DE2346335A1

DE2346335A1 - Auf mikrobiellem weg hergestellte lipase, sowie verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2346335A1
Application number: DE19732346335
Authority: DE
Inventors: Masahira Nakamura; Katsumi Tomoda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-09-20
Filing date: 1973-09-14
Publication date: 1974-03-28
Also published as: AU6040573A; NO139353B; CA996045A; FR2199974A1; DK135384C; DK135384B; ES418898A1; AT322489B; JPS4948887A; PL91581B1; NL7312936A; FI51951C; IT1014023B; JPS5017559B2; FR2199974B1; NO139353C; SE396963B; FI51951B; CH585792A5; BE804921A

Description

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27 s Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

Auf_mikrobiellem_Weg_hergestellte_Lipase_sowie Verfahren

.zu deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, auf mikrobiellem Weg hergestellte Lipase, deren Enzymaktivität in Gegenwart von Gallenflüssigkeit bemerkenswert erhöht wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Lipase.

Es.wurde bereits über verschiedene, auf mikrobiellem Weg hergestellte Lipasen berichtet. So sind z.B. Lipasen, die mit Hilfe von Candida cylindracea und Propionibacterium shermanii erhalten wurden, in "Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 30, Nr. 6, Seiten 576-584 (1966)" und "Applied Microbiology, Vol. 20, Nr. 1, Seiten 16-22 (197O)^M beschrieben. Yon diesen Lipasen ist jedoch bekannt, daß sie durch Gallenflüssigkeit inaktiviert werden.

Es wurde nun gefunden, daß Mikroorganismen, welche zur Gattung Phycomyces gehören, Lipase produzieren, deren Enzyraaktivität in Gegenwart von GallenflüäSigkeit erheblich erhöht wird.

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Gegenstand der Erfindung ist demnach, die Bereitstellung einer neuen, auf mikrobiellem Weg gewonnenen Lipase, deren Enzymaktivität in Gegenwart von Gallenflüssigkeit erhöht wird. Weiters ist die Bereitstellung eines industriell verwertbaren Verfahrens zur Herstellung der genannten Lipase vorgesehen. Ein weiterer Gegenstand betrifft die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, welche die genannte Lipase enthält, ferner einer Zubereitung, die Lipase und ein aus Galle gewonnenes Pulver enthält, welche gegebenenfalls andere verdauungsförderne Mittel enthalten kann. Weiterhin ist die Bereitstellung eines ölhaltigen Nahrungsmittels, wie z.B. Butter, vorgesehen, dessen Geschmack durch die Lipase verbessert wurde.

Mikroorganismen, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, gehören zur Gattung Phycomyces und sind fähig, Lipase zu produzieren. Die genannten Mikroorganismen können aus natürlichen Quellen stammen, aber ebenso bestimmten KuItürSammlungen entnommen werden. Es können auch alle Mutanten verwendet werden, welche durch eine spontane oder eine künstliche Mutantenbildung aus Lipase produzierenden Mikroorganismen erhalten werden, wenn sie nur die vorerwähnten Eigenschaften besitzen.

Typische, im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Mikroorganismen sind Phycomyces nitens IFO-569^, Phycomyces nitens IFO-5695, Phycomyces nitens NRRL-2hkk, Phycomyces nitens NRRL-2678, Phycomyces blakesleeanus IFO-5822, Phycomyces blakesleeanus IFO-5823, Phycomyces blakesleeanus IFO-5870, Phycomyces blakesleeanus IFO-5871. Alle diese Stämme sind bekannt. Diejenigen, die IFO-Bezeichnungen aufweisen, sind beim Institut for Fermentation, Osaka, Japan, und die mit NRRL-Bezeichnungen beim Northern Utilization Research and Development Division, US-Department of Agriculture erhältlich.

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Die Kultivierung des Mikroorganismus kann entweder auf einem festen oder in einem flüssigen Medium erfolgen. Für industrielle Verfahren wird die Anwendung eines flüssigen Mediums empfohlen. Bei Anwendung eines flüssigen Mediums kann die Kultivierung unter aeroben Bedingungen unter Schütteln oder Rühren vorgenommen werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Kulturbrühe enthält eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdauliche Stickstoffquelle, anorganische Salze, Wachstumsfaktoren usw.

Als Kohlenstoffquellen kann jede herkömmliche verwendet werden, wie z.B. Glucose, Sucrose, Mannose, Dextrin, Cellulose, Stärke, lösliche Stärke, Glyzerin, Sorbit, Weizenkleie, Reiskleie oder Restmolasse.

Als Stickstoffquelle kann jede bisher bekannte verwendet werden. Sie kann aus Naturprodukten stammen oder von daraus gewonnenen Materialien, wie z.B. Pepton, Malzextrakt, Casein, Maisquell^iwasser, entfettetes Sojabohnen-Pulver, Sojabohnenschrott, Sojabohnenkuchen, Trockenhefe, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Baumwollsamen, Gluten, Casaminosäure (vertrieben durch Difco Labs), Ammoniumsalze organischer Säuren (z.B. Ammoniumsuccinat, Ammoniumtatrat, Ammoniumacetat), anorganische Stickstoffverbindungen (wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat).

Als anorganische Salze können z.B. verschiedene Phosphate, Sulfate oder Hydrochloride verwendet werden.

Wachstumsfaktoren können z.B. Vitamine, Nucleinsäuren und verwandte Verbindungen sein.

Weiters kann es in Abhängigkeit von der Art der Kultur und den Kulturbedingungen nützlich sein, natürliche oder syn-

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thetische Antischaummittel, wie z.B. Sojabohnenöl, Siliconöl, usw. , in das Kulturmedium einzubringen, um die Anreicherung des Enzyms zu erleichtern.

Bei der Züchtung ist es vorteilhaft, im kleinen Maßstab eine Vorkultur herzustellen und diese dann dem Fermentationsmedium zuzusetzen.

Die Temperatur des Kulturmediums, die Züchtungsdauer, der pH-Wert des Mediums, die Belüftungsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit und andere Bedingungen variieren mit dem verwendeten Stamm, der Zusammensetzung des Mediums usw.

Es ist notwendig, die Bedingungen so zu wählen und einzuhalten, daß die Anreicherung der in Betracht gezogenen Lipase maximal ist.

Z.B. kann die Züchtung bei einer Temperatur von 15-^5 C, vorzugsweise 20 bis 40°C, 10 bis 24θ Stunden lang, vorzugsweise 15 his i68 Stunden lang, bei einem pH-Wert von 4-10, vorzugsweise 5»5-8» insbesondere 6-8, bei einer Belüftung von 0,5-5 l/min/l-Medium, vorzugsweise 0,5-3 l/min/!-Medium, und einer Rührgeschwindigkeit von 50 bis 400 UpM vorgenommen werden.

Wenn die Züchtung auf diese Weise vorgenommen wird, produziert der Lipase liefernde Stamm Lipase und reichert diese in der Kulturbrühe an. Bei Verwendung eines flüssigen Mediums reichert sich die Lipase größtenteils in der flüssigen Phase der Kulturbrühe an. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Zellen mittels einer Filterpresse oder einer Zentrifuge zu entfernen und die Lipase aus dem erhaltenen Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit zu gewinnen.

Die in Form der filtrierten Kultur oder im Extrakt vorliegende Lipaselösung kann unter vermindertem Druck konzentriert werden.

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Bei der Gewinnung der Lipase können die herkömmlichen Abtrennungs- bzw. Reinigungsverfahren verwendet werden, wobei eine Lipase der gewünschten Reinheit erhalten wird. So kann z.B. das gewünschte Produkt durch fraktionierte Fällung der die genannte Lipase enthaltenden Lösung mit einem anorganischen Salz, wie z.B. Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Natriumchlorid, erhalten werden. Gegebenenfalls kann ein geeignetes hydrophiles organisches Lösungsmittel, wie ein Alkohol (z.B. Methanol, Äthanol oder Isopropanol) oder Aceton der gleichen Lösung zugesetzt werden. Die Niederschläge können .auf herkömmliche Weise gereinigt werden. Geeignete Reinigunsverfahren sind z.B. Adsorption-Desorption an Calzium-Phosphat-Gel, Aluminiumoxid, Bentonit, Xonenaustauscherharz usw. Die Reinigungkann auch mittels Chromatographie an Dxäthylaminoäthylcellulose, Carboxymethylcellulose oder anderen Cellulosederivaten erfolgen, ferner mittels Molekularsieben (z.B. Dextran-Gel, wie Sephadex der Firma Fine Chemicals Co.Ltd. oder Biogel der Biorad Laboratories, od.dgl.), Fällung mit einem Proteinfällungsmittel, wie Nucleinsäure, Tannin, Phosphorwolframat usw., isoelektrische Fällung, Dialyse, Elektrodialyse, Elektrophorese, ferner Entfernung der Verunreinigungen mit einem Schwermetallsalz, z.B. Bleiacetat, Zinkacetat, Bariumacetat, Calziumacetat usw. Auf diese Weise können Lipasezubereitungen in optimaler Reinheit als Lösungen, Pulver oder Kristalle erhalten werden.

Die so erhaltene Lipase unterscheidet sich von anderen bekannten Lipasen im Hinblick auf die bemerkenswerte Steigerung ihrer Aktivität in Gegenwart von Gallenflüssigkeit. Z.B. steigt ihre Aktivität um nicht weniger als 15O $ ihrer ursprünglichen Aktivität in Gegenwart einer auf 1/200 verdünnten Hundegalle, wenn man die Messung bei 37°C in einem 0,1M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0 gegen Olivenöl (gemäß japanischem Pharmacopoe, abgekürzt mit J.P) als Substrat nach 50 Minuten Enzymreaktion vornimmt.

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Die so erhaltene Lipa.se ist z.B. als Zusatz für Verdauungsmittel für Menschen oder Tiere verwendbar. Sie kann zur Behandlung von Dyspepsien, funktioneilen Dyspepsien, akuten postoperativen Dyspepsien und chronischen Pankreatitis angewendet werden.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können entweder größere oder kleinere Mengen an Lipase, gegebenenfalls zusammen mit anderen digestiven Mitteln enthalten. Das digestive Mittel kann auf die gleiche Weise wie herkömmliche Digestivmittel verordnet werden. Die übliche Tagesdosis an Lipase liegt im Bereich von 20 bis 6OOO Einheiten für den Erwachsenen.

Die folgenden Herstellungsbeispiele für medizinische Präparate sollen die Verwendung des erfindungsgemäß erhältlichen Stoffes näher erläutern:

1.) Tabletten	30 mg (165O U)
Lipase	20 mg
Kornstärke	k2,5 mg
Lactose	2 mg
Hydroxypropylcellulose	5 mg
Calziumcarboxyme thylcellulo se	0,5 mg
Magneslumstearat	10 mg
Hydroxypropylmethylcellulose-phthalat

110,0 mg

Die übliche Tagesdosis betagt für den Erwachsenen 3 Tabletten, d.h. je eine Tablette nach dem Essen.

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20	mg
kz	,5 mg
2	mg
5	mg
0	»5 mg
10	mg

2.) Tabletten

Lipase 20 mg (1100 U)

Pulver aus Rindergalle 10 mg

(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Japan)

Kornstärke Lactose Hydroxypropylcellulose

CalziuBicarboxyme thylcellulo se

Magnesiumstearat

Hydroxypropylmethylcellulose-phtalat 10 mg

110,0 mg

Die übliche Tagesdosis beträgt für den Erwachsenen 3 Tabletten, d.h. je eine Tablette nach dem Essen.

3.) Granulate Lipase Mikrobielle Säureprotease Mikrobielle Amylase Mikrobielle Cellulase Pankreatin Lactose

Mikrokristalline Cellulose Hydroxypropylcellulose
Hydroxypropylmethylcellulose-phthalat30

400 mg

Die übliche Tagesdosis beträgt 1200 mg für den Erwachsenen, d.h. je 400 mg nach dem Essen.

k.) Kapseln

Eine Kapsel wird aus 400 mg des genannten Granulats hergestellt, die übliche Tagesdosis für den Erwachsenen beträgt Kapseln, d.h. je eine Kapsel nach dem Essen.

2	mg (110 U)
25	mg
35	mg
20	mg
75	mg
1^3	mg
50	mg
20 t30	mg

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Die erfindunggemäß hergestellte Lipase ist ebenso zur Verbesserung des Geschmacks von öligen Molkereiprodukten geeignet, wie im folgenden Beispiel ausgeführt wird.

Verbesserung des Geschmacks von Margarine: Geschmacksverbesserte Margarine kann hergestellt werden durch Mischen von 50 bis 70 kg der folgenden Crememasse mit 1000 kg Margarine, welche nach bekannten Verfahren hergestellt wurde.

Crememasse: Zu 1 kg Frischmilchcreme (Milchfett 36$) werden 7,2 g Lipase (50 E/mg) gemäß der vorliegenden Erfindung und kO g Natriumchlorid hinzugefügt. Das Gemisch wird gut gerührt und. bei 38 bis 43 C stehen gelassen. Nachdem sich eine Säure, die 1$ Milchsäure entspricht, in der Mischung gebildet hat, wird diese auf 70⁰C 10 Minuten lang erhitzt und dann weiter bei 4 bis 5°C gehalten.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung sollen die folgenden Beispiele dienen, worin Teil(e), wenn nichts anderes angegegen ist, für Gew.-Teil(e) steht bzw. stehen und die Beziehung zwischen Teil(e) und Vol.Teil(e) die gleiche ist, wie zwischen "g" und "ml". "Millimicron" wird durch "mu" und "Micron" durch "u" abgekürzt.

Definition der Einheit:

Der in den folgenden Beispielen für Lipase angegebene Titer wurde folgendermaßen bestimmt: Ein Substrat wird hergestellt, indem man 2$ Polyvinylalkohol und Olivenöl (j.P.) im Verhältnis 3 : 1 (Vol/Vol) mischt und das Gemisch bei 4°C 10 Minuten lang homogenisiert. Dann wird ein L-förmiges Rohr mit 5 ml des oben erwähnten Substrates, 4 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH ■ 7) gefüllt, worauf 1 ml der zu untersuchenden Lipaselösung zugefügt wird. Die Reaktion, läßt man in einem Monod-Schüttler bei 37°C während 50 Minuten vor sich gehen. Nach dieser Zeit wird die Reaktion durch Zugabe

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von 20 ml eines Gemisches aus Aceton und Äthanol (1 : 1 Vol/Vol) abgeschlossen und unmittelbar darauf wird mit einer 0,05 N wässerigen NaOH-Lösung gegen 1%iges Phenolphthalein als Indikator titriert. Eine Lipaseeinheit (1 E) wird definiert als jene Enzymmenge, die pro Minute eine solche Menge an freier Fettsäure produziert, welche 1 Mikromol Ölsäure äquivalent ist. Die spezifische Aktivität der Lipase wird in Einheiten pro mg (E/mg) ausgedrückt.

Beispiel:

In einen Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 200 Vol.-Teilen wurden 40 Vol.-Teile eines flüssigen Mediums (pH-Wert = 6,0), enthaltend 2,0% Weizenkleie, 0,5$ Reiskleie, 8,0% Maisquellwasser, 0,5% KHgPO^, 0,2% CaCIp.2H-0 und 0,1% Actcol (Polymeres aus Glycerin und Propylenoxid, hergestellt von der Firma Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan), eingebracht. Nach dem Sterilisieren wurde der Inhalt des Tanks mit einem der unten angeführten Stämme beimpft und bei 24°C bei einer Rührgeschwindigkeit von 240 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1,0 Teil/min/1,0 Teü/Medium kultiviert. Die über der Kulturbrühe befindliche Flüssigkeit wujde auf ihre Lipaseaktivität untersucht. Die Resultate sind unten angeführt. Es wurde gefunden, daß alle die folgenden Mikroorganismen Lipase entwickeln und ansammeln, die bei einem pH-Wert von etwa 7 eine hohe Aktivität aufweist.

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Produktion und Ansammlung von Lipase (E/ml bei pH 7)

Gattung und Art	Stamm Nr.	5694	kultiviert während 48 Stunden	kultiviert während 72 Stunden
Phycomyces nitens	IFO	5695	35,9	17,4
Phycomyces nitens	IFO	2444	31,1	14,6
Phycomyces nitens	NRRL	2678	85,4	96,6
Phycomyces nitens	NRRL	5822	37,0	11,4
Phycomyces brakesleeanus	IFO	5823	84,9	81,5
Phycomyces brakesleeanus	IFO	5870	38,0	36,4
Phycomyces brakesleeanus	IFO	5871	30,1	37,5
Phycomyces brake sleeanus	IFO	82,3	74.O

Jeder der unten angeführten Stämme wurde 72 Stunden lang auf ähnliche Art wie oben beschrieben kultiviert. Ammoniurasulfat wurde der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Konzentration von 50$ zugesetzt. Der Niederschlag wurde mittels Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 4°C entsalzt und die Lösung wurde auf den optimalen pH-Wert und die optimale Temperatur hinsichtlich der Lipaseaktivität untersucht und ebenso auf ihre Empfindlichkeit hinsichtlich der Aktivitätssteigerung in Gegenwart von Hundegalle geprüft. Die Resultate sind unten angeführt. Man kann sehen, daß die durch die Organismen produzierten und angereicherten Enzyme identisch sind.

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optimale Aktivitätssteigerung ■ opti-

Gattung und Art	Stamm	Nr.	maler pH-Wert	Temperatur ro	durch Galle
Phycomyces nitens	IFO	5694	6-7	37-40	ja
Phycomyces nitens	IFO	5695	6-7	37-40	ja -
Phycomyces nitens	NRRL	2444	6-7	37-40	ja
Phycomyces nitens	NRRL	2678	6-7	37-40	ja
Phycorayees blake sleeanus	IFO	5822	6-7	37-40	ja
Phycomyces blakesleeanus	IFO	5823	6-7	37-40	ja
Phycomyces blakesleeanus	IFO	5870	6-7	37-40	ja
Phycomyces blake s1e eanus	IFO	5871	6-7	37-40	.1a

Ein Medium (pH-Wert = 6,0. 20.000 Vol.-Teile), enthaltend 2% Dextrin, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,5$ KH₂PO^, 0,05% MgSO. .7H 0 und 0,1% Actcol, wurde mit 500 Vol.-Teilen eines Mediums der gleichen Zusammensetzung, in welches Phycomyces nitens NRRL 2444 suspendiert wurde, beimpft.

In einem Tank mit 50.000 Vol.-Teilen Fassungsvermögen wurde das beimpfte Medium bei 28°C während 24 Stunden kultiviert. Ein Anteil von 6OOO VoI.-Teilen der oben angeführten Saatkultur wurde zu 100.000 Vol.-Teilen eines Mediums (ph-Wert = 6,0), enthaltend 1% Weizenkleie, 1% Reiskleie, 5% PoIypepton, 0,5% KHgPO^, 0,2% CaCl₂.2HgO und 0,1% Actcol, welches in einem Tank mit einem Fassungsvermögen von 200.000 Vol.Teilen enthalten ist, eingebracht. Das Medium wurde dann unter folgenden Bedingungen beimpft:

Inkubationstemperatur: 24°C, Belüftungsmenge: 2 l/min/t, Rührgeschwindigkeit: 200 TTpm, Zeit: 66 Stunden.

Die pH-Werte des Mediums und die Produktion an Lipase, die nach bestimmten Zeitintervallen während der Züchtung ermittelt wurden, sind nachstehend angeführt.

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Inkubationszeit in Stunden 18 30 42 54 66 pH-Wert des Medituns 6,2 6,4 7,0 7,2 7,5

Produktion an Lipase (E/ml) 35 90 125 145 16O

Die Kulturbrühe einer 66 Stunden-Züchtung nach dem obigen Verfahren wurde auf etwa 5°C abgekühlt. Die Zellen werden mittels einer Filterpresse mit Hilfe von Diatomeenerde (Hyflo Sup^er-cel der Johns-Manville Products Corp., USA) als Filterhilfsmittel entfernt, wobei etwa 80.000 Vol.-Teile

Filtrat erhalten werden. Diesem Filtrat wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 50$ zugesetzt und der erhaltene Niederschlag wurde 10 Minuten lang bei 9000 Upm zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wurde mittels Dialyse gegen kaltes Wasser entsalzt, wobei als Membran Fischhaut verwendet wurde. Das Dialysat wurde liophylisiert. Man erhielt 178 Teile Rohenzympulver, welches eine grauweiße Farbe aufwies. Die LipaseaktivitMt der Probe betrug 55 E/mg.

In 2000 Vol.-Teilen einer 1Obigen wässerigen Lösung von Ammoniumsulfat wurden I78 Teile des wie oben beschriebenen erhaltenen Rohenzympulvers gelöst und die Lösung wurdedurch eine Säule von Asmit 173 NP (Harz vom Styroltyp der Imacti Co., Niederlande) geschickt. Das in der Säule zurückgehaltene Enzym wurde mit 6OOO Vol.-Teilen einer 10bigen wässerigen Lösung von Ammoniumsulfat eluiert und das Eluat und der Effluent wurden vereinigt. Den vereinigten Lösungen wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 50$ zugesetzt und der erhaltene Niederschlag wurde gegen einen 0,02M Acetatpuffer <pH-Wert = 5,0) dialysiert. Die Flüssigkeit wurde auf eine Kolonne, die mit Diäthylaminoäthyl-Cellulose (Serva Entwicklungslabor, Deutschland, eingestellt mit einem 0,02M Acetatpuffer, pH = 5,0) gefüllt worden war, aufgegeben. Ammoniumsulfat wurde in einer Konzentration von 60$ dem Effluenten zugesetzt. Die Enzymfraktion wurde als Niederschlag erhalten, der gegen einen

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O,O2 M Acetatpuffer, welcher 2,10"³M CaCl₂ (pH-Wert = 5,0) enthielt, dialysiert. Das Dialysat wurde an einer mit Dextrangel (Carboxymethyl-Sephadex C-50 der Pharmacia Co.) eingestellt mit dem gleichen Puffer - gefüllten Kolonne adsorbiert. Die Kolonne wurde mit einer 0,15 M Lösung von NaCl im gleichen Puffer eluiert, wobei 6OO Teile einer lipasereichen Fraktion erhalten wurden. Das Eluat wurde mittels Dialyse gegen destilliertes Wasser durch eine Cellophanmembran bei 4 C entsalzt und das erhaltene Dialysat lyophilisiert, wobei 0,7 Teile gereinigtes Enzym erhalten wurden. Die spezifische Aktivität des Produktes betrug 2400 E/mg. Die allgeraienen Eigenschaften des Produktes sind nachstehend angeführt:

(Α) Farbe und Aussehen: weiß und pulvrig

(B) Elementaranalyse: C 46,12 (#) +_ 0,26

H 6,51 (#) + 0,07 N 13,80 ($>) Hh 0,20

(C) Molekulargewicht (Methode nach Andrews, Biochem.J. 91t

222 (1964) : 25.000 +. 1000

(d) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 1 gezeigt, eine maximale Absorption bei 275 bis 280 rou,

■Ipi* _ rj _n

^280 mu, 1 cm " '»'*
(E) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 2 gezeigt (KBr-Plättchen-Methode) , signifikante IR-Absorptionsbanden in Mikron sind die folgenden:

3,0 (stark), 3,38 (mittel), 6,05 (breit, stark), 6,55(breit, stark), 6,88 (schwach), 7,15 (breit, mittel), 8,12 (mittel) und 9,3 (breit, schwach).

(f) Isoelektrischer Punkt (Elektrofokusier-Methode) :

pH 6,3 bis 7,0

(g) Löslichkeit: löslich in Wasser und in einer wässerigen

Salzlösung mit einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,1. Unlöslich in Alkohol, Aceton und Äther.

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(Η) Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität: der optimale pH-Wert liegt bei 5 bis 8, bei einer Messung bei 37°C während 50 Minuten gegen Olivenöl (j.P.) als Substrat. Der Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität ist auf die gleiche Weise gemessen, wie oben unter "Definition der Einheit" angegeben, und ist in Fig. 3 dargestellt.

(l) Einfluß der Temperatur auf die Aktivität: die optimale Temperatur liegt bei 35 bis 4i°C und wird in einem 0,IM Phosphatpuffer bei pH 7,0 während 50 Minuten gegen Olivenöl (j.P.) als Substrat gemessen. Der Einfluß der Temperatur auf die Stabilität wird auf die gleiche Weise gemessen, wie unter "Definition der Einheit" angegeben ist, und ist in Fig. 4 dargestellt.

(j) Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität: die Lipase-Restaktivität (%) nach 2-stündigem Stehen bei 23°C bei verschiedenen pH-Werten ist in Fig. 5 dargestellt. Das Enzym ist in einem Bereich von pH 4 - 10 stabil.

(K) Thermostabil!tat: die Lipase-Restaktivität ($) nach 10-minütigem Erhitzen in Gegenwart eines O,IM Phosphatpuffers vom pH-Wert 7 bei verschiedenen Temperaturen ist in Fig. 6 dargestellt. Das Enzym ist stabil bis zu 40 C, wird bei 45 C um 30$ inaktiviert und ist bei 50 C vollkomen inaktiv.

(l) Einfluß von Galle: die Lipaseaktivität gegen Olivenöl (j.P.) steigt auf nicht weniger als 150$ der eigenen Aktivität, wenn auf 1/200 verdünnte Hundegalle hinzugefügt wird.

Typische Experimente sind nachstehend angeführt. Galle, die direkt aus dem Gallengang eines Hundebastardes (männlich) unter Verwendung einer.Injektionsspritze gesammelt wurde, wurde auf 1/50, 1/100 und 1/200 verdünnt und diese Verdünnungen wurden aliquoten Teilen eines Lipase-Substrats zugesetzt, um die Änderung der Enzymaktivität zu vergleichen.

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Wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, wird die Aktivität der Lipase durch die Galle beträchtlich erhöht. Im Gegensatz dazu wird die Aktivität der Kontroll-Lipase, die mit Candida cylindracea (Agr.Biol.Chem. JO, Nr. 11, 1097 (1956)) erhalten wird, durch Galle inhibiert.

Enzymaktxvität (relativ)

Hundegalle verdünnt erfindungsge- Candida-Lipase mäße Lipase (#) [$}

1/50 133 (#) 33

1/1OO 200 55

1/200 202 60

Kein Zusatz 100 100

Bemerkung: Olivenöl (j.P.) wurde als Substrat verwendet.

In 2k Vol.-Teilen destilliertem Wasser wurden 2,4 Teile des oben erwähnten Enzyms gelöst. Die Lösung wurde durch eine Kolonne geschickt, die mit Cellulosepulver (der Firma Toyo Roshi Co. Ltd., Japan, 200 bis 300 mesh) gefüllt war. Die Cellulose wurde mit 0,02 M Acetatpuffer (pH = 5,jtf), der 2.10 M CaCIp enthielt, eingestellt. Anschließen!wurde die Kolonne mit 0,02 M Acetatpuffer (pH-5,0), welcher 2.1O~3M CaCl₂ enthielt, gewaschen, wobei 200 Vol.-Teile Eluat erhalten wurden. Dem Eluat wurde Ammoniumsulfat bis zu 50% (w/v) zugesezt, dabei bildete sich ein Niederschlag. Der Niederschlag wurde zentrifugiert (9000 Upm, 10 Minuten) und gegen den genannten Acetatpuffer 72 Stunden lang dialysiert. 67 Vol.-Teile der Lösung nach der Dialyse wurden durch eine Kolonne, die mit einem Dextran-Carbqxymethyl-Sephadex C-50 (Pharmacia Co. Ltd.) - eingestellt mit dem genannten Acetatpuffer - geschickt, um das Enzym zu adsorbieren. Die Kolonne wurde mit einer 0,1M Natriumchloridlösung eluiert, wobei 23 Vol.-Teile Lipasefraktion erhalten wurden. Die Fraktion wurde über Nacht bei 4°C stehen gelae-

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sen und O,185 Teile kristallines Enzym wurden erhalten. Die spezifische Aktivität des Produktes betrug 3750 E/mg.

Die Eigenschaften des Produktes waren die folgenden:

(A') Farbe: weiß

(B¹ ) Elementaranalyse ι C 47,05 (#) _+ 0,05

H 6,48 (%) _+ 0,02 N 13,99 (%) + 0,01

(C¹) Molekulargewicht (Methode nach Andrew, Bioehem.J.,

91. 222 (1964) und S.D.S. Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese J.Biol.Chem., 244. 5074 (1969): 26.000 +_ 1000

(D¹) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 7 gezeigt, maximale Absorption bei 275 bis 280 tau, E^g₀ i_Cm ⁼ 10,1.

(E¹) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 8 gezeigt (KBr-Plättchen-Methode), signifikante IR-Absorptionsbanden in Mikron sind die folgenden:

3,0 (stark), 3,38 (mittel), 6,05 (breit, stark), 6,55 (breit, stark), 6,88 (schwach), 7,15 (breit, mittel), 8,12 (mittel) und 9,3 (breit, schwach).

(F·) Iso'elektrischer Punkt (Elektrofokua.erungsmeth.ode): pH 5,8 bis 6,7.

(G¹) Löslichkeit: löslich in Wasser und wässerigen Salzlösungen einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,1, unlöslich in Alkoholen und Aceton und Äther.

(H¹) Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität: der optimale pH-Wert liegt bei 5,8, bei Messung bei 37⁰C während 50 Minuten gegen Olivenöl (j.P.) als Substrat. Die Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität wurde auf die gleiche Weise gemessen, wie in "Definition der Einheit angegeben und in Fig. 9 dargestellt ist.

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(l¹) Wirkung der Temperatur auf die Aktivität: die optimale Temperatur liegt bei 35 - ki°C, bei Messung in einem 0,1M Phosphatpuffer bei pH = 7,0 während 50 Minuten gegen Olivenöl (j.P.) als Substrat. Die Einwirkung der Temperatur auf die Aktivität wurde auf die gleiche Weise gemessen wie oben in "Definition der Einheit" angegeben ist und ist in Fig. 10 dargestellt.

(J') Wirkung des pH-Wertes auf die Stabilität: Die Lipase-Restaktivität (#) nach 2 Stunden bei 23°C bei verschiedenen pH-Werten ist in Fig. 11 dargestellt.; Das Enzym ist stabil im pH-Bereich von k bis 10.

(K') ThermoStabilität: die Lipase-Restaktivität nach 10-ninütigern Behandeln der Enzymlösung mit Wasser bei einem pH-Wert von 7 bei verschiedenen Temperaturen ist aus Fig. 12 ersichtlich. Das Enzym ist bis zu 40°c stabil, wird bei 45°C um 30$ inaktiviert und ist bei 50°C vollkommen inaktiv.

(L') Einwirkung eines Inhibitors: die Lipase-Aktivität in der Lösung, welche 0,05% (Gew./Vol.) der Lipase und 5«10" Mole Diiaopropylfluorphosphat (DFP), Ä'thylendiamintetraeseigsäure (EDTA) oder p-Chlor-mercuribenzoat (PCMB)enthält, wurde unter der Bedingung gemessen, daß die Lösung bei einem pH-Wet von 5 bis 8 bei k°C Stunde lang stehen gelassen wurde. Folgende Resultate wurden erzieltt

Restaktivität Reagens pH 5 pH 8

keines DFP EDTA PCMB

100	(*)	100
100		100
100		^9h
95		95

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Wie oben gezeigt wird, ist die Lipase gegen die genannten Reagenzien stabil. Daher ist die Lipase kein sogenanntes Metallenzym, SH- oder Serin-Enzym,

(Μ¹) Charakter!tika aus der Aminoeäureanalyseι ' (i) kein Cystein-Rest
(il) zwei S-S-Bindungen
(iii) zwei Tryptophan-Reste (iv) kein Saccharid
(v) kein Lipid.

(Ν¹) Einwirkung von Galle: die Lipase-Aktivität gegen Olivenöl (j.P.) wird um nicht weniger als 1505t erhöht im Vergleich zur eigenen Aktivität bei Hinzufügen von 1/200 verdünnter Hundegalle.

Die typischen Experimente wurden auf die gleiche Weise aus geführt wie unter (L) "Wirkung von Galle".

Folgende Resultate wurden erzielt:

Enzymaktivität (relativ) Hundegalle verdünnt auf: erfindungsge- Candida-Lipase maße Lipase (&) (£)

1/50 135 3^

1/100 202 55

1/200 205 60

Kein Zusatz 100 100

Bemerkung! Olivenöl (J.P.) wurde als Substrat verwendet.

Die gleiche reine Lipase kann aus einer Kulturbrühe eines anderen Stammes der Gattung Phycoeyces als Phycomyces nitens NRRL 2kkk erhalten werden.

12 Figuren

21 Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche:

1. Mikrobiell hergestellte Lipase, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaftent

A) Maximum im UV-Absorptionsspektrum bei 275-280 Millimikron

B) signifikante IR-Absorptionsbanden in Mikron mittels KBr-Plättchen-Methode: 3,0 (stark), 3,38 (mittel), 6,05 (breit, stark), 6,55 (breit, stark), 6,88 (schwach), 7,15 (breit, mittel), 8,12 (mittel) und 9,3 (breit, schwach).

C) Löslichkeit in Wasser und wässerigen Salzen mit einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,1 und Unlöslichkeit in Alkoholen, Aceton und Äthern

D) Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität: der optimale pH-Wert liegt zwischen 5 und 8

E) Wirkung der Temperatur auf die Aktivität: die optimale Temperatur beträgt 35-41⁰C

F) Wirkung des pH-Wertes auf die Stabilität: stabil im pH-Bereich von k bis 10 bei 23⁰C

G) ThermoStabilität: stabil bei Temperaturen bis .40°C, Aktivitätsverlust um 30$ bei k5°C, vollkommen inaktiv bei 50 C und einem pH-Wert von 7

H) Wirkung eines Inhibitors: die Lipase-Aktivität in der Lösung, welche 0,05$ (Gew./Vol.) der Lipase und 5.10"" Mole Diisopropylfluorphosphat, Äthylendiamintetraessigsäure oder p-Chlor-mercuribenzoat enthält, wird nicht inhibiert, wenn sie bei h C und einem pH-Wert von 5-8 1 Stunde lang stehen gelassen wird

I) Wirkung von Galle: die Lipase-Aktivität gegen Olivenöl (J.P.) steigt um mindestens 150% ihrer ursprünglichen Aktivität in Gegenwart einer auf 1/200 verdünnten Hundegalle an.

2. Verfahren zur Herstellung von mikrobieller Lipase,

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dadurch gekennzeichnet, daß ein Lipase-produzierender Mikroorganismus der Gattung Phycomyces in einem Kulturmedium kultiviert wird, bis sich die Lipase in der Kulturbrtihe angesammelt hat, worauf die Lipase aus der Kulturbrühe abgetrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces nitens eingesetzt wird.

k. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces blakeeleeanus verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces nitens IFO-569^ verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces nitene IFO-5695 verwendet wird,

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces nitens NRRL-24*f*l· verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces nitens NRRL-2678 verwendet wird.

9* Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces brakesleeanus IPO-5822 verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces brakesleeanus IFO-5823 verwendet wird.

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11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces brakesleeanus IFO-5870 verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Phycomyces brakesleeanus IFO-5871 verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von 15 bis 45°C vorgenommen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 40°C vorgenommen wird.

15· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei der Kultivierung zwischen k und 10 liegt.

16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

daß der pH-Wert bei der Kultivierung zwischen 5*5 und 8 liegt.

17. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungszeit 10 bis 240 Stunden beträgt.

18. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungszeit 15 bis 168 Stunden beträgt.

19. Verfahren zur Herstellung der mikrobiellen Lipase nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung durch portionsweisen Zusatz von Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid zur Lipaselösung oder durch Zutropfen eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zur Lipaselösung oder mittels Dialyse durch Aussalzen erhaltenen Lipaseprazipitats durchgeführt wird.

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20. Pharmazeutische Komposition, dadurch gekennzeichnet, daß sie Lipaee und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermaterial enthält.

21, Pharmezeutisehe Komposition, dadurch gekennzeichnet, daß sie Lipas·, Digestivmittel und pharmazeutisch verträgliche Trägermaterialien enthält.

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L e e r s e i t e