DE19518768C2 - Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Sophoroselipiden und anderen Biotensiden auf Molkebasis - Google Patents

Description

Es wird ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung mikrobieller Biotenside auf Basis von zuvor auf verschiedenen Molkefraktionen hergestellten mikrobiellen Triglyceriden angegeben. Dieses Verfahren ermöglicht sowohl eine sinnvolle Verwertung des preiswerten Rohstoffes Molke aus der milchverarbeitenden Industrie als auch eine deutliche Senkung der Herstellungskosten von mikrobiellen Biotensiden, im speziellen von Sophoroselipiden, die für eine Anwendung im Kosmetik-, Pharma-, Lebensmittel und Umweltsektor von Interesse sind.

Tenside bestehen aus einem gut wasserlöslichen hydrophilen und einem gut fettlöslichen hydrophoben Molekülanteil. Das Größenverhältnis der Molekülanteile zueinander ("Hydrophilic- Lipophilic-Balance" oder abgekürzt "HLB-Wert") und die darin enthaltenen funktionellen Gruppen bestimmen die Tensid­ eigenschaften der jeweiligen Verbindung (z. B. Klassifizierung in ionische und nicht-ionische Tenside).

Chemische Tenside sind in der Regel aufgebaut aus Alkyl- oder Arylgruppen, die bei ionischen Tensiden als wasserlösliche Anteile Carboxylat-, Sulfonat, Phosphat- oder Ammoniumgruppen und bei den nichtionischen Verbindungen Alkohol-, Polyether oder Zuckerreste enthalten. Von Vorteil ist bei den chemischen Tensiden ihre einfache und preiswerte Herstellung vorwiegend aus Erdölprodukten. Nachteilig sind dagegen vor allem ihre schlechte biologische Abbaubarkeit und die geringe Varianz bei den funktionellen Gruppen im lipophilen Molekülanteil.

Chemische Tenside werden in Lebensmitteln und in Pharmaprodukten daher wenig eingesetzt. Auch in Wasch- und Reinigungsmitteln sowie in Kosmetika basiert heute schon bereits etwa die Hälfte der verwendeten Tenside auf natürlichen Ölen und Fetten (C. Breucker et al. (1995) Chem. Ing. Tech. 67: 430-440).

Biologische Tenside oder sogenannte Biotenside zeigen im Gegensatz zu chemischen Tensiden eine große Strukturvielfalt sowohl im hydrophilen als auch im lipophilen Molekülanteil (S. Lang and F. Wagner (1987) pp. 21-46 in "Biosurfactants and Biotechnology" (N. Kosaric, W. L. Cairns and N. C. C. Gray, editors), Surfactant Science Series Vol. 25. Marcel Dekker, New York). Meist handelt es sich um mikrobielle Sekundärmetaboliten, die von den Produzentenstämmen bevorzugt bei Wachstum auf lipophilen Substraten wie n-Alkanen und Triglyceriden gebildet werden (G. Georgiu et al. (1992) BIO/TECHNOLOGY 10: 60-65). Neben guter Umweltverträglichkeit, niedriger Toxizität und hoher Tensidwirkung bereits in niedrigen Konzentrationen (mg/l - Bereich) zeigen diese Verbindungen häufig interessante biologische Effekte wie z. B. Membranaktivität oder Antibiotikawirkung, die sie für eine industrielle Anwendung im Pharma- Kosmetik und Lebensmittelbereich zunehmend interessant erscheinen lassen. Hier werden bisher fast ausschließlich teure pflanzliche oder tierische Biotenside verwendet (V. Klekner and N. Kosaric (1993) pp. 373-390 in "Biosurfactants: Production - Properties - Applications" (N. Kosaric, editor), Surfactant Science Series Vol. 48. Marcel Dekker, New York).

Gegen einen breiten industriellen Einsatz der mikrobiellen Produkte vor allem im "Bulk"-Chemikalienbereich sprechen im Moment noch die Herstellungskosten, die zur Zeit mindestens um den Faktor 10-20 höher liegen als die chemischer Tenside (V. Klekner and N. Kosaric (1993) pp. 373-390 in "Biosurfactants: Production - Properties - Applications" (N. Kosaric, editor), Surfactant Science Series Vol. 48. Marcel Dekker, New York). Der Grund dafür ist neben der z. T. aufwendigen Medienvorbereitung, Aufarbeitung und Prozeßführung - die Biotenside werden in der Regel erst in der stationären Wachstumsphase nach Eintreten einer Limitierung gebildet und verursachen häufig starke Schaumprobleme - vor allem darin zu sehen, daß reine n-Alkane oder hochwertige Pflanzenöle als Substrate verwendet werden müssen (G. Georgiu et al. (1992) BIO/TECHNOLOGY 10: 60-65).

Eine kostengünstige Alternative zur Herstellung dieser Verbindungen kann hier der Einsatz preiswert herstellbarer mikrobieller Triglyceride, sogenannter "Single Cell Oils", als Substrate darstellen.

Solche mikrobiellen Triglyceride werden von verschiedenen Mikroorganismen vor allem der Gattungen Cryptococcus, Lipomyces, Rhodotorula, Trichosporon - sogenannten "Fetthefen" - und Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Rhizopus, Aspergillus und Penicillium bevorzugt unter Stickstofflimitierung in Konzentrationen von bis zu 70% der Zelltrockenmasse als Speicherstoffe gebildet (C. Ratledge (1993) TIBTECH 11: 278-284).

Die Hefe Cryptococcus curvatus hat sich dabei in verschiedenen Screeningverfahren als besonders geeigneter Produzentenstamm für die "Single Cell Oil"-Bildung erwiesen (M. Hassan et al. (1994a) J. Microbiol. Biotechnol. 10: 534-537; M. Hassan et al. (1994b) Biotechnol. Lett. 16: 819-824; L. Heredia and C. Ratledge (1988) Biotechnol. Lett. 10: 25-30; N. J. Moon et al. (1978) J. Dairy Sci. 61: 1537-1547).

Die mikrobiell gewonnenen Triglyceride zeigen nach den oben genannten Arbeiten in etwa dieselbe Zusammensetzung wie hochwertige Pflanzenöle und lassen sich ohne Schwierigkeiten z. B. auf Molkebasis ohne weitere Zusätze (N. J. Moon et al. (1978) J. Dairy Sci. 61: 1537-1547) oder auch auf Holzhydrolysaten (L. Heredia and C. Ratledge (1988) Biotechnol. Lett. 10: 25-30) herstellen. So ist das mikrobielle Triglycerid aus der Hefe Cryptococcus curvatus sehr reich (ca. 50% der enthaltenen Fettsäuren) an ungesättigter Ölsäure.

In Neuseeland gab es Ende der achtziger Jahre Bestrebungen, solche mikrobiellen Triglyceride großtechnisch auf Molkebasis herzustellen, um so die enormen Abfälle der dortigen milchverarbeitenden Industrie sinnvoll zu nutzen (C. Ratledge (1993) TIBTECH 11: 278-284).

Am Lebensmittelmarkt konnten sich mikrobielle Triglyceride jedoch bisher nicht gegen pflanzliche Öle, wie z. B. Sonnenblumenöl oder Kokosfett, und tierische Fette behaupten, da die mikrobiellen Produkte intrazellulär vorliegen und sich eine für einen späteren Einsatz als Speiseöl oder Speisefett notwendige Reindarstellung wesentlich aufwendiger gestaltet als bei den vergleichbaren pflanzlichen und tierischen Produkten. Zur Zeit gehen einige Forschungsarbeiten daher dahin, durch gezieltes Eingreifen in den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen im "Single Cell Oil" zu ungewöhnlichen Fettsäuren mit wesentlich höherer Wertschöpfung zu kommen (Kettenlängen von < 18 C-Atomen mit bis zu 5 Doppelbindungen), die so nicht in tierischen und pflanzlichen Fetten vorkommen.

Sophoroselipide werden von verschiedenen Hefen der Spezies Candida bombicola, apicola und magnoliae bevorzugt bei Wachstum auf ölsäurereichen Pflanzenölen, n-Octadecan oder Ölsäure selbst - z. T. in Kombination mit Kohlenhydraten - nach Eintreten einer Stickstofflimitierung gebildet (D. G. Cooper and D. A. Paddock (1984) Appl. Environm. Microbiol. 47: 173-176; A.-M. Davila et al. (1994) J. Ind. Microbiol. 13: 249-257). Sie sind schwerer als Wasser und scheiden sich bei entsprechend hohen Konzentrationen in Form kleiner Fettkügelchen aus dem Kulturmedium ab.

Sophoroselipide sind in der Fachliteratur bereits bekannt seit Anfang der frühen sechziger Jahre (P. A. J. Gorin et al. (1961) Canad. J. Chem. 39: 816-855; A. P. Tulloch et al. (1962) Canad. J. Chem. 40: 1326-1338) und inzwischen sehr gut bezüglich ihrer Biosynthese ((D. G. Cooper and D. A. Paddock (1984) Appl. Environm. Microbiol. 47: 173-176; Hommel et al., 1987) und Struktur (Asmer et al., 1988) charakterisiert. Die 2 Hauptprodukte sind die Säure- und Lactonform, die aus den Kulturen isoliert werden können:

Neben diesen beiden Hauptprodukten kommt in den Kultur­ überständen noch eine Reihe unterschiedlich acetylierter Nebenprodukte vor (H.-J. Asmer et al. (1988) JAOCS 65: 1460- 1466).

Zwar sind die sophoroselipidbildenden Candida-Hefen ebenfalls in der Lage, auf Molke zu wachsen, die im Milchzucker enthaltene Galactose wirkt jedoch als Repressor der Biosynthese des Sophoroselipids, so daß eine direkte Bildung auf Molkebasis nicht in Frage kommt (R. K. Hommel and K. Huse (1993) Biotechnol. Lett. 15: 853-858).

Im Anwendungsbereich ist der Einsatz von Sophoroselipiden als Zusatz in verschiedenen Kosmetikprodukten mit guter Hautverträglichkeit und gleichzeitigem antimikrobiellem und antiviralem Effekt beschrieben (H. Mager et al. (1987), DE 35 26 417 A1). Ebenso wird ein positiver Effekt bei Einsatz als Detergenz in der Papierverarbeitung geschildert (S. S. Helle et al. (1993) Biotechnol. Bioeng. 42: 611-617). Ein Einsatz im Umweltsektor, z. B. zur Deemulgierung von ölkontaminiertem Schlamm ("Schluff"), erscheint sehr vielversprechend. Im Umweltbereich konnten zudem bereits positive Ergebnisse bei der mikrobiellen Dekontamination ölverseuchter Böden erzielt werden (R. Müller-Hurtig et al. (1993) pp. 447-470 in "Biosurfactants: Production - Properties - Applications" (N. Kosaric, editor), Surfactant Science Series Vol. 48. Marcel Dekker, New York).

Nachteilig für eine breite Anwendung der Sophoroselipide ist jedoch bisher, daß der Preis für diese Verbindungen trotz Produktkonzentrationen von 70-120 g/l im Batch-Prozeß (D. G. Cooper and D. A. Paddock (1984) Appl. Environm. Microbiol. 47: 173-176) und bis zu 320 g/l im Fed-Batch-Prozeß (A.-M. Davila et al. (1994) J. Ind. Microbiol. 13: 249-257) etwa 80,- DM pro kg beträgt (V. Klekner and N. Kosaric (1993) pp. 373-390 in "Biosurfactants: Production - Properties - Applications" (N. Kosaric, editor), Surfactant Science Series Vol. 48. Marcel Dekker, New York), wobei die Substratkosten entscheidend in den Preis eingehen. Dieser Preis verhindert trotz guter Forschungsergebnisse bei Anwendungsuntersuchungen vor allem im Umweltbereich bisher eine breite kommerzielle Verwertung.

Hieraus stellt sich die Aufgabe, ein biotechnologisches Verfahren zu entwickeln, daß eine deutlich preiswertere Herstellung von Sophoroselipiden erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 3 gelöst.

Eine Möglichkeit zur preiswerten Herstellung von Sophoroselipiden kann die Verwendung von bei der Käseherstellung anfallenden, lactose- und nährstoffreichen Molkefraktionen als Substrat bieten:

In einem 2-stufigen Prozeß wird zunächst auf zuvor kalt­ sterilfiltrierten Molkefraktionen (wie z. B. Süßmolke, Sauermolke, entsprechende Konzentrate oder in Wasser gelöstes Molkepulver) ohne weitere Zusätze die fettbildende Hefe Cryptococcus curvatus angezogen. Nach Eintreten der Stickstofflimitierung bildet dieser Organismus intrazellulär ein Triglycerid, das sehr reich an Ölsäure ist. Schließt man nach Beendigung der Züchtung die Biomasse z. B. mechanisch mit einer Glasperlenmühle auf und setzt den Aufschluß - gegebenenfalls nach Sterilisation - direkt in einer zweiten Stufe ohne weitere Zusätze als Substrat für die Hefen Candida bombicola, C. apicola oder C. magnoliae ein, so beobachtet man ein Wachstum und eine Sophoroselipidproduktion, die analog dem Substrat Sonnenblumenöl bei Zusatz von Glucose und Harnstoff zum Medium verlaufen.

Die gebildeten Sophoroselipide scheiden sich am Ende der Kultivierung in Form kleiner Fettkörnchen ab, die schwerer als Wasser sind und sich relativ einfach von der Kulturbrühe abtrennen lassen.

Es konnte durch Dünnschichtchromatographie gezeigt werden, daß das Produktspektrum der gebildeten Sophoroselipide bei beiden Herstellungsverfahren praktisch identisch ist.

Von großem Vorteil bei dieser Vorgehensweise erscheint die Tatsache, daß man nicht nur preiswerte Molkefraktionen als Ausgangssubstrat zur Sophoroselipidproduktion verwenden kann, sondern im Gegensatz zu den etablierten Verfahren auch auf den Zusatz von weiteren Nährsalzen und Substraten - wie z. B. von zusätzlichen Kohlenhydraten oder Stickstoffquellen - sowohl in der ersten Stufe (Cryptococcus curvatus) als auch nach dem Zellaufschluß in der zweiten Stufe (Candida bombicola) ganz verzichten kann.

Das so gewonnene Produkt erscheint damit besonders attraktiv für eine spätere Anwendung im Kosmetik- und Lebensmittelbereich, da außer der Molke und den gesundheitlich unbedenklichen, z. T. ebenfalls bereits direkt im Lebensmittelsektor verwendeten Hefen, keine weiteren Zusätze erforderlich sind.

Beispiel 1

Der Mikroorganismus Apiotrichium curvatum ATCC 20509 (reklassifiziert als Cryptococcus curvatus) wird in einem 3- Liter Bioreaktor auf zuvor sterilfiltriertem Sauermolkepermeat (Fa. Milei GmbH, Leutkirch, Allgäu; Zusammensetzung: 40-50 g/L Lactose, 7-8 g/L Lactat, 20 mmol/L Phosphat, 2.8 g/L Protein und 0.52 g/L Stickstoff [nach Kjeldahl bestimmt]) als einziger Kohlenstoff- und Stickstoffquelle bei 30°C, 400 Upm und Sauerstoffsättigung gezüchtet. Der pH-Wert wird dabei mit steriler 2 N NaOH-Lösung auf pH 5.4-5.8 konstant gehalten. Zum Beimpfen des Bioreaktors werden 300 mL einer 48 h zuvor bei 30°C und 100 Upm im Schüttelkolben auf einer Schüttelmaschine kultivierten Vorkultur der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 auf Sauermolkepermeat, pH 5.8, genommen. Diese Vorkultur ist zuvor wiederum beimpft worden mit einer Impföse von einem frischen Schrägröhrchen von Cryptococcus curvatus ATCC 20509 auf ME-Agar (Zusammensetzung: 200 g/L Malzextrakt, 5 g/L Pepton, 15 g/L Agar in 1000 ml destilliertem Wasser).

Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 im Bioreaktor ist nach ca. 50 h beendet. Unter dem Mikroskop ist erkennbar, daß die Hefezellen sich nicht mehr teilen und intrazellulär Triglycerid in Form deutlich erkennbarer Fett- Tröpfchen angereichert haben.

Die Hefezellen werden in bekannter Weise mit einer Zentrifuge geerntet. Durch Resuspendieren der Zellfeuchtmasse in destilliertem Wasser stellt man eine 30%ige Lösung davon her und schließt diese anschließend in bekannter Weise mit einer Glasperlenmühle auf (Bedingungen: Dyno-Mill KDL, Firma Bachofen, ausgestattet mit einem 150 ml-Mahlgefäß, das zu 80- 85% mit 0.3 mm großen Glasperlen gefüllt ist und während des Aufschlußes gekühlt wird; 3200 Upm; Aufschlußzeit ca. 20 min). Nach Abtrennung der Glasperlen wird der so erhaltene, auch nach mehreren Stunden noch homogene, triglyceridreiche Aufschluß in einen 1-Liter-Bioreaktor überführt und 30 min bei 121°C sterilisiert. Nach Abkühlen auf 30°C wird der Bioreaktor mit 100 mL einer einer 48 h zuvor bei 30°C und 100 Upm im Schüttelkolben auf einer Schüttelmaschine kultivierten Vorkultur der Hefe Candida bombicola ATCC 22214 beimpft. Diese Vorkultur ist zuvor wiederum beimpft worden mit einer Impföse von einem frischem Schrägröhrchen von Candida bombicola ATCC 22214 auf einem Komplexmedium (Zusammensetzung: 3 g/L Malzextrakt, 3 g/L Hefeextrakt, 5 g/L Pepton, 10 g/L Glucose, 15 g/L Agar in 1000 ml destilliertem Wasser; pH 5.5, vor dem Sterilisieren mit 2 N NaOH eingestellt).

Die Kultivierung der Hefe Candida bombicola ATCC 22214 auf dem triglyceridreichem Zellaufschluß im Bioreaktor erfolgt ohne pH- Korrektur bei 400 Upm unter Luftsättigung und ist nach ca. 200 h beendet. Die Kulturbrühe, deren pH-Wert bei Abbruch ca. pH 3.0 beträgt, wird in bekannter Weise erschöpfend mit Ethylacetat extrahiert. Nach Aufkonzentrierung am Rotationsverdampfer im Vakuum enthält der Extrakt ca. 35 g/L Sophoroselipid, wie in bekannter Weise über die Anthronmethode kolorimetrisch am Photometer bestimmt wird.

Beispiel 2

Der Mikroorganismus Apiotrichium curvatum ATCC 20509 (reklassifiziert als Cryptococcus curvatus) wird wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch wird anstelle der Glasperlenmühle für den Zellaufschluß ein Hochdruckhomogenisator verwendet. Da damit der erreichte Aufschlußgrad niedriger ist, beträgt die Ausbeute an Sophoroselipid bei der anschließenden Züchtung der Hefe Candida bombicola ATCC 22214, die ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben erfolgt, nur 4.5 g/l.

Beispiel 3

Der Mikroorganismus Apiotrichlum curvatum ATCC 20509 (reklassifiziert als Cryptococcus curvatus) wird wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch wird anstelle des Sauermolkepermeates ein Sauermolkekonzentrat verwendet (Fa. Milei GmbH, Leutkirch, Allgäu; Zusammensetzung: ca. 140 g/L Lactose, 40 g/L Lactat, 80 mmol/L Phosphat, ca. 10 g/L Protein und ca. 2 g/L Stickstoff [nach Kjeldahl bestimmt]) Dieses wird sterilfiltriert und im Verhältnis 1 : 1 mit sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Der Zellaufschluß und die anschließende Züchtung der Hefe Candida bombicola ATCC 22214 auf dem triglyceridhaltigem Zellaufschluß erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 4

Der Mikroorganismus Apiotrichium curvatum ATCC 20509 (reklassifiziert als Cryptococcus curvatus) wird wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch wird in der 2. Prozeßstufe anstelle der Hefe Candida bombicola ATCC 22214 die Hefe Candida magnoliae DSM 70638 verwendet.

Beispiel 5

Der Mikroorganismus Apiotrichlum curvatum ATCC 20509 (reklassifiziert als Cryptococcus curvatus) wird wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch wird in der 2. Prozeßstufe anstelle der Hefe Candida bombicola ATCC 22214 die Hefe Candida apicola IMET 43747 verwendet.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Biotensiden, bei dem triglyceridhaltige Zellaufschlüsse von Mikroorganismen der Gattungen Cryptococcus, Lipomyces, Rhodotorula, Trichosporon, Cunninghamella, Rhizopus, Aspergillus oder Penicillium ohne weitere Zusätze als einzige assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle eingesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikrooganismus die Hefe Cryptococcus curvatus auf Molkefraktionen züchtet, die Zellen aufschließt, und in dem triglyceridhaltigem Aufschluß, gegebenenfalls nach dessen Sterilisation, die Hefen Candida bombicola, Candida apicola oder Candida magnoliae zur anschließenden Sophoroselipidbildung kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anzucht des und zur Trigyceridbildung durch den Mikrooganismus Cryptococcus curvatus kalt sterilfiltrierte Süßmolke, Sauermolke, Konzentrate davon oder in Wasser gelöstes Molkepulver verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen des Mikrooganismus Cryptococcus curvatus durch chemische, enzymatische oder physikalisch-mechanische Methoden, vorzugsweise mit Glasperlenmühlen oder Hochdruckhomogenisatoren, aufschließt.