DE3390215T1 - Umwandlung von geklärten Molkenlactosepermeaten in Kulturmedien und andere kommerziell brauchbare Produkte - Google Patents

Description

3.3.902-1Sl

fieschrjeibuiig .....''

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Umwandlung von Mojkenfraktionen zu kommerziell brauchbaren Produkten. Die Erfindung betrifft außerdem diese neuen Produkte selbst und Verfahren zur Anwendung dieser Produkte, Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von im wesentlichen deproteinierten Molkenlaktoseperirteaten (MLP) mit Base, um eine laktosereiche wässerige Lösung zu erzeugen, die in der Lage ist, das Wachstum einer Vielzahl von Mikroorganismen zu fördern, sowie eine mikrokristalline Ausflockung, weiche in eine trockene, frei fließende, geschmacks- und geruchslose Zusammensetzung umgewandelt werden kann, die emulgierende und suspendierende Eigenschaften aufweist, weshalb sie für eine Vielzahl von Anwendungszwecken in der Lebensmittel-, pharmazeutischen, kosmetischen oder anderen Industrie geeignet ist.

St and der Technik

Aus J. Appl. Ghem. Bioteehn.pl. ?7:.-165-169 (1977) ist bekannt, daß Molkenabfälle, die bei der Produktion von Käse und Kasein anfallen, enorme Rkologische und ökonomische Probleme mit sich bringen, wobei die jährliche Produktion von Molken in den Vereinigten Staaten zu einer Umweltverschmutzung führt, deren Ausmaß auf die gleiche Verschmutzung geschätzt wird, wie sie von zehn Millionen Menschen verursacht wird. Zwar kann Molke zum Teil als Tierfutter verwendet werden, wie z.B. in den US-Patenten 3 3^3 962; 3 497 359 und A 320 15Ο beschrieben ist, jedoch wird Molke im allgemeinen als Abfall betrachtet und wird nach herkömm-

lichen Methoden verworfen. Zwar haben neuerliche Entwick- ^f?r

lungen in der Ultrafiltrationstechnologie es möglich gemacht, f

Proteine aus Molken in wirtschaftlicher Weise zu gewinnen, !

jedoch bringt die Beseitigung der übriggebliebenen, deprotei- _k

nierten Molkenlaktosepermeate schwere Probleme mit sich, <·

da diese fast die ganze Laktose (etwa 15 g/l) enthalten und ]·

somit den größten Anteil an der Umweltverschmutzung (biolo- f

gischer und chemischer Sauerstoffbedarf) durch die Ursprung- I

liehen Molken bedeuten. §

Bei dem Versuch, dieses Problem zu lösen_e wurden Fermentationstechniken entwickelt, um die Laktose zu Futterhefen, z.P, Kluyveromyces fragilis umzuvramleln, womit versucht v/urde, den begrenzten Markt für Laktose sie Ib st ?.u versorgen. Derartige Verfahren bedienen sich im allgemeinen der Fermentation der Molken oder des Molkenlaktosepermeatr», zunächst ohne vorherige Konzentrierung und später mittels Dialysekulturtechniken, wie sie in der eingangs erwähnten Zeitschrift beschrieben sind. Zwar bieten diese Techniken die Möglichkeit der Entfernung bis zu 90 % der in dem Molkenlaktosepermeat enthaltenen Laktose, jedoch haben diese Methoden den Nachteil, daß sie ein einziges Produkt von beschränkter Verwendbarkeit liefern.

In J. Dairy Sei. 63: 722-730 (1980) ist über die kontinuierliche Dialysefermentation von deproteinierten Molken unter Erzeugung von Laktobazillus-Zellen berichtet v/orden. Unter Verwendung von deproteinierten Molken als Substrat wurde der Gärbehälterinhalt bei einem konstanten pH-Wert von 5,5 durch Zugabe von Ammoniak gehalten und durch eine semipermeable Membran gegen Wasser dialysiert; die Produktion an Zellen | war doppelt so groß wie bei einer piewtthnliehen kontinuierll*· \ chen Fermentation. j

Sowohl süßes Molkenpermeat als auch saures ^olkenpermeat !

ist als Ausgangsmaterial bei der Äthanolpewinnunp; unter ]

Verwendung von ß-Galactosidase und Saccharomyces cerevirsiae |

verwendet worden, wie in Applied Biochemistry and Rio- *

technology 7: '13-15 (1082) berichtet wird. Obgleich mehr als ? \

50 f/ der Laktose zu Äthanol umgewandelt werden, enthalt
das Kluat weniger als 2 % Ethanol,bezogen auf das Gewicht/
Einheitsvolumen an Molkenpermeat-Ausgangsmaterial.

über die Verwendung von ganzer Molke als bakeriologisches
Kulturmedium ist in Mikrobiyo.l. BuI. 9(^JO: 273-279 (1^η7Μ
und in SU-PS 819 Ιββ berichtet worden. Wie in Che*n. Abs.
84: 72629u und 95: 599O4n zusammengefaßt wird, wird bei dem
erstgenannten Prozeß unbehandelte ganze Molke verwendet .
während beim letztgenannten Prozeß die Laktose aus der ursprünglichen Molke entfernt und die Proteine darin hydrolysiert werden. Aus Oründen, die bis jetzt von der Fachwelt
nicht ganz verstanden werden, hat keines dieser genannten
Verfahren eine breite Anwendung für entweder industrielle
oder klinische Kulturmedien g

Kolloidale Molkenprftzipitate haben als TrHbungs-, ■ Stahili-

sierungs-, Emulgierungs-, Verdickungs- und Oelierungszusatz- j

stoffe zu Nährmittelzusammensetzungen Verwendung gefunden j,-

■ ■ '·■■■/

(im wesentlichen in Abhängigkeit von der angevmndten Kon- ;

zentration des Präzipitats), worüber in den US-Patenten . ^l

4 143 174 und 4 209 5O"5 berichtet wird. Tm letztgenannten :

Patent wird nichts fiber brauchbare Anvrendunger. f'ir die ί

überstehende Flüssigkeit berichtet, die von den kolloidalen i Präzipitat abgetrennt wird, ' ■ . . \

Aus MOlkenpermeaten kann eine Vielzahl von Peststoffen er- J

¹ ' ■ ■ ■ i

halten werden, je nach den Temperatur-, pH- und anderen Pe- |

dingungen, unter denen sie gebildet werden (US-Patente ;

4 042 575 und 4 042 576). Im US-Patent 4 ?.O?. qOQ wird ein ι

Verfahren beschrieben zur Gewinnung von Laktose aus ^Molken- j

permeaten durch Bildung eines Präzipitats beim Erhitzen j

auf I80 bis 200° P (82 - 93° C) und Abtrennen der (!berste- i henden Flüssigkeit. Abgesehen von der fiewinnunr von-Laktose
zeigt dieses Patent keine industrielle oder kommerzielle

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Verwendung für das PrIizip!tat oder für die überstehende Flüssigkeit auf. Im US-Patent Ί Oj56 99^ wird die Vorbehandlung von roher saurer Käsemolke durch Einstellung des pM- Wertes auf etwa 6,5 und Abtrennung unlöslicher Feststoffe beschrieben. Die abgetrennten Peststoffe werden behandelt ₍, indem Kalziumionen zugegeben werden, erhitzt und getrocknet wird, um ein Produkt zu erhalten, das als fettfreier, trockener, Milchersatz in Backwaren brauchbar ist.

Es wurde nun gefunden, daß bei Anwendung einer besonderen Kombination von Temperatur- und pH-Bedingungen ,crer/'f. der vorliegenden Erfindung eine einzigartige kombination· von wertvollen Nebenprodukten erhalten wird und daß die L?'sliohkeitsbedingungen des PrMzipitats in Abhängigkeit von der Menge des daraus entfernten Wassers variiert werden können.·.

Beschreibung der Erfindung

Ziel der vorliegenden Erfindung int ein einfaches und billiges Verfahren zur Umwandlung· von deproteinierten '"olkfnnermeaten zu industriell brauchbaren Produkten.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein ^verfahren 7,ur Umwandlung von deproteinierten, laktosereichen Molkenfrnkt.ionen zu mindestens einer Fraktion, welche ein mikrokristalliner, Trübematerial enthMlt (das sind mikroskopisch kloine Kristalle, die mit bloßem Auge nicht erkennbar sind)„'sowie mindestens eine laktosereiche wässrige, gelöste-Fraktion, wobei jede diesejf beiden Fraktionen in einer Vielzahl von industrirllen_s kommerziellen und klinischen Anwendungsgebieten verwendbar ist. ■■■■'■ · ..-,..

Ein besonderes Ziel der Erfindung ist ein laktosereinhes Produkt aus laktosereichen Molkenfraktionen, das brauchbar ist zur Zubereitung von industriellen Fermentationnmedien,

klinisch-diagnostischen Kulturmedien und anderen N#hrmedien für die Kultur von Mikroorganismen.

Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung sind Verbesserungen bei Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen unter
Verwendung dieser Medien.

Ein zweites besonderes Ziel der. vorliegenden Erfindung ist
die Erzeugung eines mikrokristallinen' Trübematerials, das
als Emulgierungs-; Suspendierungs- und/oder Gelierungsmittel
verwendbar ist.

Wieder ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung sind
verbesserte Methoden zum Emulgieren und Suspendieren einer
Vielzahl Von Zusammensetzungen unter Verwendung dieser
genannten Mittel.

Ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die
Erzeugung Von Zusatzstoffen in Lebensmittelqualität zur
Verwendung in Nahrungsmitteln, pharmazeutischen Trägern, * Kosmetikgrundstoffen, Zahncremegrundstoffen usw. I

Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor. \

Kurze Beschreibung der Zeichnungen. ■

■.' ·."■"■ "~"~ ■ ■■ ·■■·.■'

Die Figuren 1 und 2 sind Fließbilder für ein bevorzugtes | Verfahren und für praktische Anwendungen gemftß der vor- \ liegenden Erfindung. '

Die Figuren 3 bis 5 sind graphische Darstellungen, welche |

den Einfluß des pH-Wertes auf das Zeta-Potential von typi - ■[

sehen Trübefraktionen gemMß der vorliegenden Erfindung sind; j

diese Werte wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 15 be- ι stimmt. Diejenigen Bereiche, in denen das Zeta-Potential ■ j

mindestens etwa 5 mv (entweder + oder -) beträgt, stellen j allgemein zufriedenstellende pH-Bereiche für die Bildung

ff* «»WO · » »

• · · » ■ ■ » ■· ■

Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung.

Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein
Verfahren vorgeschlagen zum Abtrennen gelöster Feststoffe
aus deproteiniertem Molkenlaktosepermeat, welche sonst

beim Behandeln des Permeats in einem Autoklaven ein Präzi

■ ■:

pitat formen würden j dabei werden gebildet

a) eine laktosereiche wässrige Gelöststoffphase, die als
mikrobiologisches; Kulturmedium brauchbar ist und die
bei der Behandlung in einem Autoklaven kein Präzipitat
bildet, und

b) ein mikrokristallines Trübepräzipitat, das als Zusatz
stoff von Lebensmittelqualität brauchbar ist, um

beständiger Emulsionen oder Suspensionen dar. f::

Figur 6 ist eine Strahlabtastmikrographie (SAM) eines |

kommerziellen Präparats aus einem sprühgetrockneten Kultur- f

medium technischer Qualität, das nach dem Verfahren von f;

Beispiel 10 der vorliegenden Erfindung zubereitet worden §

ist. ' . ■ : f,¹. I?

Figur 7 ist eine SAM der mikrokristallinen Trübefraktion, , I

die als ein Präzipitat gleichzeitig mit der Gelöststoff- _; I

phase erhalten wurde, von welcher das in Figur 6 gezeigte |

Kulturmedium produziert wurde. , · |"

Figur 8 ist eine SAM einer mikrokristallinen Trübefraktion, |

die in ähnlicher Weise aus einer anderen Quelle fflr depro- 1-

teiniertes Molkenlaktosepermeat erhalten wurde", und *■!■:

Figur 9 ist eine SAM einer mikrokristallinen Trübefraktion, ;|

die in ähnlicher Weise aus wieder einer anderen Quelle für ν |^

Molkenlaktosepermeat erhalten wurde, welche infolge eines f

Membranlecks einen hohen Proteingehalt aufwies. Y: I

Ausflockung, Stabilisierung, Emulgierung und Verdickung von Nahrungsmittel-, pharmazeutischen, kosmetischen oder anderen Zusammensetzungen zu bewirken.

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine Methode zur Behandlung von laktosereichen, deproteinierten Molkefraktionen unter Bildung mindestens eines Produkts, das mikrokristallines Trübematerial enthält, und mindestens eine Fraktion, die eine laktosereiche .wässrige fJelöst-8tQffphase enthält. Jedes dieser Endprodukte kann erfindungsgemäß weiterverarbeitet werden, um brauchbare Zusammensetzungen zu produzieren oder um Materialien zu liefern, welche in industriellen und kommerziellen Verfahren anwendbar sind. Insbesondere die Gelttststoffphnse r.cmtfß der vorliegenden Erfindung ist nützlich als ein mikrobiologisches Kulturmedium für klinische und industrielle Zwecke, unter Einschluß von aeroben und anaeroben Fermentationsprozessen. Das gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene mikrokristalline Trübematerial kann als ein Emulgierungs- und/oder Gelierungsmittel verwendet werden, das besonders brauchbar ist zum Emulgieren oder Gelieren von Proteinen, die als Nahrungsmittelzusätze, pharmazeutische Präparate, kosmetische .Stoffe und dergleichen verwendbar sind.

Derzeit wird ganze Molke im allgemeinen kommerziell durch Ultrafiltration verarbeitet, um einen proteinreichen Rückstand (Retentat) zu gewinnen. Das laktosereiche Permeat aus der ültrafiltrationsstufe wurde weiter behandelt, um Laktose und/oder Milchsäure zu gewinnen, oder das Permeat kann getrocknet und als Dünger verwendet werden. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Behandlung des laktosereichen Permeats zum Zwecke der Bildung anderer wertvoller Produkte.

Figur 1 erläutert ein allgemeines Verfahren gemäß der

vorliegenden Erfindung, bei welchem ganze Molke der Ultra- fv

filtration unterworfen wird, um ein laktosereiches Molken- ff

permeat zu erzeugen. Die Peststoffkonzentration des Permeats |;

wird auf einen angemessenen Wert eingestellt, und der pH- |

Wert wird auf etwa 8-10 eingestellt. Die Einstellung des I^

pH-Werts wird zur Bildung einer Ausflockung, die von dem |

überstehenden durch Zentrifugierung und/oder Ultrafiltration h

abgetrennt wird. Die Gelöststof fraktion kann gewünschten- £■;;

falls für spätere Verwendung sprühgetrocknet werden oder |·

wird als solche verwendet für die weitere Verarbeitung als f

ein mikrobiologisches Kulturmedium. Die Trübefraktion kann |

als solche verwendet werden, zu einer Paste eingeengt oder Γ

zur Verwendung als ein Emulgator getrocknet werden, um [■ wässrige oder ölige Flüssigkeiten zu emulgieren oder zum Emulgieren oder Gelieren von Proteinen. Die entstandenen Emulsionen oder Gele können mit anderen Stoffen kombiniert.

werden, die für den gewünschten Endzweck geeignet sind. |!

Wie Figur 2 zeigt, kann die Gelöststoffraktion durch ein geeignetes Nährmittel ergänzt und danach durch Behandlung in einem Autoklaven oder durch Filtration sterilisiert werden. Alternativ kann die nichtsterilisierte ergänzte Feststoffraktion gewünschtenfalls sprühgetrocknet werden, um für die spätere Verwendung gelagert zu werden, dann kann sie vor ihrer Verwendung durch Behandlung in einem Auto- _; klaven oder durch Filtration sterilisiert werden. Die sterilisierte Feststof fraktion, entweder nicht ergänzt oder durch zusätzliche Nährmittel ergänzt, kann dann als ein flüssiges ; _lf oder ein festes Kulturmedium verwendet werden. Wenn ein festes Kulturmedium gewünscht wird, wird ein Gelierungsmittel zugesetzt, um ein festes Kulturmedium zu erhalten, und das Medium wird mit einem geeigneten Mikroorganismus in Beruh-' V rung gebracht; der Mikroorganismus wird wachsen gelassen und der Mikroorganismus und/oder das gewünschte biologische Produkt werden isoliert. Bei Verwendung als ein fliüssiges Kulturmedium kann die ergänzte oder nicht ergänzte Feststofil- ' ; ;

fraktion entweder in Chargen- oder in kontinuierlichen Prozessen verwendet werden. Bei einem typischen CharRen- Verfahren wird die flüssige Peststoffraktion mit dem Mikroorganismus unter geeigneten Wachstumsbedingungen in Berührung gebracht und nach und nach in größere Behälter überführt (Abstufung). Der gewünschte Mikroorganismus oder die biologischen Produkte von den Mikroorganismen werden isoliert. Alternativ kann die flüssige Peststoffraktion in einem kontinuierlichen Verfahren verwendet werden, bei welchem der Mikroorganismus mit dem Medium in Berührung ge bracht und bis zu einer gewünschten Pelldichte wachsen gelassen wird. Das nährstoffhaltige Medium wird kontinuierlich in die Kultur flieftengelassen, während gleichzeitig verbrauchtes Nährmittel abgezogen wird. Das verbrauchte Mährmittel wird aufgefangen und die gewünschten biologischen Produkte werden daraus entfernt.

Geeignete deproteinierte Molkenlaktosepermeate (MLP) , die als Ausgangsmaterial verwendet werden können, sind im Handel erhältlich oder können nach Techniken zubereitet wer den, die dem Fachmann geläufig sind, und zwar entweder aus süßen oder sauren Meiereimolken, die von Hartkäse, z.B. Schweizer Käse oderMozarella, oder von Weichkäse, z.B. Quark, abstammen. Im Handel erhältliche Ausp-.anpsmaterialien, die mit Erfolg verwendet wurden, sind z.B. Laktosepermeate der Firma Foremost-McKesson, Inc. , die nach dem Verfahren gemäß US-PS 3.615 664 (Figuren 6, R und 9) erhalten wurden, sowie deproteinierte Molkensirupfeststoffe der Firma Express Food Company's (Figur 7).

Die laktosereichen Molkenpermeate, die als Aus^an^smate- rialien gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind im allgemeinen deproteiniert, beispielsweise durch Ultrafiltration oder durch andere Membrantrennunpcstechniken. Ihr Prozentgehalt an Feststoffen kann schwanken in Abhängig-

keit von der vorherigen Verarbeitung. Der Typ der Ultra- |

filtrationsausrüstung oder der Membran, die für die Zube- |

reitung des MLP-Ausgangsmaterials verwendet werden, ist f

nicht kritisch und es wurden beispielsweise vergleichbare f

Ergebnisse erzielt mit MLP-Präparaten, die mit hande^s- f

üblichen Abcor-Membranen (rohrförmige Zellulose- und f

Nicht-Zellulose-Membranen), DDS (De Danske Sukkerfabrikkerj- |

Membranen ( Polysulfon-und Zellulose-Flachmembranen), | Dorr-Oliver-Membranen (Polysulfon- und Zellulose-PjLattenmembranen) und Ladish-Membranen <Poiysulfon~ und Ze^lülose~ ·;

Spiralmembranen) als ültrafiltratiorisvorrichtunl; filtriert I

wurden. Da Membranen im allgemeinen einen Wolekularp;ewichts~ | abbruch von etwa 17 - 20 kdal (kilodaltons)■fUr das primäre Γ J

Permeat haben, ist es wichtig, daß die verwendeten Membra- I₁

nen keine Nadellochdefekte aufweisen, die zn Proteinlenks \

führen würden, da die Qualität der Endprodukte durch solche M

Materialien verschlechtert wird, übliche Arbeitsbedin^un^en j

für solche Ultrafiltrationsmembranen sind pH O - lit,. Tempe,- » | raturen von etwa 38 - 80° C und Drücke von etwa 60 - 1.^5 psi; l· I (4-10 kg/cm². V

Das MLP-Ausgangsmaterial, das entweder in sprühgetrockneter
Form vorliegt oder in einem Flüssigkeitsstrom mit einer
Konzentration von 5 - ¹IO % Gesamtfeststoffgehalt (Gew. Vol.)
erhalten wurde, wird entweder gelöst in oder verdünnt mit
Wasser oder eingedampft auf einen Feststoffgehalt von
2 - 20 %» vorzugsweise etwa 18 % Feststoff. Konzentrationen weit unterhalb dieses Bereichs können eine ..flüssige:;·;
Phase liefern, die einen unzureichenden Nährstoffgehalt
hat, um als Kulturmedium verwendet zu werden (obgleich W
saures MLP einen höheren Gehalt an assimilierbaren Stick- j
stoffquellen zu haben scheint, als süßes MLP)₅ während
Konzentrationen weit oberhalb dieses Bereiches manchmal ^
nicht in der Lage sein können, während der Verarbeitung
in Lösung zu bleiben, übermäßig hohe Konzentrationen oberr ;

- -. γ-■·*.·■ .■:·■■■■-

halb 20 - 25 % Peststoff erschweren auch die Entfernung der MLP-Komponenten, die bei der Behandlung in einem Autoklaven präzipitieren.

Diejenigen Komponenten, die hier kollektiv als mikrokristalline Trübefraktion bezeichnet werden, werden aus der MLP-Lösung ausgefällt, indem deren pH-Wert so weit angehoben wird, daß das Trübematerial präzipitiert. Dies wird im allgemeinen erreicht durch die Zugabe einer genügenden Menge einer nicht toxischen Lewis-Base, vorzugsweise einer anorganischen Base, wie z.B. eines Alkalimetallhydroxids und insbesondere von Ammoniumhydroxid (welches vorzugsweise in situ erzeugt wird, indem Ammoniakgas durch das verdünnte MLP geblasen wird, wobei es das relativ nicht-toxische Ammoniumion bildet), um den pH-Wert des verdünnten MLP auf etwa 8 - 10, vorzugsweise auf etwa pH 9 anzuheben. Das Material, das verwendet wird, um den pH-Wert des Permeats einzustellen, ist nicht kritisch, vorausgesetzt, daß es nicht toxisch ist oder keine toxischen Materialien bildet. Die erfindungsgemäßen Produkte können verwendet werden in Lebensmitteln, pharmazeutischen Produkten, kosmetischen Materialien und als Medien zur Züchtung von Mikroorganismen; daher sind die pH-Einstellungsmittel für solche Anwendungsgebiete auf solche Materialien beschränkt, die gegenüber Tieren und Mikroorganismen nicht toxisch sind. Nachdem der pH-Wert wie vorstehend beschrieben eingestellt worden ist, bildet sich ein mikrokristalliner Trübungsniederschlag. Die Temperatur, bei welcher der Präzipitationsschr:tt durchgeführt, wird, ist nicht besonders kritisch. Zweckmäßigerweise werden Temperaturen im Bereich von 20 - 50° C angewendet.

Die Zunahme im pH-Wert des verdünnten MLP führt zur Präzipi- tation der mikrokristallinen Trübefraktion, wobei optimale Ausbeuten gewöhnlich bei etwa pH 9 erzielt werden. Der opti-

male pH-Wert zur Gewinnung der gesamten Trübefraktion
kann bestimmt werden, indem aliquote Teile der MLP-Lösung
in einem Autoklaven behandelt werden, nachdem der pH-Wert

der Lösung auf ausgewählte Werte innerhalb des Bereichs h

von 8 - 10 erhöht und die dabei gebildete Trübefraktion 1

abgetrennt wird. Wenn ein zu hoher oder ein zu niedriger c

pH-Wert verwendet wird, werden bei der nachfolgenden Auto- ν

klavenbehandlung der Gelöststoffe wolkige und/oder |,

dunkel gefärbte Lösungen erhalten. |;

Der Niederschlag wird von dem Kulturmedium physikalisch .: fe

abgetrennt, z.B. durch Zentrifugierunp bei 11.750 g und f¹

Filtration durch eine Membran mit 0,45/U Porengröße, oder f,

durch Ultrafiltration durch eine Ausschlußmembran für f

20 - 100 kdal Molekulargewicht, im allgemeinen 10 - 50 kdal |

und vorzugsweise 20 - 30 kdal, und wird aufbewahrt zur Ver- *l

wendung als ein Emulgierungs- oder Suspendierungsmittel. |

wie nachstehend erläutert wird. Zentrifugierung allein ohne *| nachfolgende Filtration ist im allgemeinen nicht zufrieden- . |

stellend, weil das klare überstehende bei der nachfolgenden -jp

Autoklavenbehandlung häufig trüb wird, wodurch seine Ver- f

wendbarkeit als ein Kulturmedium begrenzt wird. Ultrafil- |

tration durch eine Membran von kleinerer Porengröße, bei- |

■ ' '' ■ I

spielsweise. 10 kdal, ist nicht zufriedpnnt.ol lend . weil dan ' .\.

entstandene Kulturmedium zu geringem Wachstum führt im S

Vergleich zu einem Medium, welches durch eine Membran für. |

20 kdal oder größere Porengröße filtriert worden ist. nie \

Trübefraktion kann getrocknet und als ein Emulgierungs- oder I

Gelierungsmittel auf verschiedenen Anwendungsgebieten ver- \

wendet werden, wie weiter unten beschrieben wird. I

Die Gelöststoffraktion kann in einem Autoklaven sterilisiert
oder einer sterilen Filtration (vorzugsweise in pH-Bereich
von etwa 6,8 - 7,1) unterworfen werden und kann als Kultur-

medium für das Wachstum von Mikroorganismen verwendet werden. Die Gelöststoffraktion enthält wertvolle Mengen an assimilierbarem Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und an- deren Nährstoffen, einschließlich der Zucker;Laktose, Sucrose, Galaktose und Glukose. Die hauptsächliche Kohlen- ; stoffquelle ist die in dem Ausgangs-MLP enthaltene Laktose. Der in einem nicht ergänzten Medium mit. 3,5 % Feststoffen nach Autoklavenbehandlung bei 121° C/15 psi (1,05 kg/cm") zur Verfügung stehende Zucker besteht typischerweise aus: 53,0 % ß-Laktose (11,8 mg/ml); HH,8 % oC -Laktose + Sukrose (9,97 mg/ml); 1,2 % Galaktose (0,2? mr,/ml) ·, und 1,0 H Glukose ( 0,23 mg/ml).

Es wurde gefunden, daß MLP, obgleich im wesentlichen proteinfrei, im allgemeinen adäquate Mengen an unwandelbarem Stickstoff in Form von freien Aminosäuren und niedermolekularen Polypeptiden enthält. Deshalb besteht erfindungsgemäß nicht die Notwendigkeit, separate Proteine zu hydrolysieren, um den Gehalt an assimilierbarem Stickstoff zu erhöhen, wie es in der SU-PS 819 166 beschrieben ist; in ,jedem Falle wurden die meisten Proteine bereits während des Ultrafil trationsprozesses entfernt und sind nicht als Bestandteil des MLP-Ausgangsmaterials verfügbar. Wenn eine Ergänzung der Stickstoffquellen gewünscht wird, kann dies erreicht werden durch-Zugabe von herkömmlichen Stickstoffquellen,

jt einschließlich Hefeextrakten und Peptonen aus üblicherweise

/; erhältlichen tierischen und pflanzlichen Proteinen, wie

*· Kasein und Soja. Andere Zucker, wie Glukose, und Pufferst mittel,- Cofaktoren usw. können nötigenfalls zugesetzt wer-

den, um das Wachstum des ausgewählten Mikroorganismus zu

fördern. Der Fachmann auf dem Gebiete der Mikroorganismen- kulturen findet leicht irgendwelche nötigen Nährstoffer- gänzungen, Puffermittel (d.h. den optimalen pH-Bereich, in

f welchem der Organismus lebensfähig ist) und andere Bedingun-

ϊ gen, die notwendig sind, um diesen bestimmten gewünschten

> Mikroorganismus wachsen zu lassen.

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Die Gelöststoff fraktion der vorliegenden Erfindung ist |

sowohl brauchbar in großtechnischen Prozessen wie auch als |

Ausgangsmaterial für die Zubereitung von verschiedenen f mikrobiologischen Kulturmedium, die für klinisch-diagnostische Testmethoden brauchbar sind. Für die Verwendung von
Mikroorganismen, die normalerweise Laktose nicht umwandeln,
oder für die Verwendung in klinischen Reihenversuchen, bei
denen solche Organismen betroffen sind, kann der Gehalt

des Mediums an umw.andelbarem Kohlenstoff durch die Zugabe >

von Glukose verstärkt werden, im allgemeinen auf eine Gesamt- ■'\\

konzentration von etwa 0,5 mg/ml. !

Die Gelöststofffraktion kann dazu verwendet werden, um ein j!

festes oder flüssiges Kulturmedium von klinischer Qualität, ^

ein flüssiges oder festes aerobes Kulturmedium, ein flHssi- b

ges oder festes anaerobes Kulturmedium, ein allgemeines ;■· ■ *|

industrielles Fermentationsmedium, ein Fermentationsmedi.um \j

für die Produktion von Antibiotika, ein Medium-für 'die *|

Herstellung von Käse und dergleichen zuzubereiten. |

Ein beispielhaftes aerobes Allzweckmedium getniiß der vor- : |

liegenden Erfindung besteht aus einer wässrigen Zusammen- ' |

Setzung, die durch Hefeextrakt, Aminosiluren und Glukose in ί

folgenden Anteilen ergänzt ist: |

Klare Gelöststoffraktion mit 3,5 % Feststoffgehalt, |

Hefeextrakt (Amber 510) 0,05 %, |

Aminosäuregemisch (US Riochemicals) 0,5 % _t ■■ |

Glukose ( USP-Qualität) 0,05 %. \

Dieses ergänzte Kulturmedium hat eine Proteinanalyse (Lowry- j

Proteingehalt), die niedriger ist als die von herkömmlichen f

Nährbrühen, wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt ist; j

deshalb ist nicht zu erwarten, daß das ergänzte Medium ge- j maß der vorliegenden Erfindung brauchbar wäre, um das Wachs-

turn von Mikroorganismen zu unterhalten. Eine typische Aminosäureanalyse ist in Tabelle 2 wiedergegeben. Die in den Tabellen 1 - k wiedergegebenen Daten sind repräsentativ für das mikrobiologische Allzweckkulturmedium von Beispiel 1, das ergänzt worden ist durch 0,5 % Casaminosäuren, 0,05 % Hefeextrakt und 0,05 % Glukose.

Tabelle 1. ' Lowry Protein Analyse

Medium mg/ml Protein

BBL-Nährbrühe «1,8

Difco Penassay-Brühe 3,8

MLP-Medium, ergänzt 1,?

Magermilch 30.0.

Man erkennt an der nachstehenden Aminosäureanalyse der vorstehend beschriebenen, ergänzten Gelöststoff fraktion, daS sie einen adäquaten Bereich von Aminosäuren enthält, um Mikroorganismenwachstum zu unterhalten. Sollte jedoch für eine besondere Anwendung eine ungewöhnliche Menge einer bestimmten Aminosäure erforderlich sein, wie sie für das Wachstum von Mikroorganismen benötigt wird, bei denen es im genetischen Mechanismus für die Bildung einer bestimmten Aminosäure mangelt, kann das Medium entsprechend ergänzt werden.

Ungefähre u-Mole/ml	ι
3,89	■■I
1,05	■■■■■■ :!
2,63	!
9,45
1,91	6·' : i
0,93	■ ■■■ f
1,88	■' ft
3,38	.';:■■ j.
3,09 ;	■ V :' . !
1 ,OR	I
1,46	■■■ :■ 'j
4,56	J
1,90	ι ■ ' 'i

Tabelle 2
Typische Aminosäureanalyse eines ergänzten MLP-Mediums

Aminosäure

Alanin Arginin Asparaginsäure Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Serin Threonin

Valin '⁷S₈ 45 !

Das ergänzte MLP-Medium weist eine gute Pufferkapazität (■

gegenüber sowohl Säure- als auch Basezugaben auf, wie in ' | den Tabellen 3 und 4 gezeigt wird. Dies ist eine unerwartete | und vorteilhafte Eigenschaft, weil die meisten Mikroorganis- |

■ ■ ■ ■ ■ ' -. ■ ■ I-

men nur innerhalb eines begrenzten pH-Bereiches 'iberleben.

Die vorliegende ergänzte Gelöststoff fraktion zeigt eine Pufferkapazität, die vergleichbar ist mit der von herkömmlichen
Nährbrühen ohne Zugabe von Puffermitteln.

Tabelle 3 Säurepufferkapazität

pH-Wert nach aufeinanderfolgenden Zugaben
(0,1 ml) von IN HCl zu 25 ml Brühe.

Medium Ol 2 J5 _4 5

Difco Penassay-

Brühe 6,92 6,64 6,34 5,96 5,2* H, 17

MLP-Medium (ergänzt) 6,82 5,59 4,66 4,14 3,73 3,32

BBL-Nährbrühe 6,80 4,38 3,5* 3,04 ?/,0 2,31.

■····■■ 4 ft W ,-··■♦■

Λ7

Tabelle M

Basenpuf ferkapazität

pH-Wert nach aufeinanderfolgenden Zugaben (0,1 ml) von IN

NaOH zu 25 ml Brühe.

Medium 0 l 2_ τ Il

Difco Penassay 6,93 6,93 6,96 6,Q9 7,02 7,05 MLP-Medium

(ergänzt) · 6,80 6,93 7,0*1 7,17 7, M 7,'I5

BBL-Nährbrühe 6,7*» 6,99 7,19 7,37 7,55 7Jl.

Das ergänzte MLP-Medium kann entweder in flüssiger Form zu bereitet oder sprühgetrocknet werden, vorzugsweise auf einen Wassergehalt von weniger als 10 Gew.-?, z.B. etwa 6 Gew.- % für bessere Lagerfähigkeit. Wenn eine flüssige Br"he zube reitet wird, können beliebige Ergänzungsstoffe zugesetzt werden, bevor bei 121° für eine Dauer von 15 - 20 Minuten in einem Autoklaven gearbeitet wird. Auf diese Weise können verschiedene Typen von Kulturmedien leicht aus der unerg^nz- ten MLP- C^löststofffraktion zubereitet werden. Folgend«* Medien werden bevorzugt:

1.) Ein Allzweck-Wachstumsmedium aus Gelöststoffphase, vorzugsweise ergänzt durch etwa 0,25 - 0,5 f< Casaminosiuren, 0,05 % Hefeextrakt und 0,05 % Glukose, welches sehr günstig erscheint im Vergleich zu weit verbreiteten, allgemeinen Nährbrühen, z.B. Difco Penassay-Priihe, Oxoid Lablemco-Brühe und Nährbrühe Nr. 2, sowie BBL-Nährbrühe;

2.) Ein primäres Isolierungsmedium (PIM) für die Kultivierung sowohl von aeroben als auch anaeroben Mikroorga nismen aus primären klinischen Proben. Dieses Material wird häufig ergänzt durch 0,25 - 0,5 % CasaminosSuren, 0,5 % Hefeextrakt, 0,H - 0,5'* Glukose, 0,1 % Apr.ar oder ein anderes Gelierungsmittel, um die .Sauerstoffdiffusion zu verringern, sowie 0,05 % Cystein/HCl als Redactions-

mittel. Wenn dieses Medium von klinischer Qua.] it"t vor dem Gebrauch gekocht wird, um den Sauerstoffgehalt zu verringern, dann zeigt es vorteilhafte Eigenschaften im Vergleich zu den weit verbreiteten Thioglyeolat-Brühen;

3.) Ein vorreduziertes, steriles, anaerob zubereitetes Medium für die Kultivierung von fakultativen und obligaten anaeroben Mikroorganismen, das vorzugsweise ergänzt ist durch 0,25 - 0,5 % Casamino-Sfluren, 1 *. Hefeextrakt, 0,5 % Glukose und 0,01 % Resazurin als Ox idations-/Reduktions-Indikator. Das letztere Medium wird unter einer Stί ckstoffatmosnhiire etwa 10 Minuten gekocht, und dann durch 0,2 % Cystein-HCl, 0,50 mr/ml Kamin, 1 mg/ml Vitamin K, ergänzt und auf pH 7,B mit Ammoniumhydroxyd eingestellt, bevor es unter einer Stickstoffatmosphäre gelagert wird. Um Röhrchen aus vorreduziertem Agarmedium zuzubereiten, wird zunächst Agar zu den Röhrchen gegeben, bis die gewünschte F.ndkonzentration erhalten ist und dann wird vor vorreduziertes Brühenmedium zu dem Agar in den Röhrchen zuere-,..'·'· setzt. Nach Autoklavenbehandlung bei 121° 0 und 15 psi (1,05 kg/cm ) für die Dauer von 20 Minuten wird der restliche feste Agar in Lösung gebracht, indem die Röhrchen mehrere Male umgestülpt werden. Di γτ-,ηγ' f-rdium hnt ein Oxidations-ZReduktions-Potentin1 von -150 mV oder darunter, und der colorimetrirsche Redoxindi kntor f^?i.rbt sich rosa bei Oxidation des Mediums;

U.) Ein industrielles Fermentationsmedium, entweder in flüs- _i siger oder in fester Form, z.B. enthaltend eine Gelöststoff fraktion, die auf 3,5 % Feststoffgehalt verdünnt und mit etwa 0,25 % Amber, 510 Brauhefeextrakt erg*^!n7,t worden ist. Für das feste Medium kann jedes beliebige herkömmliche Gelierungsmittel zugesetzt werden, z.B. 1,5 % Agar. Eine typische Analyse für solch ein industrielles Fermentationsmedium !sieht wie folgt aus: ;

	12.10	5	0.8	• ■ ι . ■■ · ·. . . ·.··, ».·■. ,■ a	.'·.' " . . :
'•'■■-;;.:-' ■'■■'■' ■ ■', ■ ■ ■ '■ .·. ''' ■'.','. ■ ' ■ ".	3.5	0.7	• · · . · ·· ■ *.· * · « · . * ·»» « ··	* ■ ' " . "■ # W • β ♦ w
'•■'"■;:·*■:'■' ■ .'■· ..·.'.■.■■: ' : .·■'...■ :; ■ ..;- ■;.·'.'·■■' ■ '	O .0	81.5		3390215
ΐ 5: Typische Analyse:	<1 ,0	Spur	Vitamine (mg/100 gin)
Protein, Kjeldahl			B1	0.30
(Prozent N χ 6.32)	B 1.5			16.60
Protein, Lowry		100 g)	Niacin	21.70
Prozent Fett	6.5	16O	Spurenelemente: (mg/	100 gni)
Prozent Asche		30	Aluminium	<o.yo6
	0.63	380	Barium	C). I/.' I
Prozent Kohlehydrat		230	Bor	O.'.i'iP.
		100	Calcium	26.:>1
Prozent Feuchtigkeit	2k. 5	190	Chrom	<o. ι:.·ι
		270	Kupfer	<o.Io ι
Schüttgewicht, gm/cc	270	Eisen	0. Io I
	90	Magnesium	3 Ί . 97
Löslichkeit in Η_0,	180	Mangan	0.060
gm/iOO ml 300C	150	Phosphor	3111 . r>6
	ko	Natrium	■330. 1Ί
Zuckerprofil (Prozent)	170	Strontium	0.7;'/;
Galactose	180	Zink	C).()ü'i
Glucose
Ι, Lactose	Mikr obio l.ogi e:
; Sucrose
! .■■■■.. : ' ·	CFU	220/fein
I.'''. .	Coliform	negativ
>■■-■'.■ \ Aminosäureprofils (mg/	Partikel g.r ö ü ο:
I Arginin	85 Prozent passieren	Ty1LOi- 270-
* Cystin		'. J i oh
ϊ Glutaminsäure
\ Glycin	pH nach Autokl.av-Ilolia	.iKl.Luni';:
\ " ■ Histidin
■'■ Isoleucin	6.5 (3 Prov.iiiil. (lusrunt	. r->s Ls I (.) IT-
ί Leucin		;■'■! 1:1 i I )
j Lysin
·} Methionin
; Phenylalanin
I Threonin
ji Tryptophan
I Tyrosin
\ ■·■; ■';■■. ■ ■ Valin . .-. ) ■ ■ I ■ ■

Die vorstehend beschriebene, industrielle Fermentations- |, rezeptur unterhält das Wachstum von folgenden industriell |; wichtigen Organismen: <

Streptomyces griseus - produziert Streptomycin i;

(erkennbare Mengen inner- |;

halb von ?J\ Std.) und Pronase |f

Penicillium notat.um produziert Penicillin (erkenn- . f\

bare Mengen innerhalb von |

2H Std.)" f_:

Saccaromyces cerevisiae produziert Ethanol j,

Asperg;illus niger produziert Zitronensäure.

5.) Industrielle Fermentationsmedien mit erhöhtem Glukosegehalt. Ein solches Medium besteht aus einer ffelöststofffraktion, die auf 2,0 % Feststoffgehalt verdünnt und mit 0,25 % Amber, 510-Hefeextrakt und 1,0 % Dextrose orrMnzt.-worden ist. Ein anderes derartiges Medium besteht aus einer Gelöststofffraktion , die durch einen immobilisierten ; Laktosereaktor geleitet, auf 3,0 % Feststoffgehalt verdünnt und mit 0,25 % Amber, 510-Hefeextrakt ergänzt worden ist. Die Verweilzeit der Gelöststoff fraktion ^{in dem} Reaktor wird in Verbindung mit dem pH-Wert und der T-feaktionstemperatur dazu benutzt, um die Dextrose-Fndkonzentration dieses Mediums zu steuern.

Man erkennt somit, daß die Gelöststoff fraktion entweder in ergänzter oder in nicht ergänzter Form dazu vorwendet werden kann, um Antibiotika wie Streptomycin und Penicillin zu produzieren. Außerdem kann d i e Gelöststoff fraktion penMfV ' der vorliegenden Erfindung als ein Starter-Kulturwachs- . tumsmedium, beispielsweise bei der biologischen Produktion von Hart- und Weichkäse verwendet werden.

— » ^ — W ν ν ν V V « W % ^ ^r

y/ί » -

Die optische Klarheit einer Kulturbrühe ist zwar relativ unbedeutend für die Verwendung in bestimmten industriellen Fermentationsprozessen, ist jedoch höchst wichtip bei klinischen Anwendungen. Zu diesem Zwecke ist es ratsam, Probemengen von Zusätzen, die verwendet werden sollen, zu sieben, da es sich in einigen Fällen herausgestellt hat, daß bestimmte Proben nicht das gewünschte klare Produkt liefern. Bei hohen Hefeextraktkonzentrationen von etwa..--1 % haben sich Amberex 510, ein wasser!?':» "lieber autolysierter Hefeextrakt von der Firma Amber Laboratories,!nc.. und Nestle-Hefeextrakte von der Firma BBL Microbiology Division of Becton, Dickinson and Co. als zufriedenstellend erwiesen. Aminosäurezusätze von Difco Laboratories, Inc. U.S. Biochemical Corp., und Marcor Development Corp. sind gleichermaßen zufriedenstellend zur Verwendung in don vorstehenden Prozessen.

Für die Verwendung als ein flüssiges Kulturmedium kann die durch das erfindungsgemäfte Verfahren erhaltene Gelöststofffraktion nach herkömmlichen Methoden, beispielsweise durch Sterilfiltration oder Autoklavenbehandlunr;,sterilisiert werden. Sobald sie einmal autoklavenbehandelt ist, sollte das sterile Medium nicht erneut autoklavenbehandelt werden, weil dies zu einer Reduktion im mikrobiellen Wachstumspotential führt. Wenn Sterilfiltration allein angewandt wird, im allgemeinen durch einen 0,?2 .u-Filter, ist es erforderlich, den pH-Wert der Brühe durch Zugabe einer geeigneten nicht toxischen f-.'iure, wie. HOi, au f\ etwa 6,8 bis 7,1 zu reduzieren. Dies kann entweder vor oder nach Filtration bewerkstelligt werden, muß jedoch in .jedem Falle vor der Verwendung geschehen. F.s hat sich herausgestellt, daß die Sterilisierung von flüssigen Kulturmediumdurch Autoklavenbehandlung den pH-Wert des Mediums von etwa pH9 auf den gewünschten Wert von selbst reduziert, und aus diesem Grunde wird die Einstellung des AnfanKspH-Werts auf pH 9 zusammen mit Autoklavenbehandlunp bevorzugt. Die Gründe hierfür sind nicht ganz bekannt, können

jedoch darin liegen, daß Polypeptide oder andere organische Pufferbestandteile des Mediums durch die Hitze bei der Autoklavenbehandlung zersetzt werden.

Die nicht ergänzte GelÖststoffraktn. gemäß der vorliegenden Erfindung kann nicht nur als eine Brühe verwendet werden, sondern kann auch zu festen oder halbfesten Platten oder Schrägröhrchen verarbeitet werden, indem ein Gelierungsmittel zugesetzt wird, wie z.B. Agar, Carrageenan. Pectin, Silicongel, Guar-Gummi, Locust-Bohnen-Gumni , verschiedene gelierbare Polysaccharide, wie dies dem Fachmann geläufig ist. Diese Gelierungsmittel können mit oder ohne wei.t.or.o Zusatzstoffe verwendet werden, wie beispielsweise defibriniertes Schaf- oder Pferdeblut, Proteine, T.ackmus usw., um Kulturmedien zu bilden, die geeignet sind, als Rlutagar,. Proteasetestagar, Lackmusagar usw. Das flüssige ^wedi.um beispielsweise wird leicht hergestellt in Form von Gießplatten durch Zugabe von 1,5 % (Gew./Vol.) Agar. Im allgemeinen· kann das nicht ergänzte Gelöststoff -Kulturmedium der vorliegenden Erfindung nach Delieben modifiziert werden durch Zugabe einer Vielzahl von Ergänzungsstoffen, in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Endzweck; wie z.B. den Abschnitt über Medien auf den Seiten 601 bis 6s6 des American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 15th Edition (1982).

Alternativ kann die Gelöststoff fraktion zu einem Pulver sprühgetrocknet werden, um die Lagerbestindigkeit zu erhöhen und Transportkosten zu verringern . Da die Gelöststoff fraktion für die Sprühtrocknung in konzentrierter Form vorliegen muß, werden MLP-Ausgangsmaterialien mit Konzentrationen über 3,5 %_t wie sie allgemein für flüssige Medien verwendet werden, bevorzugt, und Konzentrationen bis zu 20 % haben sich als zufriedenstellend erwiesen. Wenn der Peststoffgehalt des MLP-Ausgangsmaterial3 sich 30 % n?ihert , kann er. sich zeigen, daß ein Teil des Fest3toffmaterials suspendiert

bleibt und durch pH-Einstellung nicht präzipitiert wird. Sprühtrocknung von Medien, die Ergänzungsstoffe wie 0,05$ Hefeextrakt und/oder 0,25 bis 0,5 % Casaminosäuren enthalten, kann leicht durchgeführt werden. Sprühtrocknung von nicht ergänzten Gelöststofffraktion erfordert im allgemeinen eine trockenere Luft, damit das Fehlen von Keimpartikeln in den Ergänzungsstoffen ausgeglichen wird, die rasch trocknen und einen Keim bilden, an dem der Rest der Materialien antr.ocknen kann. Die Verwendung eines tragbaren Allzweck-Sprühtrockners, wie er von der Niro Atomizer, Inc., hergestellt wird, ist zufriedenstellend bei einer Temperatur von etwa 200° C und einer Austrittsschachttemperatur von etwa 80° C. Unter Anwendung solcher Bedingungen wird der Feuchtigkeitsgehalt in dem ergänzten Medium auf etwa 6 56 reduziert.

Wie man sieht, können die Kulturmedien gemäß der vorliegenden Erfindung bei der fermentativen Erzeugung von Antibiotika, Enzymen, organischen Säuren, Alkoholen und Ketonen verwendet werden und können auch als Starter-Kulturwachstumsmedium eingesetzt werden, z.B. bei der biologischen Produktion von Hart- und Weichkäse, wie Amerikal· nischer Käse, Schweizer Käse, Italienischer Käse, Cheddar

> Käse, Mozarella und Schichtkäse. Diese MLP-Medien sind

ι deutlich verschieden von Käsestarterkulturen aus franzer

j Molke, wie sie unter anderem in den US-Patenten 3 998 700;

j 4 ©20 l85; k 115 199; M 282 255 beschrieben sind.

; Die mikrokristalline Trübefraktion, die bei einem alkali-

sehen pH, vorzugsweise bei etwa pH 9, ausgefällt und von

dem Kulturmedium durch Zentrifugierung oder Ultrafiltration durch eine 20 - 100 kdal-Membran abgetrennt wird, wird im allgemeinen als ein wasserhaltiges körniges Material gewonnen, welches bei M⁰ C die Konsistenz von KiJrzungsfetten hat und beim Erwärmen auf Zimmertemperatur mehr frei fließend wird. Wenn es getrocknet ist, ist das

Präzipitat ein geschmackloses, geruchloses, kalkig-weißes, ;

frei fließendes Pulver; typischerweise werden etwa 15 7 (

der Ausgangs-MLP-Feststoffe, die verarbeitet werden, als \

ein solches getrocknetes Ausfällungspulver gewonnen. Ii

Dieses Präzipitat unterscheidet sich in seiner Natur von ;:

Molkenpermeatpräzipitaten, über die andere Wissenschaftler '

berichtet haben. Im Unterschied zu den oberflächlich iihn- j

liehen Materialien, über die in den US-Patenten Ί 1'Π IT¹I I

und 4 209 503 berichtet wird, ist die mikrokristalline I.

Trübefraktion gemäß der vorliegenden Erfindung in Petrol- f

äther unlöslich, wie Tabelle 5 zeigt. Die physikalischen Ϊ,

Merkmale der mikrokristallinen Trübefraktion dieser Erfin- _r

dung sind in kritischer Weise abhängig von der Form, in ju

welcher das Präzipitat gewonnen wird. Wenn es als konzen- .,[■'

trierte Flüssigkeit gewonnen wird, bildet es in Wasser ein \,

Gel und ist nicht mischbar mit Petroläther. Wenn es zu ^!:_:

einer Raste weiter eingeengt wird, wird die.mikrokristalli- ν ne Trübefraktion sowohl in Wasser als auoh in Petrolttther
unlöslich. Sobald es getrocknet ist, z.B. auf etwa 6 %

Feuchtigkeitsgehalt, ist die mikrokristalline Trübefraktion ^:

nur vorübergehend in Wasser suspendierbar., ist ,jedoch im- _r mer unlöslich in Petroläther.

Tabelle 5

■ Löslichkeit der Trübefraktion

Lösungsmittel Löslichkeit

Konzentrierte Trübefraktion
( Körner):

Ethylacetat

Benzol

Toluol

Chloroform Petroläther Methanol Ethanol Propanol

Butanol geringe Suspension

IN HCl trübe Suspension

IN NaOH " "

unlöslich, Il	nicht dispensierende Paste Il Il 1; '.	ti	ti ' .
Il	ft	H	ti :
Il	ti	It
It	I'	Suspension I!
sehr trübe ti Il	Il
H ti

Getrocknete Trübefraktion

Wasser, 5 % Peststoffe geringe Suspension

Wasser, 10 % Peststoffe geringe Suspension

Wasser, 20 % Peststoffe geringe Suspension

Petroläther, 5 % Peststoffe unlösliche Partikel

Petroläther, 10 % Feststoffe unlösliche Partikel

Petroläther, 20 % Peststoffe unlösliche Partikel.

Untersucht man sie chemisch nach der ICP-Analyse, dann unterscheidet sich die mikrokristalline Trübefraktion dieser Erfindung auch deutlich in ihrer Natur sowohl von nicht verarbeiteter, sprühgetrockneter HLP als auch von dem Präzipitat, das sich bildet, wenn sprühgetrocknetes MLP auf eine Konzentration von 20 % (new./Vol.) resus- . pendiert und 72 Stunden bei '1° C gekühlt wird, wi" ''',-ibrllp 6 zeigt. Die gezeigten Werte betreffen die gleiche Aus-■ gangsmaterialprobe, die eine maximale Wasserlöslichkeit bei Zimmertemperatur von etwa 20 % und einen normalen pH-Wert bei dieser Konzentration von 5,5 - 6,0 hntte-und die weniger als 1 mg/100 g Kohlehydrate und im wesentlichen kein Protein oder Fett enthielt. Die Daten wurden erhalten durch ICP-Analyse gemftß der Industrially Coupled P las ma-Atomic Emission Spectroscopy-Methode ~*>. 005 der American Organization of Analytical Chemists, und die Werte wurden verglichen mit denen einer Probe_, die .gemäß US-PS H 202 909 erhalten wurde, wobei nur auf l'IO - ISO⁰F (60 - 66° C) erhitzt wurde. Alle Proben wurden zubereitet, indem 20 liges (Gew./VbI.), sprühgetrocknetes MLP in.Wasser resuspendiert wurde, bevor es individuell verarbeitet wurde.

Tabelle 6

	Trübe fr i:	348.	-438	5,392.	65	iktion	59	Prä'zi o.i	I: 1 i-, 7 ' '
	mg/100 f; Feststoffe	0.	1 1-.12	6.	8	(Trockonbasiy)		7,934.
ICP-Analyse	Alkali- Sprühgetrocknete MLP Präzipitat	488.	-491	782.		!■' a 11 pr ti z i ρ i ~ tat; 40c, 72 ii		Ί.	77
! einer	CaIcium	150.		5,733.	79	15,	42	4,07r..
Eisen	0.	06-.08	0.	75		79	5VS.	:>.
Phosphor	0.	025	0.	6	11,		1 .	Ύ)
Magnesium	774.	-863	461.	48	2,	57	0.	37
Zink	0.	036-.037	0.	96		66	600.	9
Kupfer	1 .	1-1.3	52.	82		57	. 0.	50
Natrium	0.	025-.028	0.	54		60	6.	50
Chrom	0.	11-.22	1 .	70		631	0.	57
Aluminium	0.	06-.07	3.	,21		21	3.	lh
Barium	0.	005-.011	0.			0.	38
Strontium				0.
Bor
Mangan
,800.
6.
,448.
r37O.
3.
0.
7 1 8.
1 .
15.
0.
6.
0.
0.

Durch Bestimmung des Zeta-Po ton tial s als Funktion <l(!.s i>H-Woit s für die mikrokristalline Trübefraktion, die aus un fcorsch i ml I i clion Quellen für Ausgangsmaterialien gemäß- der Erfindung hor/jos U> U I wurden, können geeignete pH-Bereiche ermittelt werden, in domm stabile Emulsionen oder Kolloide gebildet werden können. Da dor Ladungs-Nullpunkt dem pH-Wert entspricht, bei dem die suspendierten Materialien am wenigsten stabil sind (nicht unähnlich dem isoelektrischen Punkt oder Pi für Proteine), werden solche pH-Werte allgemein bevorzugt, die ein Zeta-Potential von mindestens 5 mv geben, wobei die größeren Abweichungen vom Ladungs-Null punkt im allgemeinen zur größten Stabilität führen. Im sauren Bereich jedoch kann eine derart hohe Azidität eine Zersetzung der in der mikrokristallinen Trübefraktion enthaltenen Polypeptidkoniponenten bewirken.

Unter Berücksichtigung dieser einzigartigen Löslichkeitseigenschaften kann eine luftgetrocknete mikrokristalline Trübefraktion gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von industriellen Anwendungsgebieten eingesetzt werden, z.B. als'Nahrungsmittelemulgator oder als Suspendierungsmittel für pharmazeutische, kosmetische und Lebensmittelprodukte, wie sie allgemein bekannt sind.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung . ohne jedoch ihren Rahmen einzugrenzen. In diesen Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben und, sofern nichts anderes gesagt ist, beziehen sich alle Menren und Prozentangaben auf das Gesicht.

Beispiel 1 Zubereitung einer und einer Trübefraktion

7 g MLP (bezogen von Express Poods Co. und ähnlich den Produkten, die im Handel erhältlich sind, von Foremost McKesson, Inc. und anderen Quellen) wurden su 200 ml entsalztem Wasser (3,5 % Peststoffgehalt, Gew. Vol.) gegeben. Das Gemisch wurde einire Minuten gerührt da ein Teil der Peststoffe dazu neigt, aus der Lfisunp: auszufallen, wenn das Gemisch nicht gerührt wird. Der pH-Wert wurde von ursprünglich 6,09 auf 8,99 angehoben, indem 1',1S ml 5,5 N NH₁₁OH unter Rühren zugegeben wurden; danach wurde 10 Minuten bei 8500 Upm (11.800 g) in einer Sorvall RC-58-Zentrifuge unter Verwendung eines GSΑ-Rotors, der auf 4° C gekühlt war, zentrifugiert. 1,26 g einer weichen, weißen mikrokristallinen Trübefraktion wurden pro 100 ml Ausgangslösung erhalten. Das überstehende wurde durch eine Nalgen-Piltriereinheit (0,45/U, 115 ml) gegossen, wobei 200 ml klares Material erhalten wurden, das einen pH-Wert

* β

νοη 9,04 aufwies. Nach Autoklavenbehandlung bei 121°0/ 15 psi (1,05 kg/cm ) für die Dauer von 20 Minuten wurde ein matt orangefarbenes und kristallklares, nicht ergänztes Kulturmedium erhalten, das einen End-pH-Wert von 7,07 aufwies.

Zur Kontrolle wurde dieses Verfahren wiederholt, wobei ganze Molke als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Der Anfangs -pH- Wert betrug 6,26, und 2,*J ml NH₁₁OH wurden zugesetzt, um den pH-Wert auf 8,98 zu bringen. Nach Zentrifugierung wurden 1,08 g eines harten, hellbraunen körnigen Materials aus 100 ml Ausgangsmaterial erhalten. Das Supernat war nicht klar, sondern enthielt flockiges schwebendes Material. Nur etwa 25 ml des Supernats konnten durch die Filtereinheit geschickt werden, bis diese verstopfte und der Filter ausgewechselt werden mußte. Nach der Filtration war das Supernat immer noch trübe und hatte einen pH-Wert von 8,98. Nach Autoklavenbehandlung wurde eine matt orangefarbene, trübe Flüssigkeit mit einem pH-Wert von 7,08 erhalten.

Beispiel 2

Zubereitung eines ergänzten Kulturmediums ^aus saurer Molkenfeststoffraktion.

Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 wurde ein mikrobiologisches Kulturmedium aus sauren Molken zubereitet, die ein Anfangs-pH von ^,^5 hatten und die bei der Quarkproduktion bei Giant Food, Inc. in Lanham, Maryland, anfielen. Die ganze saure Molke wurde durch ein 30 kdal Dorr-Oliver-Filter ultrafiltriert, wobei ein primäres Retentat und ein primäres Permeat gebildet wurden. Der pH-Wert des primären Permeats wurde mit MF₁^OH auf pH 9 eingestellt und der Ultrafiltrationsprozeß wurde wiederholt/

was eine sekundäre mikrokristalline Trübefraktion und ein sekundäres Permeat lieferte. Das sekundäre Permeat wurde ergänzt mit 0,25 % Casaminosä'uren, 0,05 % Hefe extrakt und 0,05 % Glukost, bevor es für 20 Minuten bei 121°C/15 psi (1,05 kg/cm²) autoklavbehandelt wurde. Das gebildete (autoklavbehandelte) Kulturmedium war klar und hatte eine goldene Farbe, bei einem pH-Wert von 8,1S.

Beispiel 3 Auefällung mit anderen Basen.

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei je doch KOH dazu verwendet wurde, um den pH-Wert einzustellen. Ausgehend von einem Anfangs-pH-Wert von 6,09 wurden 0,2 ml 6N KOH und 0,2 ml IN KOH zugesetzt, um den.pH-Wert auf 8,92 zu bringen. 1,66 g Trübefraktion wurden als wei ches, weißes körniges Material pro 100 ml Ausganprsmaterial erhalten. Nach Filtration war das Supernat klar und hatte einen pH-Wert von 8,78. Nach Autoklavenbehandlunp· war die Flüssigkeit goldfarben und sehr schwach trüb bei einem End-pH-Wert von 6,25.

Wenn bei dem Verfahren von Beispiel i statt NH_J(OH NaOH verwendet wurde, wurde der Ausganp;s-pH-Wert von 6,08 durch Zugabe von 0,^5 ml 3 N NaOH auf '8,90.. angehoben. . Zentrifugierung lieferte pro 100 ml'Ausgangsmaterial 1,62 ι mikrokristalline Trübefraktion als einen weichen weißen Kuchen. Nach Ultrafiltration durch eine 0,^5_/u-Membran war das Supernat klar und hatte einen pH von 8,75. Nach Autoklavenbehandlung wurde eine goldfarbene, leicht trübe Flüssigkeit mit einem End-pH-Wert von 6,25 erhalten.

*·« * ««4*4 ■ # (ft 4

Beispiel ¹I Vergleichende Wachsturnscharakteristika

Die autoklav behandelten klaren Kulturmedien aus den Beispielen 1 und 3 wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, das Wachstum von üblichen LaboratoriumskulturstSmmen Bacillus subtilis 6051a, Enterobacter aerogenes ΕΠΟΊ8 und Escherichia coli HS zu unterhalten. Röhrchen mit Kulturmedien, sowohl nicht ergänzt als auch ergänzt mit 1 % BBL Hefeextrakt, 0,5 % Difco Casaminosäuren und 0,5 % Sucrose (Sigma Chemical Co.) wurden beimpft und 5 Stunden bei 35° C inkubiert, worauf Bestimmungen der optischen Dichte bei 660 nm vorgenommen wurden. Difco Penaasay-Brühe und BBL-Nährbrühe wurden als Vergleich verwendet. Die Ergebnisse dieser und der folgenden Experimente wurden nach der folgenden Skala bewertet , die ungefähr halb logarithmische Unterschiede in der gemessenen optischen Dichte wiedergibt:

+ + + + Ausgezeichnetes Wachstum; O.D.0,3-1.,0

+++ gutes Wachstum; O.D. 0,1 - 0,5

+ + mäßiges Wachstum; O.D. 0,03 - <">■,!'

+ etwas Wachstum; O.D. 0,005 - 0,ηλ

kein Wachstum·. O.D. 0 - 0,0OS.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben.

+++ +	+ + + +	+ + + +
+ ++ +	+ + + +	+ + + +
+ +	+ + +	+++■
+ + + +	+ + + +	+ + + +
+ +	+ + +	+ + +
+ + + +	+ + + +	+ + + +
+ + +	+ + +	+++
+ + + +	+ + + +	+ ++ +

Tabelle 7
Vorhergehende_Sichtung bzw. Wachstum

Ku lturmedium B. subtil is E. aerogenes F,.

Difco Penassay-Brühe

BBL-Nährbrühe

3,5 % MLP⁺ (NaOH)

3,5 55 MLP⁺ (NaOH) ⁺supp

3,5 % MLP⁺ (KOH)

3,5 % MLP⁺ (KOH) ⁺ supp

3,5 % MLP⁺ (NH₁₁OH)

3,5 % MLP⁺ (NHj₄OH) ⁺supp

⁺' als MLP-Peststoff

Beispiel 5

Untersuchunp; der Bedeutung" des pH-Wertes

Um die Bedeutung des für die Precipitation der mikrokristallinen Trübefraktion angewandten pH-Werte zu ermitteln, wurde eine Reihe von Kulturmedien zubereitet, die pemäP. Beispiel ? ergänzt waren und bei denen der anfHnrli^he pH-Wert auΓ Werte zwischen U und 11 eingestellt wurde, wobei HC] oder NHjjOH in der erforderlichen Menp;e verwendet wurden. i-*i t Ausnahme de3 anfänglichen pH-Wertes wurden die Medien wie in Beispiel 1 zubereitet und die Ergänzungsstoffe vor der Autoklavbehandlung zugesetzt, zu welcher Zeit alle Proben ähnlich aussahen und leicht filtriert werden konnten. Die Unterschiede in den im Anschluß an die Autoklavbehandlunp· erhaltenen Produkten sind in Tabelle 8 wiedergegeben.

. ■: ''■■:..'' '' ■''■'' '■'	Tabelle 8 .	3390215
	Aussehen nach Autoklav behandlung
	klar, hellgrün	pH nach Autoklav behandlung
Verfahrens-pH	klar, hellgrün	„,5
4 mit HCl	leicht opak	5,5
5 mit HCl	sehr trüb, hellgelb	6,0
6 kein Zusatz	sehr trüb, golden	6,1
7 mit NH4OH	klar, root beer-Parbe	6 4
8 mit NH4OH	sehr dunkelbraun	7,1
9 mit NH4OH	wie flüssige Schokolade	8,8
10 mit NH4OH		0,7.
11 mit NH4OH

Beispiel 6 Repräsentative Wachstumskurven

Unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 4 wurde Molkenpermeatkulturmedium, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 zubereitet und mit 0,2 5 % Casaminosäuren und 0,05 % Hefeextrakt, jeweils mit und ohne 0,05 % Glukose ergänzt worden war, mit Difco Penassay-Brühe und BRL-Nährbrühe hinsichtlich seiner Fähigkeit verglichen, das-Wachstum einer repräsentativen Vielzahl von klinisch wichtigen Mikroorganismen zu unterhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 wiedergegeben und zeigen, daß die Kulturmedien gemäß der vorliegenden Erfindung sich'günstig' ausnehmen neben zwei derzeit weit verbreiteten industriellen Standardprodukten.

REPRÄSENTATIVES WACHSTUM IN FTJ

ψ TABEL

Mircoorganignus

MEDIEN

Molkenpermeat- : Molkehpermeat-

medium medium

(ergänzt) ' (ergänzt)

ohne Glucose mit Glucose

DIKO BBL Penassay- Nähr-Brühe Brühe

Baci11 us subtil is 6051a

Escherich ι a coli HS ~

Enterobacter aeroge*neTTT3048

Streptococcus faecal is E19433

Staphylococcus aureus "6538P

Proteus mfräbTTis 25933

K leos ie Da . pneumoniae 23357

Pseudomonas r'luorescens 15453

Sdlmoneila typhimuriom LT2

la

igeila
nnei

sonne

Sajmonetla typhimurium 2\a

•Μ·++

■♦■+++

■Η-++

+-♦■■♦·+

■Μ·++

Beispiel 7 Einfluß der Autokla-^jehandlung auf das Wachstum

Um die Bedeutung des Einflusses eines neutralen pH's im Endprodukt durch die Autokla\*3ehandlung zu ermitteln, wurde ein filtersterilisiertes, Glucose-ergänztes Vergleichsmedium zubereitet, das im übrigen dem in Beispiel 6 verwendeten Kulturmedium mit der Abweichung entsprach, daß der End-pH-Wert durch Zugabe von HCl anstatt durch Autctelavbehandlung auf 7 eingestellt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 wiedergegeben.

Tabelle 1O₁

REPRÄSENTATIVES WACHSTUM IN FLÜSSIGEN MEDIEN

Microorganismus

Autoklav- Filtersterili-

behandeltes siertes Molken-Molkenpermeatpermeatmedium medium (erg.) (ergänzt)

DIFCO BBL

Penassay- Nähr-Brühe Brühe

Bdcillus.
subtilis 6051a

Eschericnia cöTfHS"

Enterobacter aerbgenes E13048

Streptococcus

Stapny1ococcus aureus"~o538P

Pröteus

TT + T

■t-r-t-r

mirabil is 25.933 -^^¹

Kleosiella

pneumoniae 23357 -^^t"^r-⁽

Pseuviomonas fTuorescens 15453 -^⁺-¹ typhimurium LT2 *⁺ ^

Sh ige!la .

sonne i ⁱ^^TH

TTTT

TTTT

TTT

TTTt

TTTT

TT+ +

TTTT TTTT

TTTT TTT TTTT •t-TTT TT++

Tr++

TTTt

TTTt

TTTT

TTT

TTTT

TT+T

T+ + T

11 j
typ"n"imur ^~;n

Aus dem letzten Eintrag in der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß für das Wachstum von Salmonella typhimurium offensichtlich einige Nährstoffe erforderlich sind, die durch die Autoklavbehandlung verändert werden und nicht so leicht umwandelbar sind, wie dies für das steril filtrierte Medium der Fall ist. Dennoch sind sowohl die autoklavbehandelten als auch die steril filtrierten Medien den zum Vergleich herangezogenen Nährbrühen überlegen.

■■ Beispiel 8 Zubereitung eines anaeroben Kulturmediums

Entsprechend dem Verfahren von L. V. Holdeman et al (Ed.) in Anaerobe Laboratory Manual, 4h Edition (1977) wurde ein vorreduziertes anaerobes Kulturmedium zubereitet, in dem die trockenen Bestandteile 0,5 % Casaminosäuren, 1 % Hefeextrakt und 0,5 % Dextrose unmittelbar vor ihrer Verwendung eingewogen· wurden; danach wurden Wasser und Resazurin zugesetzt und unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt Die Lösung wurde vorsichtig erhitzt, bis das Resazurin in 5 10 Minuten von blau über rosa nach farblos umschlug. Nach Kühlung in einem Eisbad unter einer Stickstoffatmosphäre wurde das Cystein zugesetzt. Dies geschah unter teilweiser Reduktion des Mediums durch Kochen, um Oxidation des Cysteins zu verhindern, da oxidiertes Cystein in einigen anspruchsvollen Anaeroben toxisch sein kann. Der pH-Wert wurde mit, NH₁-OH auf 7,8 eingestellt, was mit Testpapier gemessen wurde, während Stickstoff durch die Flüssigkeit geblasen wurde, die danach in Röhrchen überführt wurde, die mit Stickstoff gespült worden waren. Um Röhrchen mit vorreduziertem Agarmedium zuzubereiten, wurde zunächst den Röhrchen Agar bis auf die gewünschte Endkonzentration zugesetzt und dann wurde vorreduziertes Brühenmedium zu dem Agar in den Röhrchen gegeben. Nach Autoklavbehandlung bei 121°C/15 psi (1,05kg/cm²) für die Dauer von 20 Minuten wurde der restliche feste Agar gelöst, indem die Röhrchen mehrere Male umgestülpt wurden.

Beispiel 9 Repräsentatives Wachstum in einem anaeroben Kulturmedium.

Flüssige anaerobe Kulturmedien wurden gegen drei Stämme von Bacteroides hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, anaerobes Wachstum zu unterhalten. Testproben, die 0,05 % Hefeextrakt + 0,05 % Glukose (Medium 1) und 1,0 % Hefeextrakt + 0,5 %

Λ1-'"

Glukose (Medium 2), aus Beispiel R, enthielten wurden mit den anaeroben Mikroorganismen beimpft. Difco brain heart Infusions-Brühe (BHI) wurde als das eine Vergleichsmedium verwendet; ein 1 % Trypton, 2 % Hefeextrakt und 2 % Glukose enthaltendes Medium (TYG) diente als das zweite Vergleichsmedium, Die optische Dichte wurde während der ersten acht Stunden Inkubation gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle Ii

Sichtung des anaeroben Wachstums Microorganismus '-RHI-Brühe TYP-Brühe Medium JL Medium 2

Bacteriodes

uniformis v622 + + + +

Bacteriodes

fragilis"

ATCC 25285, +++ +

Bacteriodes
fragilis 179-1

Beispiel 10

Zubereitung eines Ausgangskulturmediums für industrielle Fermentationen

3,5 % MLP (Gew./VoI;) wie sie im Handel von Foremost-McKesson, Inc. oder von Express Foods Co. erhältlich sind, wurden mit NH₁-OH auf pH 9 eingestellt und durch eine 30 kdal Dorr-Oliver-Filtereinheit ultrafiltriert. Das Permeat wurde mit 0,25 % Amber BYFIOO-Hefeextrakt ergänzt, bevor 20 Minuten bei 121⁰C/ 15 psi (1,05 kg/cm ) autoklavbehandelt wurde. Das entstandene autoklavbehandelte Kulturmedium war nur leicht trüb, hatte eine goldene Farbe und hatte einen pH-rWert von 6,71. Wenn ein

333^0215

klares Medium gewünscht wird, kann ein leicht löslicher Hefeextrakt, wie Amberex¹ 510-Hefeextrakt anstelle des Amber BYPlOO verwendet werden.

Beispiel 11 Industrieller Fermehtationsprozeß

Bacillus cereus subs, thuringiensis, var. Berliner, erhalten von Dr, Howard I. Dulmage vom U.S. Department of Agriculture Cotton Research Institute, Brownsville Texas, wurde ausgewählt, um die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Kulturmediums zu demonstrieren, einen industriellen Fermentationsprozeft nach der Methode von Dulmage et al. in J. Invert. Pathol. 22} 273 - 277 (1973) zu unterhalten Dieser Organismus produziert ein ο -Endotoxin und wird als e,in biologisches Insektizid bei der Bekämpfung von Schmetterlingskrankheiten verwendet, z.B. als Wurmtöter unter, der Handelsbezeichnung DIPEL 4L von Abbott Laboratories, Chicago. Die Entwicklung von parasporalen Kristallen und Sporen von Bacillus thuringiensis wurde unter unter einem Phasenkontrastmikroskop nach der Methode verfolgt, die von L. A. Bulla et al. in Applied Microbiology Ij! (4): 490 - 495 (1969) beschrieben ist.

Ein Wärmeschock bei 70° C wurde dazu benutzt, um das Ausmaß der Sporenbildung in dem modifizierten Kulturmedium von Beispiel 10, das 0,25 % Amber BYF 100 enthielt, mit dem von Buller et al. beschriebenen GYS-Medium und den B 4-, B4b- und B8b-Medien zu vergleichen, die von DuImage et al beschrieben wurden. Die Hitzebeständigkeit wurde als Maß für vollkommene Sporenbildung verwendet.

Nach 24 Stunden näherte sich die ,Sporenbildung ihrem Maximalwert in dem erfindungsgemäßen Kulturmedium, während beim GYS-Medium die Sporenbildung ihren Maximalwert nicht vor 48 Stunden erreichte; außerdem war die maximale Sporenbildung hundertfach höher als bei GYS.

. ι.	- .Z
I1'	ι

• ft ■ * «

Ähnliche Experimente, bei denen das erfindunpsgemttße Kulturmedium mit B4-, B4b- und BRb~ Medien verglichen wurde, zeigten Sporenbildung nach 24 Stunden₉ die 10 bis 100 mal höher war für das erstgenannte Medium; außerdem war der maximale Sporenbildungsgrad 5 bis 10 mal höher.

Beispiel 12 Industrielles Fermentationsmedium

Das Ausgangskulturmedium von Beispiel 1 wurde vor der Autoklavbehandlung mit 0,25 % Amber BFY 100-Hefeextrakt ergänzt. Aliquote Mengen des entstandenen Mediums wurden mit verschiedenen Organismen von undustrieller Bedeutung beimpft. Die Colonymorphology und die Ausbeuten an Trockenzellgewicht wurden bestimmt und sind in Tabelle 12 wiedergegeben. Dieses Experiment zeigt, daß das erfindungsgemäße Kulturmedium in industriellen Fermentationsprozessen verwendet werden kann.

TabePLllg. !

, üharakteristika des KoIonienwachsturns

Kolonien- Ausbeute an Trocken-Stamm rnorphologie zellengewicht *

Aspergillus niger einzeln} große Ο.76 g / 100 ml

Hyphalmatte

Penicillium notatum Dispers; perl- O.'+7 g / 100 ml

form. Wachstum

Streptomyces griseus gvxt dispergiert 0.21 g / 100 ml Saccharomyces cerevisiae gut dispergiert 0.287g / 100 ml

* 5 Tage nach I/IO vol.-Beimpfung und Inkubation bei 30 C unter Schütteln.

Ueispie 1. 13

Antibiotikaproduktion

Das gleiche, nicht-ergänzte Kulturmedium wurde verwendet, um die

Produktion von Antibiotika durch zwei übliche industrielle Mikro-.·■'"■■ i

Organismen zu demonstrieren. Die in Tabelle 13 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, obgleich noch nicht optimiert, daß eine Heilmittelproduktion in brauchbaren Mengen stattfand.

Tabelle 13 Antibiotika-Produktion

. Antibiotikum-

Stamm Antibiotikum Einheiten / tnl*

Penicillium notatum Penicillin 0.006^ Einheiten / ml Streptomyces griseus Streptomycin 0.00735 Einheiten / ml

■ · ■ ■

* Einen Tag nach I/IO voJ. .-Beimpfung und Inkubation bei .25 - 30°C unter Bewegung. .

- L
Eieispiel

Zubereitung eines durch Nährstoffe ergänzten Mediums aus einer Gelöststofffraktion

Eine gemäß Beispiel. 1 zubereitete Gelöststofffraktion wurde mit 0,5 % Casaminosäuren, 0,05 % Hefeextrakt und 0,05 % Glukose ergänzt. Röhrchen mit Brühe wurden mit verschiedenen Mikroorganismen beimpft,und das Wachstum wurde entweder durch Plattenauszählung, .wie sie in Tabelle I¹I dargestellt ist, oder visuell beobachtet, wie es in Tabelle 15 dargestellt ist.

Tabelle lH

Plattenauszählungen bezüglich des Wachstums^

Kolonie -Auszählungen pro ml. nach 2k

bei 3T⁰"

Getesteter Organismus Ergänzter Gelöst- Vergleichsmedium stoff OSHI₁ PABA , AGAR)

N. meningitidis 80 250

H. influenzae fiO 0

B. ovitis 1250 1800

	' .■■■■ ι .	ι , "* I . ! ι Tabelle	15	• V # * % # W * ♦ · ν 4ί, * #	3390215
ι : r j	• ι	Beobachtung	des
Visuelle	Wachstums

Wachstum innerhalb 24 Std. bei 30° C

Alcaligenes faecalis Bacillus cereus B. megaterium
B. subtilis · B. thyringiensis Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Escherichia coli Micrococcus luteus Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa P. elongata
Rhodospirillum rubrum Salmonella typhimurium Serratia marcescens Staphylococcus aureus Streptococcus faecalis Streptococcus lactis.

Wachstum innerhalb 48 Std.

bei 30 C

Acinetobacter calcoaceticus Corynebacterium sp. Micrococcus Sp. Micrococcus lysodeikticus Planococcus sp. Sarcina sp. Sarcina ureae

Fungi wuchsen nach 2-3 Tagen

Aspergillus nieer Doratomyces stemonitis Penicillium sp.

Beispiel lg_
Suspendierungs- und Emulgierungseigenschaften von Trübe-

Die Stabilität von Kolloiden, die aus drei Proben von mikrokristallinen Trübefraktionen bestanden, wurde durch Bestimmunp; d(?3. Zeta-Potentials-ermittelt. Jede Probe wurde mit entsalztem Wasser auf eine 0,100 % Suspensionskonzentration verdünnt und die elektrophoretische Beweglichkeit wurde unterVerwendung eines Zeta-Meter.s (Z.eta-Meter, New York, NY bestimmt. Mit diesem Instrument wird eine Suspension der Probe

l! i] ' '
in eine elektrophoretische Zelle dekantiert und ein Potential zwischen einem Paar von in die Zelle eingeführten Elektroden angelegt. Die Durchschnittszeit, die ein Partikel braucht, um horizontal zwischen zwei Linien eines Gitters zu wandern, wird durch ein Mikroskop beobachtet und aufgeschrieben. Diese Zeit wird dann unter Verwendung von Umwandlungstabellen in das Zeta-Potential übersetzt.

Die erste Suspensionsprobe, eine luftgetrocknete mikrokristalline Trübefraktion von Express Foods war nur mäßig stabil, wobei der Feststoff während einer Zeit von 15 Minuten langsam dispergierte und einige größere Partikel sich schnell am Boden des Behälters absetzten, wenn das Rühren unterbrochen wurde. Die zweite Suspensionsprobe, eine mikrokristalline Trübefraktion von Express Foods in Form eines nassen Kuchens war außerordentlich stabil, während die dritte Probe, eine mikrokristalline Trübefraktion FGA-I, ebenfalls außerordentlich stabil erschien, jedoch 24 Stunden vor der Nässung ihres Zeta-Potentials gerührt worden war.

Der Einfluß des pH-Wertes auf das Zeta-Potential wurde für jede der drei Proben bestimmt. Das Zeta-Potential für jede Probe war negativ im neutralen pH-Bereich, wurde stärker negativ mit zunehmender Basizität und positiv mit zunehmender Acidität. Es gab einige Hinweise für Auflösung j im sauren pH-Bereich. Der Ladungs-Nullpunkt, d. h. der pH- Γ¹

Wert, bei welchem das Zeta-Potential der Oberfläche des |;

Partikels den Wert Null erreicht, war folgendermaßen: f

Probe 1 = 4,2; Probe 2 =2,4; Probe 3 = 4,5. Die Ergebnisse, ?

die erhalten werden, wenn der pH-Wert gegen das Zeta-Poten- \,

tial aufgetragen wird, sind in den Figuren 3-5 wiederge- [^:.

geben. ' ■ ■ . f

!: l	, ·.■«·· , ■ ; · - * · X1Mf '■ ·'!*.··*■ · · ■ · ■	3390215
	j j. · ι ί · Beispiel l6
	Partikelgröße - Verteilung

Vier Proben wurden untersucht und mittels Strahlabtastmikroskopie (SAM)photographiert, um die Partikelgrößen zu bestimmen. Die Strahlabtastmikrographien sind in den Figuren 6-9 zu sehen; der Abstand zwischen weißen Quadraten an der unteren Linie jeder Photographic beträgt 100,um. Figur 6 zeigt das Ausgangskulturmedium für industrielle Fermentationen, dessen Herstellung in Beispiel 10 beschrieben ist. Figur 7 zeigt eine mikrokristalline Trübefraktion aus Molkenlaktosepermeat (Express Foods Co,), die gemäß Beispiel 1 zubereitet, von· dem Kulturmedium durch Ultrafiltration abgetrennt und danach sprühgetrocknet wurde. Figur 8 zeigt eine mikrokristalline Trübefraktion, die aus Molkenlaktosepermeat (Foremost-McKessori, Inc.) hergestellt wurde, das bei der Mqzarella-Käseherstellung anfällt. Die mikrokristalline Trübefraktion wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt, von dem Kulturmedium durch Ultrafiltration abgetrennt und anschließend sprühgetrocknet. Figur 9 zeigt eine mikrokristalline Trübefraktion, die aus Molkenlaktosepermeat (Foremost-McKesson, Inc.) bei der Herstellung von Schweizer Käse erzeugt wurde. Die mikrokristalline Trübefraktion wurde wiederum wie in Beispiel 1 besehrieben gebildet, von dem Kulturmedium durch Ultrafiltration abgetrennt und danach sprühgetrocknet.

Beispiel 17 Löslichkeit in Wasser und Petroläther.

Die Löslichkeitsmerkmale der mikrokristallinen Trübefraktionen von Beispiel 16 (Figuren 7-9) in Wasser, Petroläther, IN-HCl und IN NaOH wurden untersucht. 0,5 g, 1,0 g und 2,0 g Trübematerial wurden zu 10 ml-Teilmengen eines jeden Lösungsmittels gegeben. Die Lösungen wurden heftig geschüttelt und stehengelassen. Die beobachteten Löslichkeitsprofile sind in Tab.lö wiedergegeben.

Verbindung

Wasser,
Prozent Feststoffe

Wasser,

Prozent Feststoffe

Wasser,
Prozent Feststoffe

Petroläther Prozent Feststoffe

Petroläther Prozent Feststoffe

Petroläther Prozent Feststoffe

N HCl
Prozent Feststoffe

N HCl
Prozent Feststoffe

N NaOH Prozent Feststoffe

N NaOH Prozent Feststoffe

Löslichkei tsinerkmale in Wasser, Petroläther und Säure/Alkali

Sprünge trocknet E,F.

Vorübergehende

Suspension,

unlöslich

Vorübergehende

Suspension,

unlöslich

Vorübergehende

Suspension,

unlöslich

Unlöslich (Film)

Unlöslich (Film)

Unlöslich .(Film)

Vorübergehende

Suspension,

unlöslich

Trüb,

teilweise

suspendiert

Teilweise 1ö s1icn, Supernat klar gelb

Teilweise löslich, Supernat klar orange

Sprühge tr ο ckne tFGA-1

Trüb,

teilweise suspendiert

Trüb,

teilweise suspendiert

Trüb,

teilweise suspendiert

Unlöslich (Film)

Unlöslich (Film)

Unlöslich (Film)

Trüb,

teilweise suspendiert

Trüb,
teilweise
suspendiert
(erhebl. Menge
stabil. Schaum)

Teilweise
löslich,
Supernat
klar orange
(Schwebstoffe)

Stabil, dunkeIorange-

farbe Schaum

Sprühgetrocknet FGA-2

Trüb,

teilweise

suspendiert

Trüb,

teilweise

suspendiert

Trüb,

teilweise

suspendiert

Unlöslich (Film)

Unlöslich (Film)

Unlöslich (Film)

Trüb,

fast völlig

suspendiert

Trüb,

tei Lweisu

suspendiert

(Schwebstoffe)

Te ilwei s e löslich, Supernat klar gelb (Schwebstoffe)

Teilweise löslich, Supernat klar orange (bedeut. Mengen Sohwobstoffe)

. :i

ψ * * 4

[WA: ^; ' .■ ■

Beispiel 18 ι . !

Löslichkeit in organischen Flüssigkeiten

Die Löslichkeit der mikrokristallinen Trübefraktionsmaterialien von Beispiel 10 (Figuren 7 - 9) wurde weiterhin in einer Vielzahl von organischen Lösungsmitteln bestimmt. Im allgemeinen wurden 0,5 g Trübematerial zu 5 ml jedes Lösungsmittels gegeben. Die Lösungen wurden heftig geschüttelt und stehengelassen. Im Falle Von Glyzerin wurden 5 S■zu 50 ml gegeben, und die Lösung wurde mechanisch gerührt. Die erhaltenen Löslichkeitsprofile sind in Tabelle 17 wiedergegeben.

Tabelle 17

Löslichkeitscharakteristika in organischen Flüssigkeiten, Löslichkeit der Trübefraktionen bei 10 # Gew.-/Vol.

Dielektr. Sprüh- Sprüh- Sprüh-Konstante getrocknet getrocknet getrocknet Lösungsmittel bei 25°C E.F. FGA-I FGA-2 FGA-2 Naß

Glycerol	h2.5	17.1	2.'i	2	Suspendierung	2	2	1	Suspendierung,	unlöslich	schweb. Material
Methanol	32.6	Äthylacotat 6.0	2.3	7	7	7	7	Suspendierung,	unlöslich
Äthanol	2'4. 3	Chloroform 4.8 (20°		k	7	7	7
Aceton	20.7	Äthyläther '4.3	1.9 (20P	7	3	3	2
2-Propanol 20.1	Toluol	trüb, völlige	7	2	7	8 .
n-Butanol	Benzol	7	7	7	7
Hexane,	5	5	5	1
praktisch	C) 5	Ui	5	9
1 =	Ul	5	5	9
2 =	7	6	5	9
3 =	7	6	6	9
k =
5 =	C) 7	7	7	9
6 =	Susperidierung
7 =	trüb, teilweise Suspendierung
8 =	trüb, teilweise Suspendierung	mit schwebendem Material
9 =	trüb, leichte
teilweise, feinteilige Suspendierung
teilweise, feinteilige Suspendierung mit
vorübergehende
vorübergehende
unlöslich

ι < '— ^■■'HWi ΑΒΑ

Beispiel 19 Emulgierung von Pflanzenöl.

Eine Lösung von mikrokristallinen Trübefraktionen von Beispiel 16 (Figuren 7 und 8) wurde zubereitet, indem 20 Teile des feuchten Präzipitats in 100 Teilen Wasser geschüttelt wurden. 30 Teile 5 JSiger Essig wurden dieser Lösung zugesetzt und das entstandene Gemisch wurde gerührt, wobei Verdickung bemerkbar war. Dann wurden 50 Teile Sucrose unter Rühren zugesetzt, was zu einer weiteren Verdickung führte. Darauf wurden 100 Teile flüssiges Pflanzenöl (Erdnußöl) zugesetzt und das Gemisch wurde in einem Mixer bei hohen Geschwindigkeiten homogenisiert. Die entstandene Emulsionsschicht war für mindestens 4 Stunden stabil und hatte die Viskosität eines Mayonnaisegemisches.

Zum Vergleich wurde das vorstehend beschriebene Verfahren ohne den Zusatz einer mikrokristallinen Trübefraktion wiederholt. Hierbei zeigte sich keine Verdickung des Gemisches im Anschluß an die Zugabe von Essig und Sucrose. Die öl- und Wasserschichten bildeten keine Emulsion und die Trennung in zwei unterschiedliche Schichten war bereits 2 Minuten nach der versuchten Homogenisierung vollständig.

Beispiel 20 Emulgierung von Orangenmark-Schlichte

Unter Anwendung des Verfahrens aus dem vorangegangenen Beispiel wurden 10 ml Orangenmark-Schlichte (die wasserlösliche Fraktion von Zitrusmark und von zerriebenen Safttrübstoffen) zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, die 2 g mikrokristalline Trübefraktion von Beispiel 16 enthielten. Unmittelbar nach dem Mischen befand sich das gesamte Material in einer einzigen Emulsionsschicht und verblieb dort für mindestens 2 Stunden. Etwa 18 Stunden später hatte ein kleiner Teil der Flüssigkeit eine untere, klärende

: J

IuP ^; ..

Schicht unter der Emulsion gebildet. Mit der mikrokristallinen Trübefraktion von Figiur 8 war diese Emulsionsschicht erstarrt.

Zum Vergleich wurde dieses Verfahren ohne den Zusatz einer mikrokristallinen Trübefraktion wiederholt. Die untere, sich klärende Schicht begann sich nach weniger als 30 Minuten zu bilden und die verbleibende Emulsionsschicht war nicht dick wie in den Proben, welche die Trübefraktion enthielten.

Beispiel 21 Emul^ierung von Hexanen

Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit der erfindungsgemäßen mikrokristallinen Trübefraktion, nicht polare Kohlenwasserstoffe zu emulgieren. Nach dem Verfahren des vorangegangenen¹ Beispiels wurden 10 ml technische Hexane zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, welche 2 g mikrokristalline Trübefraktionen aus zwei verschiedenen Quellen enthielten. Unmittelbar nach dem Mischen erstreckte sich eine obere Schaumschicht bis an den Rand des Reagenzglases und der Schaum hatte diese Höhe immer noch nach 37 Minuten. Etwa 18,5 Stunden später war der Schaum in beiden Röhrchen gelatinös geworden. '

Zum Vergleich wurde dieses Verfahren ohne den Zusatz einer mikrokristallinen Trübefraktion wiederholt. Die technischen Hexane und das Wasser trennten sich vollkommen in zwei unterschiedliche, klare Phasen, unmittelbar, nachdem das Verwirbeln beendet wurde.

Beispiel 22 Emulgierung von Rohöl.

Unter Verwendung von South Dakota-Rohöl mittlerer Qualität, das 1,6 % Schwefel enthielt, wurden 10 ml der ölprobe zu

10 ml destilliertem Wasser gegeben, die 2 g von beiden der mikrokristallinen Trübefraktionen der vorangegangenen Beispiele enthielten. Die eine mikrokristalline Trübefpaktion enthaltenden Proben bildeten zwei stabile Phasen. Die obere Phase wurde gelatinös gemacht, wobei die mikrokristalline Trübefraktion von Figur 8 bei etwa 90 Minuten Minuten gelierte und.die Probe von Figur 7 weniger dramatisch nach etwa 18 Stunden gelierte. Die Probe von Figur 8 zeigte, verglichen mit der Probe von Figur und mit Vergleichsproben, eine relativ geringe Fähigkeit ρ ein Plastikrohr zu überziehen.

Zum Vergleich wurde dieses Verfahren ohne die Zugabe von mikrokristalliner Trübefraktion wiederholt, öl und Wasser bildeten eine einzige flüssige Phase und bildeten kein Gel beim Stehen.

Beispiel 23 Emulgierung von Bentonit

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung der mikrokristallinen Trübefraktion zum Emulgieren von feinteiligen anorganischen Feststoffen. Unter Anwendung der Prozeduren der vorangegangenen Beispiele wurde 0,2 g Bentonit zu 20 ml destilliertem Wasser geReben, die 2 g trockene mihrokristalline Trübefraktion gemäß Beispiel 16 enthielten. Mit der mikrokristallinen Trübefraktion von Figur 8 bildete sich eine obere Schaumschicht und eine untere, schaumige Schicht; die schaumige Schicht war für mindestens 18 Stunden stabil.

Zum Vergleich wurde diese Prozedur ohne den Zusatz einer mikrokristallinen Trübefraktion wiederholt. Unmittelbar nach dem Mischen wurde eine einzige, schaumige Schicht erhalten, die innerhalb etwa 0,5 Stunden ebenfalls das Vorhandensein einer unterein, klaren Schicht zeigte.

-SD-

Beispiel

Emulgierung von Proteinen durch Trübefraktionen

Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit einer mikrokristallinen Trübefraktion, Protein zu emulgieren und zu gelieren. 100 ml-Proben von wässrigen Lösungen wurden zubereitet unter Verwendung einer mikrokristallinen Trübefraktion, die aus MLP erzeugt worden war, das von Express Foods Co. bezogen wurde, und unter Verwendung von Savorpro 75-Molkenproteinkonzentrat, das ebenfalls von Express Foods Co. erhältlich ist. Die Proben wurden in einem Mixer bei hoher Geschwindigkeit 3 Minuten geschlagen. Die Schaumhöhe und die Viskosität der entstandenen Emulsionen wurden festgehalten, wobei sich herausstellte, daß die Zugabe von entweder 10 oder 20 % mikrostalline Trübefraktion sowohl die Schaumhöhe als auch die Viskosität der 10 % Molkenproteinkonzentrat enthaltenden Lösungen erhöhte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 wiedergegeben.

Tabelle 18 Emulgierung von Protein durch Trübefraktion.

100 ml wässrige Lösung, bei hoher Geschwindigkeit 3 Min. geschlagen

Schaumhöhe, wenn Viskosität(be-100 ml Flüssigkeit nötigte Zeit für sich in einem 200ml 5ml,um aus ei-Becher absetzten ner Pipette abzutropfen ,bezogen auf einen Wert von 3 für

	1	,8	cm	H2O	Sek.
10 J				H
10 5	2	,5	cm		Sek.
10 J				5
10 '/	3		cm		,8 Sek.
20 J			5
5 MLP
I MLP
5 Trübefraktion
I MLP
5 Trübefraktion

Beispiel 2_5
Gelierung von Protein durch Trübefraktion.

Mikrokristalline Trübefraktion emulgiert nicht nur Protein, sondern geliert auch Protein bei niedrigeren Konzentrationen als solchen, bei denen Gelierung normalerweise eintritt. Unter Verwendung der gleichen, vorstehend beschriebenen Materialien wurden 10 ml - Proben von wässerigen Lösungen zubereitet, verwirbelt und 20 Minuten bei 80⁰C beimpft. Bei Zugabe von 20 % mikrokristalliner Trübefraktion erstarrt ein 10 % -iges Molkenproteinkonzentrat bei 80° C. Ohne Zugabe von mikrokristalliner Trübefraktion tritt keine Erstarrung der 10 /Jigen Proteinlösung ein, wie Tabelle 19 zeigt.

Tabelle 19 Gelierung von Proteinlösungeru

Wässrige Lösung 80°C für 20 Minuten

10 % Trübefraktion leichte Suspension mit gros-

sem Sedimentkuchen

20 % Trübefraktion leichte Suspension mit gros-

sem Sedimentkuchen

10 % MLP trübe Suspension, dicke

Schicht

20 % MLP fester Kuchen

10 % Trübefraktion +

10 % MLP milchige Suspension mit Kuchen

10 % Trübefraktion ·*

20 % MLP fester Kuchen

20 % Trübefraktion +

10 % MLP 1:1 fester Kuchen und dicke

Schicht

20 % Trübefraktion +

20 % MLP fester Kuchen.

26 ^:

Zubereitung einer industriellen Fermentation Medien mit erhöhtem Glukosegehalt

Permeat wird wie in Beispiel 10 beschrieben zubereitet, jedoch mit der Abweichung, daß als das Ausgangsmaterial 20 5Üiges (Gew./Vol.) Molkenlaktosepermeat verwendet wird. Das gebildete Permeat wird sprühgetrocknet und dazu verwendet, Ausgangskulturmedien für industrielle Fermentationen zuzubereiten, die in ihrem Glukosegehalt im Vergleich zu denen von Beispiel 10 erhöht sind. Ein solches Kulturmedium wird erzeugt, indem eine 2,0 % Feststoff enthaltende Lösung von sprühgetrocknetem Permeat zubereitet und diese mit 0,2555 Amber 510-Hefeextrakt und 1,0 ■%. Dextrose ergänzt wird, bevor 20 Minuten bei 121⁰C/15 psi (1,05 kg/cm²) autoklavbehandelt wird. Das entstandene, autoklav behandelte Kulturmedium ist klar, goldfarben und hat ein pH von 6,5. Ein anderes ,solches Kulturmedium wird erzeugt, indem zunächst eine 15 % Feststoff enthaltende Lösung von sprühgetrocknetem Permeat zubereitet wird, wobei die Lösung ein pH von 6,5 hat.

Diese Lösung wird durch einen immobilisierten Enzymreaktor des Typs geschickt, wie er in Biotechnology and Biophysics XXV Seiten 525-539 (1983) beschrieben ist, und zwar mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/min und bei einer Temperatur von 37° C, was zu einer Umwandlung von h7 % der Permeatlaktose in Glukose und Galactose durch das immobilisierte Säurelactaseenzym führt. Die enzymatisch^ Umwandlung wurde durchgeführt ohne pH-Einstellung des Permeats und verlief deshalb bei einem pH, der für das R'iurelactaseenzym nicht optimal war. Diese Anwendung eines nicht optimalen pH-Werts führte zu einer 47 /Sigen Umwandlung, die für dieses Beispiel erwünscht war, da sie etwa 1 % Glukosekonzentrat ergab, wenn die Permeatfeststoffe auf 3 % eingestellt wurden. Das entstandene Medium war dann vergleichbar mit dem

glukoseergänzten Medium. Auf einen Feststoffgehalt von 3»O % eingestellt, enthält dieses lactasebehandelte Permeat 1,2¹I % Glukose. 3,0 3Siges, lactasebehandeltes Permeat, das mit 0,25 % Amber 510-Hefeextrakt ergänzt und 20 Minuten bei 12I⁰C/15 psi (1,05 kg/cn^?) autoklavbehandelt ist, ergibt ein klares, goldenes Kulturmedium mit einem End-pH von 6,5.

Die glukoseergSnzten und lactasebehandelten Ausgangskulturmedien dieses Beispiels wurden gegen mehrere Mikroorganismen hinsichtlich ihrer wachstumsfördernden Eigen-* schäften getestet, verglichen mit dem in Beispiel 10 beschriebenen industriellen Ausgangskulturmedium. Die Ergebnisse erscheinen in Tabelle

Tabelle

Repräsentatives Wachstum in industriellen Fermentationsmedien mit erhöhtejn^Glukosjsgehalt

Medium

Mikroorganismen

S.aureus S.faecalis B.subtilis E.coli P.fluores-

cens

Ausgangskulturmedium für industrielle Fermentation ++ ++++ ++++

glukoseergänztes Ausgangskulturmedium für industrielle Fermentation ++ ++++ ++++

laktosebehandeltes Ausgangskulturmedium für industrielle Fermentation +++ ++++ ++++

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Industrielle Kulturmedien mit einem weiten Bereich von Glukose/Laktose-Verhältnissen können zubereitet werden, indem das Ausmaß entweder der Dextroseergänzung oder der vorstehend beschriebenen Laktosehydrolyse variiert wird. Wenn ein hohes Ausmaß an Laktosehydrolyse gewünscht wird, wird ein neutrales Laktoseenzym immobilisiert, wobei ein neutrales Puffersystem verwendet und keine weitere pH-Einstellung vorgenommen wird, bevor das Permeat durch den Reaktor geleitet wird. Desgleichen können auch Medien mit unterschiedlichem Glukose/Laktose-Verhältnis zubereitet ', werden, indem die entsprechenden Mengen an Permeatfeststoffen mit Dextrose oder Permeatfeststoffe mit laktosebehandelten Permeatfeststoffen vermischt werden.

Beispiel 27 Käse-Starter-Kulturmedium.

Bei Anwendung des Verfahrens von Beispiel-2, jedoch.unter Einstellung des Primärpermeats auf pH 8,5 - 9,0 und Ergänzung des Sekundärpermeats mit 0,25 % Amber 510- oder Amber 1003-Hefeextrakt erhält man ein im wesentlichen neutrales, klares, goldfarbenes Kulturmedium, das geeignet ist zum Züchten von handelsüblichen Käse-Starterkulturen, wie sie von Chris Hansen Laboratories, Milwaukee, Wisconsin geliefert werden, und zum Züchten von Kulturen von Streptococcus cremoris (ATCC 19257), Streptococcus lactis (ATCC 19^35) und Streptococcus diacetylactis (ATCC 153^6).

Kulturwachstum auf diesen Medien, bestimmt durch Plattenauszählung der lebensfähigen Komponenten, ist mit dem Wachstum vergleichbar, das durch derzeit erhältliche Käse-Starterkulturmedien produziert wird, wenn die Temperaturen und die Bewegung in identischer Weise gesteuert und keine äußere pH-Kontrolle angewandt wird. Wenn jedoch der pH-Wert gesteuert wird durch Zugabe¹ einer Base, um die Kulturbrühe !

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in dem Bereich von pH 6,0 - 6,5 zu halten, erreicht die Zellendichte den fünf- bis zehnfachen Wert von der Zellendichte in den derzeit erhältlichen, handelsüblichen Medien. Außerdem kann diese Wachstumsrate reproduzierbar in acht Stunden mit einem entsprechenden Inoculum erhalten werden, verglichen mit 16 - 20 Stunden, wie sie typischerweise in handelsüblichen Medien , wie Nordica, In-Sure und Phase to erforderlich sind, die einen internen Phosphatpuffer einschließen.

Die vorangegangenen Beispiele können mit ähnlichem Erfolg wiederholt werden, indem die allgemein oder spezifisch in dieser Erfindung beschriebenen Reaktionsteilnehmer und/ oder Betriebsbedingungen anstelle der in den Beispielen spezifisch genannten verwendet werden. Aus der vorangegangenen Beschreibung ist klar, daß der Fachmann diese Erfindung unter beliebigen Abänderungen durchführen kann, ohne vom Rahmen der Erfindung abzuweichen.

Industrielle Anwendbarkeit

Wie aus der Beschreibung und den Beispielen ersichtlich ist, ist die vorliegende Erfindung industriell anwendbar bei der Erzeugung einer Vielzahl von Handelsprodukten aus laktosereichem Molkenpermeat, das bisher normalerweise als ein Abfallprodukt betrachtet wurde. Ein besonderes wichtiges Produkt sind mikrobiologische Kulturmedien, die in der Lage sind, das Wachstum einer großen Vielzahl von Mikroorganismen zu unterhalten; ein zweites wichtiges Produkt sind Emulgierungs- oder Stabilisierungsmittel von Lebensmittelqualität, die in der Lage sind, eine große Vielzahl von Produkten zu emulgieren oder zu stabilisieren.

Claims (1)

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   Patentansprüche ■ .

   1. Verfahren zur Umwandlung von Molkenläctosepermeat

   in nützliche Handelsprodukte, dadurch gekennzeichnet; daß man

   a) den pH-Wert eines Molkenlactosepermeats, das ein pH unter etwa 7 aufweist, auf zwischen etwa 8 und 10 anhebt, um eine lactosereiche wässrige Ctelöststoffphase und eine mikrokristalline Trübefraktion zu bilden, die im wesentlichen alle diejenigen gelösten Peststoffe aus diesem Permeat enthalt, welche bei Autoklavbehandlung dieses Permeats für die Dauer von 10 - 20 Minuten bei 121° C und 15 psi ein Präzipitat bilden würden,

   so daß eine klare, hellfarbene Gelöststoff-Fraktion mit einem pH von etwa 7 gebildet werden kann, wenn das alkalische Permeat derart autoklav behandelt wird,

   b) die mikrokristalline Trübefraktion von der Gelöst.-stoffphase abtrennt und

   c) mindestens eine der beiden Fraktionen mikrokristalline Trübefraktion und Gelöststoffphase gewinnt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert auf etwa 9 angehoben wird.

   7>. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrokristalline Trübefraktion von der Gelöststoffphase mittels Ultrafiltration durch ein 20 - 100 kdal-Membranfilter abgetrennt wird.

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   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der abgetrennten Gelöststoffphase auf etwa 6,8 - 7,1 absenkt.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert durch Zugabe einer.nichttoxischen Lewis-Säure zu der Gelöststoffphase absenkt.

   6. Verfahren nach Anspruch ü, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert durch Autoklavbehandlung der Gelöststoffphase unter Bildung eines sterilen mikrobiologischen Kulturmediums absenkt.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert ohne die Zugabe.einer Säure von außen zu der Gelöststoffphase absenkt.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgetrennte Gelöststoffphase bis auf einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10 Gew.-% sprühtrocknet.

   9. Mikrobiologisches Kulturmedium, das in der Lage ist, das Wachstum von Mikroorganismen unter geeigneten Wachstumsbedingungen zu unterhalten, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus der Gelöststoffphase besteht, die

   gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 erhalten wird und die im wesentlichen frei von Komponenten ist, die durch ein Filter zurückgehalten würden, welches Komponenten mit einem Molekulargewicht unter etwa lOO kdal durchläßt, und die im wesentlichen alle diejenigen Komponenten enthält, die durch ein Filter gehen würden, das Komponenten mit einem Molekulargewicht über etwa 10 kdal zurückhält.

   10. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen frei ist von Komponenten, die durch ein Filter zurückgehalten würden, welches Komponenten mit einem Molekulargewicht unter etwa 30 kdal durchläßt.

   11. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein pH von etwa 6,8 - 7,1 aufweist.

   12. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Feststoffgehalt von etwa "5,5 % (Gew./Vol.) aufweist.

   1"5. Steriles Kulturmedium nach Anspruch 9.

   1-4. Kulturmedium nach Anspruch 9_S dadurch gekennzeichnet, daß es in der Form eines frei fließenden Pulvers vorliegt, das einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als etwa 10 Gew.-% aufweist.

   15. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wachstumsfördernde Menge von äußerlichen, nichttoxischen, assimilierbaren Kohlenstoffatomen enthält.

   16. Kulturmedium nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Quelle für Kohlenstoffatome Glukose ist.

   17. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wachstumsfördernde Menge von äußerlichen, nichttoxischen, assimilierbaren Stickstoffatomen enthält.

   18. Kulturmedium nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Quelle für Stickstoffatome ein Hefeextrakt, Hefeautolysat, hydrolysiertes Casein, Sojaprotein oder Sojaproteinhydrolysat oder Gemisch dieser Komponenten ist.

   19. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge eines nichttoxischen Gelierungsmittels enthält.

   20. Kulturmedium nach Anspruch 9, welches die Wachstumsmerkmale eines Fermentationsmediums aufweist, dadurch gekenn- ;

   zeichnet, daß es einen Feststoffgehalt von etwa. 3,5 ^ (Gew./Vol.) und etwa 0,25 % wasserlöslichen Brauhefeextrakt aufweist.

   21. Kulturmedium nach Anspruch 9, welches Wachstumsmerkmale aufweist, die denen von Penassay-Brühe oder Nährbrühe vergleichbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 0,25 - 0,5 % hydrolysiertes Casein, etwa 0,05 % Hefeextrakt und einen Glukosegesamtgehalt von etwa 0,05 - 0,1 % aufweist.

   22. Kulturmedium nach Anspruch 9, das Wachstumsmerkmale aufweist, die denen von Thioglycolat-Brühe vergleichbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge eines nichttoxischen Gelierungsmittels aufweist, um die Sauerstoffdiffusion zu reduzieren, sowie etwa 0,25 - 0,5 % hydrolysiertes Casein, etwa 0,5 % Hefeextrakt, etwa 0,05 % Cystein-HCl und einen Glukosegesamtgehalt von etwa 0,5 %.

   23. Kulturmedium nach Anspruch 9, das für die Züchtung von anaeroben Bakterien angepaßt ist, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 0,25 % hydrolysiertes Casein, etwa 1 Gew.-? Hefeextrakt, etwa 0,2 Gew.-% Cystein-HCl, etwa 0,05 %. HSmin, etwa 0,1 % Vitamin K,, insgesamt etwa 0,5 % Glukose, einen pH-Wert von etwa 7,ß, ein Oxydations/Reduktionspotential von -150 mV oder weniger, sowie eine wirksame Menge eines colorimetrischen Oxydations/Reduktions-Indikators aufweist.

   24. Kulturmedium nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Indikator aus etwa 0,001 % Resazurin besteht.

   25. Mikrobiologisches Startergemisch, bestehend aus lebensfähigen Mikroorganismen und einem geeigneten Nährmedium hierfür, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Startergemisch das mikrobiologische Kulturmedium gemäß Anspruch 9 ; ist. ': :

   26. Startergemisch nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Mikroorganismus ein Ktf.se produzierender Mikroorganismus ist.

   27. Verfahren zur Erzeugung eines Mikroorganismus in vitro unter Eintauch-Nährkulturbedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Kulturmedium das Kulturmedium von Anspruch 9 ist. ■ ₄

   28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß. der Mikroorganismus eine Bakterie ist.

   29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine der folgenden Spezies ist: Bacillus, Lactobacillus, Kluyveromyces und Saccharomyces.

   30. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Bacillus cereus subs, thuringiensis ist.

   31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine der Spezies Aspergillus, Penicillium oder Streptomyc.es ist. .

   32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Penicillium notatum.ist.

   33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces griseus ist.

   3¹J. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus einem klinischen Isolat erhalten worden ist.

   35. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß : die abgetrennte mikrokristalline Tri'befraktion unter Bildung eines gepchmiickiolsen, geruchlosen, kreideweißen,

   frei fließenden Pulvers getrocknet wird.

   36. Nicht toxischer Zusatzstoff von Lebensmittelqualität, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen aus d^m geschmacklosen, geruchlosen, kreideweißen j frei fließenden Pulver besteht, das gemäß dem Verfahren von Anspruch 35 erhalten worden ist.

   37. Verfahren zur Herstellung einer stabilen Emulsion oder Suspension aus einer Vielzahl von miteinander nicht mischbaren Materialien durch Zugabe eines Emul- ^! gierungs- oder Stabilisierungsmittels, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Emulgierungs- oder Stabilisierungsmittel die mikrokristalline Trübefraktion von Anspruch 36 ist.

   38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß diese miteinander nicht mischbaren Materialien ein öl und Wasser sind.

   39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß dieses öl ein eßbares pflanzliches öl ist.

   Geänderte Patentansprüche

   1. Verfahren zum Franktionieren von deproteinierten Molkenlactosepermeaten unter Bildung von wertvollen Handelsprodukten, die im wesentlichen aus einer wässrigen Flüssigkeitsphase, welche verbesserte Eigenschaften für ein mikrobiologisches Kulturmedium aufweist, und aus einer mikrokristallinen Feststoffphase bestehen, welche verbesserte Emulgierungseigenschaften aufweist,

   dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) den pH-Wert eines Molkenlactosepermeats, das einen pH-Wert unter etwa 7 aufweist, auf zwischen etwa 8 und 10 anhebt, um i) eine lactosereiche wässrige Gelöststoff phase, welche bei 12.1.⁰C und 1,05 kg/cm* (15 psi) während 10-20 Minuten unter Bildung einer klaren, hellfarbenen Gelöststoff fraktion mit einem pH-Wert von etwa 7 autoklavbehandelt werden kann, und ii) eine mikrokristalline Feststoff phase zu erzeugen, welche im wesentlichen alle in diesem Permeat gelösten Feststoffe enthalt, die bei Autoklavbehandlung dieser Gelöststoffphase einen Niederschlag bilden würden und die zu einem geschmackfreien, geruchlosen, kreideweißen, frei fließenden Pulver getrocknet werden können, das in Wasser und Petroläther unlöslich ist,

   b) die mikrokristalline Feststoffphase von der wässrigen Gelöststoffphase trennt und

   c) mindestens eine der beiden Phasen, nämlich der mikrokristallinen Feststoffphase und der wässrigen Gelöststoffphase,gewinnt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Permeats auf etwa 9 anhebt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die mikrokristalline Feststoffphase von der Gelöststoffphase mittels Ultrafiltration durch ein 20 - 100 kdal-Membranfilter trennt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Gelöststoff phase gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der gewonnenen Gelöststoffphase auf etwa 6,8 - 7,1 gesenkt wird.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Zugabe einer nicht-toxischen Lewissäure zu der Gelöststoffphase gesenkt wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Autoklavbehandlung der Gelöststoffphase unter Bildung eines sterilen mikrobiologischen Kulturmediums gesenkt wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert ohne Zugabe einer Säure von außen zu der Gelöststoff phase gesenkt wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Gelöststoff phase gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene Gelöststoffphase auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10 % sprühgetrocknet wird.

   9. Mikrobiologisches Kulturmedium, das in der Lage ist, das Wachstum von Mikroorganismen unter geeigneten Wachstumsbedingungen zu unterhalten, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus der Gelöststoffphase besteht, die gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 erhalten wird und die im wesentlichen frei von der mikrokristallinen Feststoffphase und frei von Komponenten ist, die durch ein Filter zurückgehalten würden, welches Komponenten mit einem Molekulargewicht unter etwa 100 kdal durchläßt, und die im wesentlichen alle diejenigen

   Komponenten enthält, die durch ein Filter gehen würden, das Komponenten mit einem Molekulargewicht über etwa 10 kdal zurückhält.

   10. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen frei ist von Komponenten, die durch ein Filter zurückgehalten wurden, welches Komponenten mit einem Molekulargewicht unter etwa 30 kdal durchläßt.

   11. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein pH von etwa 6,8 - 7,1 aufweist.

   12. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Peststoffgehalt von etwa 3,5 % (Gew./Vol.) aufweist.

   13. Steriles Kulturmedium nach Anspruch 9·

   ll\. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Form eines frei fließenden Pulvers vorliegt, das einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als etwa 10 Gew.-ί aufweist.

   15. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wachstumsfördernde Menge von äußerlichen, nichttoxischen, assimilierbaren Kohlenstoffatomen enthält.

   16. Kulturmedium nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Quelle für Kohlenstoffatome Glukose ist.

   17. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wachstumsfördernde Menge von äußerlichen, nichttoxischen, assimilierbaren Stickstoffatomen enthält.

   18. Kulturmedium nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Quelle für Stickstoffatome ein Hefeextrakt, Hefeautolysat, hydrolysiertes Casein, Sojaprotein oder Sojaproteinhydrolysat oder Gemisch dieser Komponenten ist.

   19. Kulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge eines nichttoxischen Gelierungsmittels enthält.

   20. Kulturmedium nach Anspruch 9, welches die Wachstumsmerkmale eines Fermentationsmediums aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Feststoffgehalt von etwa 3,5 % (Gew./Vol.) und etwa 0,25 % wasserlöslichen Brauhefeextrakt aufweist.

   21. Kulturmedium nach Anspruch 9, welches Wachstumsmerkmale aufweist, die denen von Penassay-Brühe oder Nährbrühe vergleichbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 0,25 - 0,5 % hydrolysiertes Casein, etwa 0,05 % Hefeextrakt und einen Glukosegesamtgehalt von etwa 0,05 - 0,1 JS aufweist.

   22. Kulturmedium nach Anspruch 9, das Wachstumsmerkmale aufweist, die denen von Thioglycolat-Brtthe vergleichbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge eines nichttoxischen Gelierungsmittels aufweist, um die Sauer-Stoffdiffusion zu reduzieren, sowie etwa 0,25 - 0,5 % hydrolysiertes Casein, etwa 0,5 % Hefeextrakt, etwa 0,05 % Cystein-HCl und einen Glukosegesamtgehalt von etwa 0,5 %.

   23. Kulturmedium nach Anspruch 9, das für die Züchtung von anaeroben Bakterien angepaßt ist, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 0,25 % hydrolysiertes Casein, etwa 1 Gew.-? Hefeextrakt, etwa 0,2 Gew.-% Cystein-HCl, etwa 0₃05 % Hämin, etwa 0,1 % Vitamin K,, insgesamt etwa 0,5 % Glukose, einen pH-Wert von etwa 7,8, ein Oxydations/Reduktionspotential von -150 mV oder weniger, sowie eine wirksame Menge eines colorimetrischen Oxydations/Reduktions-Indikators aufweist.

   4. Kulturmedium nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Indikator aus etwa 0,001 % Resazurin besteht.

   25. Mikrobiologisches Startergemisch, bestehend aus lebensfähigen Mikroorganismen und einem geeigneten Nährmedium hierfür, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Startergemisch das mikrobiologische Kulturmedium gemäß Anspruch 9 ist.

   26. Startergemisch nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Mikroorganismus ein Käse produzierender Mikroorganismus ist.

   27. Verfahren zur Erzeugung eines Mikroorganismus in vitro unter Eintauch-Nährkulturbedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Kulturmedium das Kulturmedium von Anspruch 9 ist.

   28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine Bakterie ist.

   29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine der folgenden Spezies ist: Bacillus, Lactobacillus, Kluyveromyces und Saecharomyces

   30. Verfahren nach Anspruch 27_s dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Bacillus cereus subs, thuringiensis ist.

   31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine der Spezies Aspergillüs, Penicillium oder Streptomyces ist.

   32. Verfahren nach Anspruch 31» dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Penicillium notatum ist.

   33· Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces griseus ist.

   34. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus einem klinischen Isolat erhalten worden ist.

   35. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mikrokristalline Feststoffphase gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene mikrokristalline Feststoffphase unter Bildung eines geschmacksfreien, geruchslosen, kreideweißen, freifließenden Pulvers getrocknet wird, welches im Wasser und Petroläther unlöslich ist.

   36. Nicht toxischer Zusatzstoff von Lebensmittelqualität, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen aus dem geschmacklosen, geruchlosen, kreideweißen, frei fließenden Pulver besteht, das gemäß dem Verfahren von Anspruch 35 erhalten worden ist.

   37. Ein Lebensmittel-, pharmazeutisches, kosmetisches oder Zahnpflege-Erzeugnis, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge eines zugesetzten Trübungs-, Stabilisierungs-, Emulgierungs- oder Verdickungsmittels enthält, welches der Zusatzstoff gemäß Anspruch 36 ist.

   38. Verfahren zur Herstellung einer stabilen Emulsion oder Suspension aus einer Vielzahl von miteinander nicht mischbaren Materialien durch Zugabe eines Emulgierungs- oder Stabilisierungsmittels, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Emulgierungs- oder Stabilisierungsmittel das gemäß Anspruch 36 erhaltene Pulver ist.

   39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß diese miteinander nicht mischbaren Materialien als Hauptbestandteile ein Öl und Wasser enthalten.

   40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Öl ein eßbares pflanzliches Öl ist.