PL91581B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej.Dotychczas przedmiotami publikacji byly róz¬ ne rodzaje lipaz, otrzymywanych na drodze mi¬ krobiologicznej. Na przyklad lipazy, otrzymane z Candida cylindracea i z Propionibacterium shermanii opisano w Agricultural and Biological Chemistry 30,576 (1966) i w Applied Microbiolo- gy 20, 16 (1970). Wiadomo jednak, ze lipazy te sa inaktywowane przez zólc.W trakcie badan nad mikroorganizmami, wy¬ twarzajacymi lipaze stwierdzono, ze mikroorga¬ nizmy, nalezace do rodzaju Phycomyces, wytwa¬ rzaja lipaze, której aktywnosc enzymatyczna wzra¬ sta w istotnym stopniu w obecnosci zólci. Lipaza ta moze byc zastosowana do wytwarzania kompozy¬ cji farmaceutycznej, zawierajacej oprócz omawia¬ nej lipazy, sproszkowana zólc i ewentualnie rów¬ niez inne czynniki, ulatwiajace trawienie oraz moze byc zastosowana do wytwarzania pozywie¬ nia tluszczowego, takiego jak maslo, którego a- romat jest poprawiany przez lipaze.Mikroorganizmy, które mozna zastosowac w sposobie wedlug wynalazku naleza do rodzaju Phycomyces i sa zdolne wytwarzac lipaze. Mikro¬ organizmy te mozna wyodrebnic ze zródel natu¬ ralnych lub otrzymac z pewnych typów hodowli.Jako typowe przyklady mikroorganizmów, któ¬ re moga znalezc zastosowanie w procesie wedlug wynalazku, mozna wymienic Phycomyces nitens IFO-5694, Phycomyces nitens IPO-5695, Phycomy¬ ces nitens NRRL-2444, Phycomyces nitens NRRL- -2678, Phycomyces blakesleeanus IFO-5822, Phyco¬ myces blakesleeanus IFO-5823, Phycomyces bla¬ kesleeanus rpO-5870 i Phycomyces blakesleeanus IFO-5871.Wszystkie powyzsze szczepy sa wariantami lub mutantami mikroorganizmu Phycomyces blakes¬ leeanus, którego synonimem jest nazwa Phycomy¬ ces nitens. Wszystkie z tych szczepów sa znane; szczepy oznaczone symbolem IFO sa dostepne w Institute for Fermentation w Osaka w Japonii, a oznaczone symbolem NRRL — Northern Utili- sation Research and Devalopment Division, U. S.Departament of Agriculture.Sposobem wedlug wynalazku hodowle mikro- oragnizmów mozna prowadzic zarówno na pod¬ lozu stalym, jak i cieklym, lecz dla celów prze¬ myslowych szczególnie korzystne jest podloze cie¬ kle. W tym przypadku hodowle mozna prowadzic w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mieszaniu.Podloze hodowli, stosowane w procesie wedlug wynalazku, zawiera zródla przyswajalnego wegla i azotu, sole nieorganiczne, czynniki wzrostowe i inne.Zródlem wegla moze byc kazde ze zródel kon¬ wencjonalnych, takie jak: glukoza, sacharoza, ma- 9158191581 nnoza, dekstryna, celuloza, skrobia, skrobia roz¬ puszczalnika, gliceryna, sorbit, otreby pszenne, otreby ryzowe i melasa.Zródlem azotu moze byc kazde ze zródel kon¬ wencjonalnych, naturalne lub inne pochodne, ta- 5 kie jak pepton, ekstrakt miesny, kazeina, plyn z namoczonego ziarna kukurydzy, odtluszczony proszek sojowy, maczka sojowa, ciasto sojowe, su¬ szone drozdze, ekstrakt drozdzowy, maka sojowa, maczka bawelniana, gluten, kwas Casamino, pro- io dukowany przez firme Difo labs., sole amonowe kwasów organicznych, takie jak szczawian amo¬ nu, winian amonu i octan amonu oraz nieorga¬ niczne ' zwiazki azotu, takie jak chlorek amonu, siarczan amonu, fosforan amonu i azotan sodu. 15 Z soli nieorganicznych mozna na przyklad sto¬ sowac rózne fosforany, siarczany i chlorowodorki.Czynnikami wzrostowymi moga byc na przy¬ klad witaminy, kwasy nukleinowe i ich pochodne.Wreszcie, zaleznie od zastosowania metody i warunków hodowli, dla poprawy zdolnosci gro¬ madzenia sie omawianego enzymu moze byc po¬ mocne dodanie do pozywki naturalnych lub syn¬ tetycznych srodków zapobiegajacych pienieniu, takich jak olej sojowy, olej silikonowy i inne.Przy prowadzeniu hodowli korzystnie jest przy¬ gotowac, w malej skali, hodowle wstepna i na¬ stepnie zaszczepic nia podloze fermentacyjne.Temperatura podloza, czas prowadzenia hodo- 30 wli, pH, intensywnosc napowietrzania, intensy¬ wnosc mieszania i inne warunki hodowli zmie¬ niaja sie nieco w zaleznosci od szczepu, skladu pozywki itp. i wszystkie te czynniki musza byc wziete pod uwage przy wyborze i utrzymywaniu 35 takich warunków, przy których gromadzenie sie lipazy bedzie maksymalne.Na przyklad, hodowle prowadzi sie w zakresie temperatury 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w ciagu 10—240 godzin, korzystnie 15—168 godzin, 40 przy pH 4—10, korzystnit 5,5—8, a zwlaszcza 6—8 przy napowietrzeniu 0,5—5 litrów na litr pozywki minute i szybkosci obrotów mieszadla 50—400 obrotów na minute.Przy prowadzeniu hodowli w podany wyzej 45 sposób, szczep, produkujacy lipaze, wytwarza ja i gromadzi w bulionie odzywczym.Jesli stosuje sie podloze ciekle, gromadzenie przewazajacej czesci omawianej lipazy nastepuje w fazie plynnej bulionu. W takim przypadku 50 jest korzystnie oddzielic komórki za pomoca pra¬ sy filtracyjnej lub wirówki i wydzielic lipaze z przesaczu lub z cieczy sklarowanej. Roztwór li¬ pazy w postaci przesaczu z hodowli lub jego ek¬ straktu mozna zatezac pod zmniejszonym cisnie- 55 niem.Do wydzielenia lipazy mozna zastosowac znane metody rozdzialu i oczyszczania, pozwalajace o- trzymac lipaze o zadanej czystosci. I tak, oma¬ wiany produkt mozna wyodrebnic przez poddanie 60 wspomnianego roztworu, zawierajacego lipaze, frakcjonowanemu straceniu przy uzyciu soli nie¬ organicznej, takiej jak siarczan amonu, siarczan sodu lub przez dodanie odpowiedniego hydrofi- lowego rozpuszczalnika oragnicznego, takiego jak 65 alkohol, na przyklad metanol, etanol lub izopro-' panol albo aceton.Wytracony produkt mozna w dalszym ciagu o- czyszczac w sposób konwencjonalny. Mozliwe jest równiez zastosowanie takich sposobów oczyszcza¬ nia, jak kolejne adsorpcja i desorpcja na zelu fo¬ sforanu wapnia, aluminie, bentonicie, zywicach jednowymiennyeh itp., chromatografia na dwue- tylo-aminoetylocelulozie, karboksymetylocelulozie i innych pochodnych celulozy, przesiewanie cza¬ steczek, na przyklad na zelu dekstranu, takim jak Sephadex firmy Pharmacia Fine Chemicals Co. lub Biogel firmy Bio-rad Laboratories, wytrace¬ nie za pomoca substancji stracajacych bialko, ta¬ kich jak kwas nukleinowy, tanina, wolframian fo¬ sforu i inne, wytracenie izoelektryczne, dializa, elektroforeza, usuwanie zanieczyszczen przy po¬ mocy soli metali ciezkich, na przyklad octanu o- lowiu, octanu cynku, octanu baru, octanu wapnia i innych. W ten sposób mozna otrzymac prepa¬ raty lipazy o zadanej czystosci w postaci roz¬ tworów, proszku lub krysztalów.Otrzymana w powyzszy sposób lipaza rózni sie od innych znanych lipaz tym, ze jej aktywnosc wzrasta, na przyklad do wartosci nie mniejszej od 150% aktywnosci poczatkowej, w obecnosci zólci psa, rozcienczonej do 1/200 w próbie z oliwa z oliwki o czystosci farmaceutycznej wedlug prze¬ pisów japonskich (skrót J.P), przy czasie reakcji enzymu 50 minut w temperaturze 37°C w bufo¬ rze fosforanowym 0,1 m o pH 7,0.Lipaza otrzymana w powyzszy sposób, moze byc stosowana na przyklad jako skladnik srod¬ ków, ulatwiajacych trawienie dla ludzi i zwie¬ rzat. Stosowana jest na przyklad w leczeniu nie¬ strawnosci, niestrawnosci funkcyjnej, ostrej nie¬ strawnosci pooperacyjnej i przewleklego zapale¬ nia trzustki. Kompozycje, moga zawierac mniej¬ sze lub wieksze ilosci lipazy obok innych srod¬ ków ulatwiajacych trawienie lub bez takich srod¬ ków. Srodek, ulatwiajacy trawienie, powinien byc dawkowany w sposób ustalony przy dawkowaniu znanych srodków, ulatwiajacych trawienie za¬ wierajacych lipaze.Do wyjasnienia zastosowania wynalazku sluza ponizsze receptury leków.Receptura 1. Tabletka Lipaza 30 mg (1650J) Skrobia kukurydziana 20 mg Laktoza 42,5 mg Uydroksypropyloceluloza 2 mg Sól wapniowa karboksymetylo- celulozy 5 mg Stearynian magnezu 0,5 mg Ftalan hydroksypropylometylo- celulozy 10 mg TlO mg Dawkowanie zazwyczaj wynosi trzy tabletki dziennie dla czlowieka doroslego, to znaczy jedna tabletke po kazdym posilkul Receptura 2. Tabletka Lipaza 20 mg (1100J) Sproszkowana zólc bydleca (Wako Pure Chemical Industries Ltd,91581 mg mg 42,5 mg 2 mg mg 0,5 mg mg 2 mg (110 J) mg mg Japonia) Skrobia kukurydziana Laktoza Hydroksypropylo celuloza Sól wapniowa karboksymetylo celulozy Stearynian magnezu Ftalan hydroksypropylometylo celulozy 110,0 mg Dawkowanie zazwyczaj wynosi trzy tabletki dziennie dla doroslego czlowieka, to znaczy jedna -tabletke dla kazdego posilku.Receptura 3. Granulki.Lipaza Proteaza kwasna, otrzymana na drodze mikrobiologicznej Amylaza, otrzymana na drodze mikrobiologicznej Celuloza, otrzymana na drodze mikrobiologicznej Pankreatyna Laktoza Celuloza mikrokrystaliczna Hydroksypropyloceluloza Ftalan hydroksypropylometylo celulozy 400 mg Dawkowanie zazwyczaj wynosi 1200 mg dzien¬ nie dla doroslego czlowieka, to znaczy 400 mg granulek po kazdym posilku.Receptura 4. Kapsulka Kapsulke sporzadza sie z 400 mg opisanych granulek. Dawkowanie wynosi zazwyczaj trzy kapsulki dziennie dla doroslego czlowieka, to zna¬ czy jedna kapsulke po kazdym posilku.Otrzymana w powyzszy sposób lipaza jest rów¬ niez stosowana jako dodatek, majacy na celu po¬ prawe aromatu mleczarskich tluszczowych srod¬ ków spozywczych, jak to przedstawiono w poniz¬ szym przykladzie.Margaryne o poprawionym aromacie mozna spo¬ rzadzic przez zmnieszanie 50—70 kg smietany o podanym nizej skladzie z 1000 kg margaryny, o- trzymanej w zwykly sposób. Smietane sporzadza sie, dodajac do 1 kg swiezego mleka, zawieraja¬ cego 36% tluszczu mlecznego, 7,2 g lipazy (50 J mg), otrzymywanej wedlug wynalazku i 40 g chlor¬ ku sodu. Mieszanine miesza sie starannie i od¬ stawia w temperaturze 38—43° Bezposrednio po 75 143 mg mg mg 50 mg mg mg 45 50 wytworzeniu w mieszaninie kwasu w ilosci, od¬ powiadajacej 1% kwasu mlekowego, ogrzewa sie ja w temperaturze 70°C w ciagu 10 minut i na¬ stepnie przechowuje w temperaturze 4—5°C.Dla dalszego wyjasnienia niniejszego wynalaz¬ ku ponizej przedstawiono przyklady, w których „czesc (czesci)" odniesionej do ciezaru, jesli nie zaznaczono inaczej, a zaleznosc miedzy „czescia (czesciami)" i „czescia objetosciowa (czesciami ob¬ jetosciowymi)" odpowiada zaleznosci miedzy „gra¬ mem (gramami),, i „mililitrem (mililitrami)".Nalezy podkreslic, ze miana lipazy podane w przykladach okreslono w nastepujacy sposób.Substrat sporzadza sie przez zmieszanie 2°/o- owego alkoholu poliwinylowego i oliwy z oliwek (J.P.) w stosunku objetosciowym 3 :1 i homogeni¬ zacje mieszaniny w mieszalniku w temperaturze 4°C w ciagu 10 minut. Nastepnie rurka w ksztal¬ cie litery L napelnia sie 5 ml tego substratu i 4 ml 0,1 m buforu fosforowego o pH 7,0, po czym dodaje sie 1 ml roztworu testowanej lipazy.Reakcje prowadzi sie w wytrzasarce typu Mo- nod w temperaturze 37°C w ciagu 50 minut. Przy koncu tego okresu reakcje przerywa sie przez dodanie 20 ml mieszaniny acetonu i etanolu w stosunku objetosciowym 1:1 i srodowisko reakcji natychmiast miareczkuje sie 0,05 n wodnym roz¬ tworem NaOH wobec l°/o fenoloftaleiny jako wskaznika. Jedna jednostka lipazy (U) jest defi¬ niowana jako ilosc, enzymu, wyzwalajaca w cia¬ gu minuty wolne kwasy tluszczowe, równowazne 1 mikromolowi kwasu olejowego, a aktywnosc wlasciwa lipazy jako (J mg).Przyklad. Zbiornik fermentacyjny o pojem¬ nosci 200 czesci objetosciowych napelnia sie 40 czesciami pozywki o pH=6,0, zawierajacej 2,0% otrab pszennych, 0,5% otrab ryzowych, 8,0% na- moku ziarna kukurydzy, 0,5%KH2PO4, 0,2% CaCV2H20 i 0,1% Actcolu, bedacego polimerem gliceryny i tlenku propylenu, produkowanego przez Takeda Chemical Industries, Ltd, w Japonii.Po sterylizacji, zawartosc zbiornika zaszczepia sie szczepami, wymienionymi ponizej i utrzymuje w temperaturze 24°C, mieszajac z szybkoscia 240 o- brotów na minute i napowietrzajac z szybkoscia 1,0 czesciami na minute na czesc podloza. War¬ stwe powierzchniowa bulionu odzywczego bada sie na aktywnosc lipazy. Wyniki sa podane po¬ nizej w tablicy I. Wszystkie przedstawione mi¬ kroorganizmy wytwarzaja i gromadza lipaze o wysokiej aktywnosci przy pH okolo 7.Tablica Produkcja i gromadzenie Lipazy (J/ml przy pH=7) Rodzaj i gatunek Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces blakesleeanus Phycomyces blakesleeanus Phycomyces blakesleeanus | Phycomyces blakesleeanus Szczep i nr IFO 5694 IFO 5695 NRRL 2444 NRRL 2678 IFO 5822 IFO 5823 IFO 5870 IFO 5871 Hodowane 48 godzin ,9 31,1 85,4 37,0 84,9 38,0 ,1 82,3 Hodowane 72 godziny 17,4 14,6 96,6 11,4 81,5 36,4 37,5 74,091581 Kazdy ze wskazanych nizej szczepów hoduje sie w ciagu 72 godzin w sposób, podobny do podanego powyzej i do warstwy powierzchniowej dodaje sie siarczan amonu do stezenia 50°/o. Wytracony produkt odsala sie przez dialize wobec wody de¬ stylowanej w temperaturze 4°C i poddaje sie pró¬ bom, majacym na celu ustalenie optymalnych dla 8 aktywnosci lipazy wartosci pH i temperatury, a takze ocenia sie jego zdolnosc do zwiekszenia aktywnosci wobec zólci, pochodzacej od psa. Re¬ zultaty sa zestawione w tabeli II. Wynika z nich, ze enzymy wytwarzane i akumulowane przez przedstawione organizmy sa identyczne.Rodzaj i gatunek Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces blakes- leeanus Phycomyces blakes- leeanus phycomyces blakes- leeanus Phycomyces blakes- leeansu Tablica II Szczep nr IFO 5964 IFO 5965 NRRL 2444 NRRL 2678 IFO 5822 IFO 5823 IFO 5870 IFO 5871 Opty¬ malne pH 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 Optymalna tempera¬ tura °C 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 Poprawa aktywnosci wobec zólci tak tak tak tak tak tak fak tak 20000 czesci objetosciowych podloza o pH=6,0, zawierajacego 2% dekstryny, 2°/o namoku ziar¬ na kukurydzy, 0,5% KH2P04, 0,5°/o MgS04-7H20 i 0,1% Actcolu zaszczepia sie 500 czesciami obje¬ tosciowymi podloza o tym samym skladzie z za¬ wiesina Phycomyces nitens NRRL 2444.W zbiorniku o pojemnosci 50000 czesci objeto¬ sciowych zaszczepione podloze utrzymuje sie w tem¬ peraturze 28°C w ciagu 24 godzin. 6000 czesci zaszczepionej hodowli dodaje sie w zbiorniku o po¬ jemnosci 200000 czesci objetosciowych, do 100000 czesci objetosciowych podloza o~pH=6,0, zawiera¬ jacego 1% otrab pszennych, 1% otrab ryzowych, % polipeptonu, 0,5% KH2P04, 0,2% CaCl2-2H20 i 0,1% Actcolu. Podloze utrzymuje sie nastepnie w nastepujacych warunkach: temperatura 24°C, intensywnosc napowietrzenia 2 litry na minute na litr, szybkosc mieszania 200 obrotów na minute, w ciagu 66 godzin. Wartosci pH podloza i ilosci wytworzonej lipazy, oznaczone w okreslonych od¬ stepach czasu, sa nastepujace: Czas inkubacji (godzin) 18 30 42 54 66 pH podloza 6,2 6,4 7,0 7,2 7,5 Ilosc wytworzonej lipazy (J/ml) 35 90 125 145 160 Bulion odzywczy z 66-gódzinnej hodowli w po¬ wyzszych warunkach chlodzi sie do temperatu¬ ry okolo 5°C i usuwa z niego komórki w prasie filtracyjnej, przy pomocy ziemi okrzemkowej Hy- flo Super-cel, dostarczonej przez firme Johns-Ma- nville Products Corp. w USA, przy czym otrzy¬ muje sie 80000 czesci objetosciowych przesaczu.Do tego przesaczu dodaje sie siarczan amonu do stezenia 50% i otrzymany wytracony produkt odwirowuje sie przy 9000 obrotach na minute w ciagu 10 minut. Ciecz po wirowaniu odsala sie przez dialize wobec zimnej- wody przy uzyciu 40 45 50 55 60 65 przegrody z rybiej skóry i dializat liofilizuje sie, otrzymujac 178 czesci surowego enzymu w po¬ staci proszku o barwie jasnoszarej. Aktywnosc lipazy z tej próby równa 55 J/mg.W 2000 czesci objetosciowych 10%-owego wod¬ nego roztworu siarczanu amonu rozpuszcza sie 178 czesciach sproszkowanego surowego enzymu, otrzymanego w sposób, opisany powyzej i roz¬ twór przeprowadza sie przez kolumne, wypelnio¬ na zywica styrenowa Asmit 173 NP, wytworzona przez firme Imacti Co. w Holandii. Pozostajacy w kolumnie enzym eluuje sie 6000 czesciami ob¬ jetosciowych 10%-owego siarczanu amonu, zle¬ wajac przesacz i eluat. Do polaczonych roztworów dodaje sie siarczan amonu do stezenia 50%, a otrzymany wytracony produkt poddaje sie diali¬ zie wobec 0,02n buforu octanowego o pH=5,0.Roztwór wewnetrzny przeprowadza sie przez kolumne, wypelniona dwuetyloaminoetyloceluloza, produkowana przez firme Serva Entwicklungsla- bor w RFN, przemyta uprzednio o 0,02n buforu octanowym o pH=5,0 i do przesaczu dodaje sie siarczan amonu do stezenia 60%. Frakcje, zawie¬ rajaca enzym, otrzymuje sie w postaci osadu, który poddaje sie dializie wobec 0,02n buforu o- ctanowego, zawierajacego 2'10"3 mola w litrze CaCl2, o pH=5,0. Dializat poddaje sie adsorpcji na zelu dekstranowym (karboksymetylo-Sephadex C — 50, wytwarzanym przez firme Pharmacia Co.,), przemytym tym samym buforem. Kolumne eluuje sie 0,15n roztworem NaCl w tym samym buforze, w wyniku czego otrzymuje sie 600 cze¬ sci objetosciowych frakcji, bogatej w lipaze. Elu¬ at odsala sie przez dialize wobec destylowanej wody przy uzyciu przegrody z celofanu w tem¬ peraturze 4°C i dializot liofilizuje sie, otrzymu¬ jac 0,7 czesci oczyszczonego enzymu. Aktywnosc wlasciwa tego produktu wynosi 2400 J/mg, a je¬ go wlasnosci sa nastepujace:91581 9 Barwa i postac: bialy proszek Typowa analiza elementarna: C — 46,12±0,26% H — 6,51±0,07% N — 13,8010,20% Typowy ciezar czasteczkowy, oznaczony metoda Andrewsa, opisana w Biochem. J. 91,222(1964): 25000+1000.Widmo adsorpcyjne w nadfiolecie: przedstawione na rys. 1, wykazuje maksimum absorpcji przy l0/ 275—280 mu o natezeniu E—i^2 i cm=7,7. ^ 280 nv* - Widmo absorpcyjne w podczerwieni; uzyskane metoda plytki z KBr, przedstawione na rys. 2, wykazuje istotniejsze pasma przy nastepujacych dlugosciach fal (w mikronach) :3,0 (mocne), 3,38 (srednie), 6,05 (szerokie, mocne), 6,55 (szerokie, mocne), 6,88 (slabe), 7,15 (szerokie, srednie), 8,12^ (srednie) i 9,3 (szerokie, slabe).Punkt izoelektryczny (wyznaczony metoda ele- ktro-optyczna):przy pH=6,3—7,0.Rozpuszczalnosc: rozpuszczalny w wodzie i wod¬ nych roztworach soli o sile jonowej 0,01—0,1; nierozpuszczalny w alkoholach, acetonie i estrze.Wplyw pH na aktywnosc: optymalna wartosc pH lezy w granicach 5—8, przy pomiarze w bu¬ forze fosforanowym w temperaturze 37°C w cia¬ gu 50 minut wobec oliwy i oliwek (J.P.) jako sub- stratu. Wplyw pH na aktywnosc, mierzona w spo¬ sób podany w „Definicji jednostki", jest przed¬ stawiony na rysunku 3.Wplyw temperatury na aktywnosc: optymalna temperatura wynosi 35—41°C przy pomiarze w 0,1 m buforze fosforowym przy pH=7,0 w cia¬ gu 50 minut wobec oliwy z oliwek (J.P.). Wplyw temperatury na aktywnosc, mierzona w sposób podany w „Definicji jednostki", jest przedstawio¬ ny na rys. 4.Wplyw pH na trwalosc: resztkowe aktywnosci lipazy, wyrazone w procentach, po 2 godzinach pozostawiania w temperaturze 23°C, przedstawione sa na rys. 5. Enzym jest trwaly w zakresie pH= 4—10.Wplyw temperatury na trwalosc: resztkowe a- ktywnosci lipazy, wyrazone w procentach, po 10 minutach ogrzewania w obecnosci 0,1 m buforu fosforanowego przy pH=7 dla róznych wartosci temperatury sa przedstawione na rys. 6. Enzym jest trwaly w temperaturze do 45°C i niemal cal¬ kowicie inaktywowany w 50°C.Wplyw zólci: w wyniku dodania zólci psa roz¬ cienczonej w stosunku 1/200, aktywnosc lipazy w stosunku do oliwy z oliwek (J.P.) wzrasta do nie mniej niz 150% w porównaniu z aktywnoscia sa¬ mej lipazy. Przebieg t typowego eksperymentu jest nastepujacy. Zólc, zebrana bezposrednio z peche¬ rzyka zólciowego psa mieszanca (samca) przy uzy¬ ciu strzykawki rozciencza sie do 1/50, 1/100 i 1/200 i roztwory te dodaje sie do podwielokrotnosci mieszanek lipazy — substrat dla porównania zmian w aktywnosci enzymu. Jak wskazuja ponizsze da¬ ne, akywnosc otrzymanej lipazy jest w sposób wy¬ razny poprawiona przez zólc. Odwrotnie, akty¬ wnosc lipazy kontrolnej, otrzymanej z Candida cylindracea wedlug Agr. Biol. Chem. 30, 1097 (1956) jest inhibitowana przez zólc.Tablica III Zólc psa roz¬ cienczona do: 1,50 1/100 1/200 1 bez dodatku Wzgledna aktywnosc enzymu, % Lipaza ptrzyma- na we¬ dlug wy¬ nalazku 133 200 202 100 Lipaza z Candida 33 56 60 1 100 i Jako substrat uzywana oliwa z oliwek (J.P.). 2,4 czesci enzymu, otrzymanego w sposób przed¬ stawiony powyzej, rozpuszcza sie w 24 czesciach objetosciowych wody destylowanej. Roztwór prze¬ puszcza sie przez kolumne, wypelniona sproszko¬ wana celuloza, otrzymana w firmie Toyo Roshi, Ltd. w Japonii, o rozdrobnieniu 200—300 mesh, przemyta 0,02 m buforem octanowym o pH=5,0, zawierajacym 2'10-3 mola w litrze CaCl2. Na¬ stepnie kolumne przemywa sie 0,02 m buforem octanowym o pH=5,0, zawierajacym 2'10~3 mola w litrze CaCl?, do uzyskania 200 czesci objeto¬ sciowych eluatu. Do tego eluatu dodaje sie siar¬ czan amonu do stezenia 50% wagowo —objeto¬ sciowych, w wyniku czego wytracaja sie osady, zbierane przez wirowanie w ciagu 10 minut przy 9000 obrotach na minute i nastepnie dializowane wobec przedstawionego wyzej buforu octanowego w ciagu 72 godzin. 77 czesci objetosciowych roz¬ tworu wewnetrznego z dializy przepuszcza sie przez kolumne, wypelniona dekstranem — karboksy- metylowym — Sephadex C—50, produkowanym przez Pharmacia Co. Ltd. przemytym buforem octanowym, w celu zaadsorbowania enzymu. Ko¬ lumne eluuje sie 0,1 m roztworem chlorku sodu, otrzymujac 23 czesci objetosciowych frakcji, za¬ wierajacej lipaze. Frakcje te pozostawia sie na noc w temperaturze 4°C, w wyniku czego otrzy¬ muje sie 0,185 czesci krysztalów enzymu. Akty¬ wnosc wlasciwa tego produktu wynosi 3750 J/ mg, a jego wlasnosci sa nastepujace: Barwa: biala Typowa analiza elementarna: C — 47,05±0,05% H — 6,48±0,02% N — 13,99±0,01% Typowy ciezar czasteczkowy, oznaczony meto¬ da Andrewsa, opisana w Biochem. J. 91, 222 (1964) i przez elektroforeze na zelu poliakryloamidowym S. D. S. wedlug J. Biol. Chem., 244, 5074 (1969) :26000±1000.Widmo absorpcyjne w nadfiolecie: przedstawio¬ ne na rys. 7 wykazuje maksimum absorpcji przy 1 °/ 275—280 mu o natezeniu E ^ lcm=10,l. ^ 280 m^ Widmo absorpcyjne w podczerwieni: uzyskane metoda plytki z KBr, przedstawione na rys. 8,' wykazuje istotniejsze pasma przy nastepujacych dlugosciach fal (w mikronach): 3,0 (mocne), 3,38 (srednie), 6,05 (szerokie, mocne), 8,12 (srednie) i 9,3 (szerokie, slabe).Punkt izoelektryczny (wyznaczony metoda ele- ktrooptyczna): przy pH=~5,8—6,7. 40 45 50 55 60V 11 Rozpuszczalnosc: rozpuszczalny w wodzie i wodnych roztworach soli o sile jonowej 0,01—0,1; nierozpuszczalny w alkoholach, acetonie i eterze.Wplyw na pH aktywnosc: optymalna wartosc pH lezy w granicach 5—8, przy pomiarze w tem¬ peraturze 37°C w stosunku do oliwy z oliwek ja¬ ko substratu. Wplyw pH na aktywnosc, mierzona w sposób podany w ,Definicji jednostek", jest przedstawiony na rys. 9.Wplyw temperatury na aktywnosc: optymalna temperatura wynosi 35^41 °C przy pomiarze w 0,1 m buforze fosforanowym przy pH=7,0, przy dzia¬ laniu na oliwe z oliwek (J.P.) w ciagu 50 minut.Wplyw temperatury na aktywnosc, mierzona w sposób podany w „Definicji jednostek", jest przed¬ stawiony na rys. 10.Wplyw pH na trwalosc: resztkowe aktywnosci lipazy, wyrazone w procentach, po 2 godzinach pozostawania w temperaturze 23°C przy róznych wartosciach pH sa przedstawione na rys. 11. En¬ zym jest trwaly w zakresie pH=4—10.Wplyw temperatury na trwalosc: resztkowe a- ktywnosci lipazy, znajdujacej sie w roztworze en¬ zymu przy pH=7, poddane dzialaniu tempera¬ tur sa przedstawione na rys. 12. Enzym jest trwa¬ ly w temperaturze do 40°C, lecz jest inaktywo- wany do 30°/o w temperaturze 45°C i niemal calkowicie inaktywowany w temperaturze 50°C.Wplyw inhibitora: aktywnosc lipazy w roz¬ tworze 0,05% wagowo-objetosciowych lipazy w *10_4 M roztworach fluorofosforanu dwuizopro- pylowego (DFF), kwasu etyleno-dwuaminocztero- octowego (EDTA) i p-chlororteciobenzoesanu (PC MB) mierzy sie, utrzymujac próbke przy pH= lub 8 w temperaturze 4°C w ciagu godziny.Wyniki sa nastepujace: Tablica IV Odczynniki Brak DFP EDTA | PCMB Aktywnosc resztko¬ wa, % pH=5 100 100 100 95 pH=8 100 100 94 95 1 Jak wynika z porównania, lipaza jest trwala wobec wymienionych czynników, nie jest wiec tak zwanym metaloenzymem, SH-enzymem, ani seryno-enzymem.Wyniki analizy na obecnosc aminokwasów: brak reszt cysteiny, obecnosc dwóch wiazan S— Zólc psa rozcienczo¬ na do: 1,50 1/100 1/200 | bez dodatku Wzgledna aktywnosc lipazy, % Lipaza otrzymywana wedlug wynalazku 135 202 205 100 Lipaza z Candida 34 55 60 100 | LS81 12 S, obecnosc dwóch reszt tryptofanowych, brak sacharydów, brak lipidów.Wplyw zólci: w wyniku dodania zólci psa, roz¬ cienczonej w stosunku 1/200, akywnosc lipazy w stosunku do oliwy z oliwek (J.P.) wzrasta do I nie mniej niz 150% w porównaniu z aktywnoscia samej lipazy. Typowe eksperymenty prowadzi sie w ten sam sposób, jak opisano poprzednio. Wy¬ niki sa nastepujace: Jako substrat jest uzyta oliwa z oliwek (J.P.) Te sama oczyszczona lipaze mozna równiez o- trzymac z hodowli bulionowej mikroorganizmów z rodzaju Phycomyces innych, niz Phycomycens ni¬ tens NRRL 2444. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze mikroorga- 20 nizm Phycomyces nitens IFO-5694 hoduje sie w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mie¬ szaniu na pozywce stalej lub cieklej, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu, soli nieorga¬ nicznych czynników wzrostowych w temperaturze 25 15—45°C, korzystnie 20^l0°C, w ciagu 10—240 godzin, korzystnie 15—168, przy pH=4—10, ko¬ rzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5—5 1/(1) minute, a nastepnie wytworzona i zgromadzona w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie znanymi 30 metodami przez filtrowanie, wirowanie lub frak¬ cjonowane stracania i ewentualnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem.
2. 2. Sposób wytwarzania nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze mikroorga- 35 nizm Phycomyces nitens IFO-5695 hoduje sie w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mie¬ szaniu na pozywce stalej lub cieklej, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu, soli nieorga¬ nicznych czynników wzrostowych w temperatu- 40 rze 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w ciagu 10—240 godzin, korzystnie 15—168 przy pH=4—10, ko¬ rzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5—5 1/ (1) minute, a nastepnie wytworzona i zgromadzona w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie zna- 45 nymi metodami przez filtrowanie, wirowanie lub frakcjonowane stracanie i ewentualnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem. 3. Sposób wytwarzania nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze mikroorga- 50 nizm Phycomyces nitens NRRL 2444 hoduje sie w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mie¬ szaniu na pozywce stalej lub cieklej, zawieraja¬ cej przyswajalne zródla wegla, azotu, soli nie¬ organicznych czynników wzrostowych w tempera- 55 turze 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w ciagu 10— 240 godzin, korzystnie 15—168, przy pH=4—10, korzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5—5 1/(1) minute, a nastepnie wytworzona i zgromadzona w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie znany- 60 mi metodami przez filtrowanie, wirowanie lub frakcjonowane stracanie i ewentualnie zateza pod zmniejszony cisnieniem. 4. Sposób wytwarzania nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym ,ze mikroorga- 65 nizm Phycomyces nitens NRRL 2678 hoduje sie91 581 13 w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mieszaniu na pozywce stalej lub cieklej, zawie¬ rajacej przyswajalne zródla wegla, azotu, soli nie¬ organicznych czynników wzrostowych w tempera- rze 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w ciagu 10— 5 240 godzin, korzystnie 15—168, przy pH=4—10, korzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5—5 1/ (1) minute, a nastepnie wytworzona i zgromadzo¬ na w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie zna¬ nymi ; metodami przez filtrowanie, wirowanie i 10 frakcjonowane stracanie i ewentualnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem. 5. Sposób wytwarzania nowej lipazy na dro¬ dze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze mikro¬ organizm Phycomyces blakesleeanus IFO-5822 15 hoduje sie w warunkach aerobowych przy wstrzasa¬ niu lub mieszaniu na pozywce stalej lub cieklej, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu, soli nieorganicznych czynników wzrostowych w temperaturze 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w 20 ciagu 10—240 godzin, korzystnie 15—168, przy pH= 4—10, korzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5— 5 1/(1) minute, a nastepnie wytworzona i zgroma¬ dzona w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie znanymi metodami przez filtrowanie, wirowanie i 25 frakcjonowane stracanie i ewentualnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem. 6. Sposób wytwarzania nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze mikroorga¬ nizmy Phycomyces blakesleeanus IFO-5823 hodu¬ je sie w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mieszaniu na pozywce stalej lub cieklej, za¬ wierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu so¬ li nieorganiczych czynników wzrostowych w tem¬ peraturze 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w cia¬ gu 10—240 godzin, korzystnie 15—168, przy pH= Err a W tablicy II w rubryce 2 jest: IFO 5964 IFO 5965 powinno byc: IFO 5694 IFO 5695 14 4—10, korzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5— 5 1/(1) minute, a nastepnie wytworzona i zgro¬ madzona w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie znanymi metodami przez filtrowanie, wirowa¬ nie i frakcjonowane stracanie i ewentualnie za¬ teza pod zmniejszonym cisnieniem. 7. Sposób wytwarzania nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze mikroorga¬ nizm Phycomyces blakesleeanus IFO-5870 hoduje sie w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mieszaniu na pozywce stalej lub cieklej, za¬ wierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu so¬ li nieorganicznych czynników wzrostowych w tem¬ peraturze 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w cia¬ gu 10—240 godzin, korzystnie 15—168, przy pH= 4—10, korzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5— 5 1/ (1) minute, a nastepnie wytworzona i zgro¬ madzona w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie znanymi metodami przez filtrowanie, wirowa¬ nie i frakcjonowane stracanie i ewentualnie za¬ teza pod zmniejszonym cisnieniem. 8. Sposób wytwarzania nowej lipazy na drodze mikrobiologicznej, znamienny tym, ze mikroorga¬ nizm Phycomyces blakesleeanus IFO-5871 hodu¬ je sie w warunkach aerobowych przy wstrzasaniu lub mieszaniu na pozywce stalej lub cieklej zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu, so¬ li nieorganicznych czynników wzrostowych w tem¬ peraturze 15—45°C, korzystnie 20—40°C, w ciagu 10—240 godzin, korzystnie 15—168, przy pH= 4—10, korzystnie 5,5—8, przy napowietrzaniu 0,5— 5 1/(1) minute, a nastepnie wytworzona i zgro¬ madzona w bulionie odzywczym lipaze wydziela sie znanymi metodami przez filtrowanie, wiro¬ wanie i frakcjonowane stracanie L ewentualnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem. ta wiersz 1 i 291581 FIG.
3. 3 FIG. 5 JO 80 60 40 20 ;'A //M U \\ / \\ / \ 100 80 W 40 20 4 6 8 10 2 4 6 8 10 12 F/G.
4. 4 F/0.6 10 20 JO 40 50 60 10 20 30 40 50 60 FIG. 7 1,2 1.0 0$ 0,6 0,4 0,2 240 250 260 270 280 290 50C)91581 ns.f 1,0 - 0,9 • C8 • 0,7- 0,6 ¦ 0,5- 0,4 0.3 a 2 0,1 240 250 260 270 280 290 300 310 J?0 F/G. 2 ?5 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 1415 103 30 9G 70 60 50 40- 50- 20 10 0 . 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 . 1000 900 65091581 FIG. 8 *) 11 12 13 14 15 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650 F/a 9 Fi6.11 e \o 12 3 10 IZ W.J0 F/(?./2. 10 20 30 .40 "50 60 10 70 30 40 50 LZG Zakl. Nr 3 w Pab. izam. 500-77 nakl. 105+20 egz. Cena 10 zl PL