karboksymetyl-"Sephadex C-50", i likevekt med nevnte acetatpuffer) for adsorbsjon av enzymet.

Kolonnen elueres méd en oppløsning av 0,1 M natriumklorid og man får 23 volumdeler lipasefraksjon. Fraksjonen hensettes ved 4°C over natten og man kan oppsamle 0,185 deler krystaller av enzymet. Produktets spesifikke aktivitet er 37 50 U/mg.

Dette produktets generelle egenskaper er:

A'.) Farge: hvit

B<1>) Typisk elementæranalyse:

C, 47,05% 0,05

H, 6,48% ± 0, 02

N, 13,99% ±0,01

C) Typisk molvekt (Andrews metode, Biochem. J., 91, 222 (1964) og S.D.S.-polyakrylamidgelelektroforese, J. Biol. Chem., 244, 5074 (1969)

26 000 ± .1000

D1) UV-absorbsjonsspektrum: Som det fremgår av figur 7, maksimum

absorbsjon ved 275 til 280 my, ^280 my lem = 10,1.

E<1>) IR-spektrum (som det fremgår av figur 8 (KBr-skive):

absorbsjonstopper i mikron som følger:

3,0 (kraftig), 3,38 (middels), 6,05 (bred, kraftig),

6,55 (bred, kraftig), 6,88 (svak), 7,15 (bred, middels), 8,12 (middels) og 9,3 (bred, svak).

F') isoelektrisk punkt (elektrofokuseringsmetode):

pH 5,8 til 6,7.

G') Oppløselighet: Oppløselig i vann og vandige saltoppløs-ninger med ionestyrké 0,01 til 0,1, uoppløselig i alkoholer,

aceton og eter..

(iv) har ingen sacchariddel..

(v) har ingen lipidrest.

N<1>) Virkning av galle: Lipasevirkningen målt mot olivenolje (J.P.) økes opp til 150% sammenlignet med aktiviteten -

uten tilsetning, ved tilsetning av hundegalle fortynnet i forholdet 1/200.

De typiske eksperimenter utføres på samme måten som

tidligere beskrevet under "(L) virkning av galle".

Resultatene fremgår nedenfor:

Bemerk: Olivenolje (J.P.) brukes som substrat.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av lipase ved dyrking av en mikroorganisme i et kulturmedium, hvoretter den akkumu lerte lipase separeres fra kulturmediet, karakt er 1 sert ved at man som mikroorganisme anvender en stamme av artene Phycomyces nitens eller Phycomyces blakesleeanus.