DE2400323C2 - Neue Glucose-Isomerase und ihre Herstellung - Google Patents

Neue Glucose-Isomerase und ihre Herstellung

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DE2400323C2
DE2400323C2 DE2400323A DE2400323A DE2400323C2 DE 2400323 C2 DE2400323 C2 DE 2400323C2 DE 2400323 A DE2400323 A DE 2400323A DE 2400323 A DE2400323 A DE 2400323A DE 2400323 C2 DE2400323 C2 DE 2400323C2
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Description

Erfindungsgegenstand Ist die Im Patentanspruch 1 angegebene Glucose-Isomerase und das Im Patentanspruch 2 genannte Verfahren zu Ihrer Herstellung.
Sirupe, die eine Mischung von Glucose und Fructose
enthalten, finden In der Industrie wegen Ihres süßen Geschmacks und ihrer geringen Neigung zu kristallisieren umfangreiche Verwendung, Derartige Sirupe werden vorwiegend aus Glucose-Slrupen unter Verwendung eines Enzyms, vermittels dessen die Isomerisierung von Glucose zu Fructose katalysiert wird, hergestellt. Für die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens Ist es von Wichtigkeit, daß die Enzymkosten niedrig liegen und daß die Bildung von Nebenprodukten vernachlässigbar gering Ist,
ίο die anderenfalls abgetrennt werden müßten, bevor der Sirup verwendet wenden kann.
Enzyme für die Isomerisierung von Glucose zu Fructose können von einer großen Zahl verschiedener Spezies von Mikroorganismen erhalten werden, wobei die Elgenschäften der Enzyme von Spezies zu Spezies unterschiedlich sind. Für die Verwendung In dem Isomerlslerungsprozeß kommen als Enzymeigenschaften der Stabilität bei hohen Temperaturen und der Aktivität be', niedrigen pH-Werten besondere Bedeutung zu.
Bei einer Enzym-Isomerlslerung von Glucose zu Fructose sind folgende Arbeltsbedingungen von Wichtigkeit: pH: Der pH-Wert soil mögllehsi niedrig sein, urn die durch Alkalien beschleunigte Bildung von Nebenprodukten zu vermelden; der pH-Wert soll deshalb unter 7 Hegen, vorzugsweise Im Bereich 5 und '/.
Temperatun Das Enzym soll bei einer Temperatur von etwa 55 bis etwa 75° C stabil sein; es handelt sich hierbei um die übliche Reaktionstemperatur.
Löslichkeit: In vielen Fällen Ist es erwünscht, die Mlkroorganlsmus-Zellen, welche das Enzym Intrazellular enthalten, für die Isomerisierung einzusetzen. Dleserhalb soll so wenig wie möglich des Enzyms In die Reaktionsmischung während der Isomerisierung oder während der Handhabung der Zellen nach der Isomerisierung übertreten. Es Ist weiterhin für die Erzeugung der Enzymaufbereltung von Wichtigkeit, daß sich die Zellen sehr leicht
In solcher Welse trocknen lassen, daß das Enzym nicht
aus den Zellen austritt.
Be! anderen Verfahren wird ein lösliches Enzym ver-
langt. Dieses kann entweder direkt eingesetzt oder aber es kann durch Bindung an einen unlöslichen Träger unlöslich gemacht werden. Hierbei 1st es wichtig, daß das
Enzym aus den Zellen leicht extrahiert werden kann. Da der Preisunterschied zwischen Glucose und Isome-
rlslerter Glucose sehr gering Ist, Ist es weiterhin von großer Wichtigkeit, daß die Produktionsausbeute an Enzym hoch Ist, so daß der Preis der Enzymaufbereitung genügend niedrig gehalten werden kann.
Es wird nun gefunden, daß nach der Isollerungsmethode der vorliegenden Erfindung c?4; Voraussetzung dafür geschaffen wird, den Organismus aus der Natur reproduzierbar und sehr schnell zu Isolieren, wodurch eine Glucose-Isrmerase erzeugt werden kann, die eine sehr gute Hitzebeständigkeit und ein Optimum bei einem sehr niedrigen pH-Wert besitzt.
Bei den In dieser Welse Isolierten Organismen handelt es sich um aerobe sporenblldende stäbchenförmige Bakterien. Sie müssen als eine thermophlle Baclllusspezies klassifiziert werden und lassen sich noch spezieller als
μ Stämme eines atypischen B. coagulans - zum Unterschied von einem typischen B, coagulans - aufgrund der Fähigkeit bei 650C zu wachsen und auf anorganischen Stlckstoffquellen ein Wachstum zu zeigen, Identifizieren. Die erfindungsgemäße Glucose-Isomerase Ist Im elnzelnen dadurch gekennzeichnet, daß sie
a) eine höhere Thermostabllltät besitzt als eine Glucose-Isomerase, die aus einer üblichen Bacillus coagulans-KultlvIerung stammt.
b) eine mindestens genauso gute Aktivität bei pH S bis 7 besitzt wie eine Glucose-Isomerase, die aus einer üblichen Bacillus coagulans-Kultlvlerung stammt, und
c) dadurch erhaltlich Ist, daß man Mikroorganismen-Quellen, wie beispielsweise Bodenproben, auf Medien, weiche lediglich Ammoniak als Stlckstot'fquelle, Xylose als Kohlenstoffquelle und die üblichen Spurenelemente In Form von anorganischen Salzen enthalten, wobei Agar In einer Konzentration von 1,5 bis 3% dem Medium zugegeben sein kann, bei einer Temperatur zwischen 60 und 65° C züchtet, die sich dabei entwickelnden Kolonien in einem Nährrmedlum der vorstehend angegebenen Zusammensetzung und bei der vonstehend angegebenen Temperatur reinigt, die dabei erhaltenen reinen Kulturen auf ihre Glucose-Isomerase-Aktlvität mittels eines halbquantitativen Tests untersucht, die Kulturen, die eine positive Reaktion zeigen, selektiert, diese selektierten Kulturen unter aeroben Bedingungen auf einem Nährmedlum, das eine Stlckstoffqueiie, eine Kohiensloffqueüe und geringe Mengen an anorganischen Salzen enthält, bei einem pH-Wert zwischen S und 9 und einer Temperatur zwischen 40 und 65° C kultiviert und die so gebildete Glucose-Isomerase gewinnt.
Folglich kann die erflndungsgemäßf Glucoso-Isomerase nach einem der vorstehend unter c) angegebenen Kennzeichnung entsprechende Verfahren erhalten werden. Die dabei zur Anwendung kommende Isolierungstechnik zielt letztlich auf die Schaffung von Bedingungen ab, welche ein schnj'les Wachstum der Mikroorganismen ermöglichen, so daß die Glucose-Isomerase in Industriellem Maßstab hergestellt werden kann.
Die Inkubation bei den genannten höheren Temperaturen, beispielsweise 600C, fördert das Wachstum von thermophllen Mikroorganismen. Die gesamte Klasse der Thermophllen besitzt das für die Industrielle Fermentatlonsprozesse verlangte schnelle Wachstum. Darüber hinaus sind die von den Thermophllen erzeugten Enzyme thermostabil.
Xylose bildet die Kohlensioffquelle, well alle bekannten Glucose-Isomerasen grundsätzlich als Xylose-Isomerasen angesehen werden können. Viele Organismen, die Xylose aufnehmen, enthalten Glucose-Isomerasen. Es geht deshalb darum, diejenigen Organismen zu selektieren, die Xylose als einzige Kohlenstoffquelle verwerten können.
Ammoniak als anorganische Stickstoffquelle wird deshalb verwendet, um solche Mikroorganismen auszusondern, die organischen Stickstoff verlangen, wozu bemerkenswerteirwelse auch B. coagulans gehört, eine Mlkroorganlsmus-Slpezles, auf die Im übrigen all die Bedingungen des Selektlerungsprogramms passen. Tatsächlich gibt B. coagulans eine bekannte Quelle für Glucose-Isomerase guter Qualltat ab, die eine verhältnismäßig gute Hltzestabllltat und bei einem niedrigen pH sowohl hinsichtlich Aktivität und Stabilität ein Optimum besitzt. Leider liegen jedoch die Kosten für die Kultivierung von B. coagulans hoch, well für das Wachstum Vitamine und Aminosäuren notwendig sind.
Die Mikroorganismen, die durch die oben beschriebene Selektion Isoliert werden, besitzen eine Reihe von gemeinsamen Eigenschaften und dürften deshalb auch einer einzigen Spezies zuzurechnen sein. Jedoch scheint die In Fra,|(e stehende Spezies die von B. coagulans zu sein. Eine sinnfällige Identität zwischen B. coagulans und den Mikroorganismen nach der vorliegenden Erfindung 1st nicht überraschend, da die Selektlerungsbedlngungen so nahe bei denjenigen für die Selektierung von B. coagulans Hegen, daß zu erwarten Ist, daß sehr ähnliche Mikroorganismen erhalten werden. Darüber hinaus handelt es sich bei B. coagulans um eine sehr dürftig definierte Spezies mit einer Reihe von bereits bekannten Untergruppen, In der Literatur wird eingeräumt, daß eine intensive Erforschung von B. coagulans zu der Feststellung führen könnte, daß B. coagulans eine Rahe verschledener Spezies von miteinander verwandten Mikroorganismen umfaßt. Bis zu einer endgültigen Untersuchung von B. coagulans hat sich die Aussage über den erflndungsgemSß verwendeten Mikroorganismus darauf zu beschränken, daß es sich um einen atypischen B.
is coagulans handelt, dessen atypisches Verhalten dadurch gekennzeichnet ist, daß er bei 65° C und auf anorganischen Stickstoffquellen Wachstum zeigt.
Ein für die vorliegende Erfindung wichtiges biochemisches Unterscheidungsmerkmal besteht darin, dall das Glucose-Isomerase-Enzym des atypischen B. coagulans sich von der Glucose-Isomerase des (typischen) B. coagülanH besonders hinsichtlich der thermischen Stabilität und des Einflusses des pH und der Temperatur auf die Aktivität unterscheidet. Die erfindungsgemäße GIucose-Isomerase besitzt eine höhere Thermostabllltät und ihre Aktivität bei pH S bis 7 Ist genauso gut, wenn nicht sogar besser. Insgesamt kann gesagt werden, daß es sich um ein verschiedenes En2ym handelt.
Für die Erzeugung der erfindungsgemäßen Glucose-
Isomerase werden die Bakterien unter aeroben Bedingungen auf Medien kultiviert, weiche die üblichen Salze und Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen bei einem pH zwischen S und 9 enthalten. Die Zugabe von Xylose oder Xylose enthaltenden Substanzen zu dem Medium ist notwendig, um die Bildung von Glucose-Isomerase In den wilden Stämmen zu Induzieren. Es Ist jedoch möglich, Mutanten zu Isolieren, die Glucose-Isomerase ohne eine Induktion durch Xylose erzeugen. Wenn solche Mikroorganismen kultiviert werden, kann Irgendeine metabollslerbare Kohlenstoffquelle verwendet werJen.
Die Inkubationstemperatur für die Fermentation Hegt zwischen 40 und 650C, normalerweise bei 500C. Die aeroben Bedingungen während der Kultivierung werden durch Einblasen von Luft durch das Medium geschaffen, beispielsweise mit einer Geschwindigkeit von annähernd einem Volumenteil Luft auf ein Volumenteil Flüssigkeit pro Minute.
Das Enzym wird Intrazellular gebildet und das Reinigungsverfahren besteht normalerweise darin, daß die ZeI-len durch Zentrifugleren oder Filtrieren angesammelt werden und der Zellbrei gegebenenfalls durch Lyophlllsleren, Sprühtrocknen oder Irgendein anderes Verfahren, das d'.e Enzymaktivität nicht beeinträchtigt, getrocknet wird. Vor der Trocknung können die Zellen mit Lösungen von Kobaltsalzen behandelt werden, so daß die Enzymaufbereitung eine gewisse Menge von Co" enthält, was für die Aktivierung des Enzyms notwendig 1st. Die angesammelten Zellen können weiterhin bei einer Temperatur zwischen annähernd 70 bis 8O0C während einer Zelt, die für die Zerstörung der lytlschen Enzymsysteme Innerhalb der Zellen ausreicht, wärmebehandelt werden.
Während der Kultivierung kann die Menge an Glucose-Isomerase In den Zellen In Intervallen durch Bestimmung der Menge an Fructose, die unter Standardbedingungen aus Glucose gebildet wurde, gemessen werden. Wenn sich kein Anstieg In der Aktivität mehr zeigt, können die Zellen gesammelt werden.
24 OO
Wenn ein lösliches Enzymprodukt gewünscht wird, KCl
wird es möglich sein, die Fermentation so auszuführen, FeSO4
daß der grollte Anteil des Enzyms aus den Zellen In die Agar
Fermentatlonsbrflhe austritt. Dies kann beispielsweise Xylose
durch Anheben der Temperatur auf 60" C wahrend der gesamten Fermentationsdauer oder lediglich während deren letzter Phase erreicht werden.
Aus dieser Brühe kann eine Enzymaufbereitung nach den üblichen Verfahren für die Aufbereitung von extrazellularen Enzymen erhalten werden, also durch ReInI-gen der Brühe durch Zentrifugleren oder Filtrieren und Konzentrieren der enzymhaltigen Lösung durch Eindampfen oder Umkehrosmose, wobei ein flüssiges Enzymprodukt erhalten wird, oder durch Ausfällen des Enzyms aus der Brühe oder der konzentrierten Brühe durch Salze oder wasserlösliche Lösungsmittel und anschließendem Trocknen des Niederschlags.
Ein lösliches Enzym läßt sich auch dadurch aus den Isolierten Zellen erhalten, daß diese einer Autolyse durch Zugabe von lytlschen Enzymen, beispielsweise Lysozym oder durch Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln, ausgesetzt werden oder durch mechanisches Aufreißen der Zellen, beispielsweise durch Anwendung vor' Ultraschall oder von mechanischen Homogenisierungseinrichtungen. Aus den In solcher Welse behandelten Zellen können Enzymaufbereitungen nach den oben beschriebenen Methoden erhalten werden.
Normalerwelse produzieren die Mikroorganismen während der Fermentation eine Reihe von Sporen. Wenn eine sporenfreie Aufbereitung gewünscht wird, sollte für die Kultivierung eine asporogene Mutante eingesetzt werden. Verfahren für die Isolierung von asporogenen Mutanten sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt und es 1st einfach, eine solche Mutantentype zu Isolieren.
Die erfindungsgemäße Enzymaufbereitung kann gegebenenfalls In eine Matrix eingebettet oder nach Irgendeinem bekannten Verfahren, welches die Enzymaktivität nicht beeinträchtigt, Insolublllsiert werden.
Das durch die Erfindung geschaffene Enzym besitzt Eigenschaft.η, welche für eine Glucose-Isomerislerung unter günstigen kommerziellen Bedingungen eines pH S bis 7 sehr vorteilhaft sind. Es kann zwischen SS bis 850C ohne wesentlichen Aktivitätsverlust bis herab zu pH-Werten von etwa 5,0 eingesetzt werden. Es Ist äußerer- 4s dentllch hitzestabil; es behalt Im wesentlichen seine Aktivität bei 85°C über den gesamun pH-Bereich von 5 bis 7. Demgegenüber verliert die bekannte Glucose-Isomerase von B. coagulans Ihre Aktivität bei Temperaturen oberhalb 7O0C; bei 85° C Ist fast überhaupt keine Aktivltat mehr vorhanden. Die überlegenen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms ergeben sich auch aus der Wirtschaftlichkeit, mit eier der Mikroorganismus auf anorganischem Stickstoff kultiviert werden kann.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von einigen Beispielen beschrieben.
Beispiel I
0,5
0,01
20
wurde gesondert Im Autoklaven behandelt und unter aseptischen Bedingungen erst vor dem Ausgießen auf die Schalen zugegeben.
Die Schalen wurden bei 60 bis 65° C während zwei Tagen Inkubiert und die Kolonien, die sich dabei entwlkkelt haben, auf ein Medium übertragen, dessen Zusammensetzung nachfolgend In Gramm pro Liter destilliertem Wasser angegeben Ist:
Pepton 10
Trypton 5
Hefeextrakt 3
Na2HPO4, 12H2O 18
MgSO4, 7H2O 0,2
KH2PO4 7
Agar 20
Xylose 10-20
wurde gesondert Im Autoklaven behandelt und unter aseptischen Bedingungen erst vor dem Ausgießen auf die Schalen zugegeben.
Wenn die Kultur unrein erschien, wurde sie wieder auf das eiste Medium gebracht und dann wieder auf das kräftigere Medium überführt. Dies wurde so oft wiederholt, bis eine reine Kultur erhalten wurde.
Die Kulturen auf dem kräftigeren Medium wurden während 1 bis 2 Tagen bei 6O0C Inkubleit und dann auf ihre Fähigkeit, Glucose zu Fructose zu Isomerisleren, In folgender Welse untersucht:
Die Zellen wurden In 0,9S6Iger NaCl-Lösung suspendiert. 1 ml der Zellsupension wurde bei 7O0C mit 1 ml folgender Lösung inkubleit:
Glucose 80 g/l
TRIS 0,1 mol/i
Chloroform 2 ml
MgSO4, 7H2O 5 g/I
CoCl2, 6H2O 0,5 g/l
pH wurde mit HCl auf 6,5 eingestellt.
Nach 4 Stunden Inkubationszeit wurde ein Tropfen der Reaktionsmischung mit einer Pasteur-Pipette auf einen Streifen Chromatographiepapier (Whatman No. 1) überführt. Die Tropfen wurden In solcher Weise aufgebracht, daß für 50 bis 100 Tropfen pro Papierstreifen Platz war. Nach dem Trocknen wurde das Papier mit einer Lösung folgender Zusammensetzung angefeuchtet:
Naphtallndlol 1,3
Äthanol
kern. HCl
250 mg
250 ml
20 ml
Isolierung von Glucose-Isomerase erzeugenden Organismen aus der Natur
Eine 10%lge Suspension von Gartenerde in sterilem Wasser wurde auf Schalen ausgebreitet, die ein Agarmedlum enthielten, dessen Zusammensetzung nachfolgend In Gramm pro Liter destilliertem Wasser angegeben Ist:
(NH4J2SO4 3
K2HPO4 1
MgSO4,7H3O 0,5
Nach dem Trocknen während mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Papier bei 60° C während 1 bis 20 Minuten erhitzt. Wenn die Reaktionsmischung wenigstens 0,5% Fructose enthielt, wurde nach dieser Behandlung ein brauner Fleck sichtbar.
Es wurden 18 Kulturen Isoliert, die bei dem vorstehenden Test eine positive Reaktion zelgter. L)Ie Kulturen wurden hinterlegt bei dem Northern Regional Research Laboratory, Peorla, Illinois, USA (NRRL) unter den Nummern NRRL L-5649 bis NRRL B-5666.
Diesen Stämmen waren folgende Eigenschaften gemeinsam:
Morphologie:
Es bestand eine Ähnlichkeit zu der Spezies In B. subtl-Hs Gruppe.
Biochemische Reaktion:
Wachstumstemperatur: 40 bis 650C mit optimalem Bereich zwischen 55 bis 6O0C.
Das Wachstum wurde durch hohe Konzentrationen an Protein (oberhalb 3%) und Kohlehydraten (1%) Inhibiert. Aus Glucose, Xylose, Fructose, Rlbose und Glucerol (keine Gasbildung) wird Säure erzeugt. Arablnose wird nicht fermentiert.
Kein Wachstum In 3%lger NaCI-Lösung. Wachstum bei pH 5,7: positiv.
Das Wachstum auf Glucose-Nähragar Ist besser als das Wachstum auf Nähragar. Gutes Wachstum auf Sojabohnenagar.
Die Hydrolyse von Kasein und Stärke Ist bei 40° C
Stamme NRRL Nr.
VUmwandlung
5649
5650
"> 5651
5652
5653
5654
5655
ι» 5656
5657
5658
5659
5660
i-> 5661
5662
5663
5664
aittwciiii uuci
ιιαιιι einem ?* anoiuin
500C.
Negative Hydrolyse von Gelatine.
Anaerobes Wachstum In Glucosemedlum: negativ (schwach).
Beispiel Il Herstellung von Glucose-Isomerase In Schuttelflaschen
In verschlossenen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben wurden 100 ml eines Mediums folgender Zusammensetzung hergestellt (In Gramm pro Liter Leitungswasser):
JOOJ
5666
35
44
42
44
47
44
50
42
42
38
38
42
42
51
42
44
42
47
Maismische 80
Hefeextrakt 5
K2HPO4 1
(NH4)JSO4 5
Xylose 4
MgSO4, 7H2O 0,2
MnSO4, H2O 0,05
Xylose, MgSO4 und MnSO4 wurden gesondert Im Autoklaven behandelt und unter aseptischen Bedingungen nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur zugegeben. Der pH-Wert wurde unter aseptischen Bedingungen mit sterilisierter 4N NaOH auf 7,0 eingestellt.
Die Kolben wurden mit jeweils 1 ml einer Zellsuspenslon In sterilem destilliertem Wasser okuliert, wobei die Zellen durch Abnahme von Wachstum von geneigten Kulturen auf dem lh Beispiel 1 beschriebenen kräftigeren Medium erhalten werden.
Die okulierten Kolben wurden auf einem sich drehenden Schütteltisch (220 U/mln) bei 50° C Inkubiert. Nach 40stündlger Inkubation w .irden die Inhalte der Flaschen zentrifugiert und die In der Ausfällung enthaltenen Zellen für die Isomerisierung von Glucose In folgender Welse eingesetzt:
In einem Reaktor, der mit einem Thermostat, einer Stickstoffatmosphäre, einer pH-Kontrolle und einer Rühreinrichtung ausgestattet war, wurden 0,5 Liter einer 40%lgen (gewlchtsantelllg) Lösung von Dextrose In destilliertem Wasser, dem 0,5 g MgSO4 · 7H2O und 0,05 g CoSO4 · H2Q zugesetzt war, gegeben.
Zu dieser Lösung wurde Glucose-Isomerase, die Zellen aus 1 Liter des Mediums enthielt, zugegeben. Der Isornertslerungsprozeß fand unter folgenden Bedingungen statt: Temperatur 8O0C; pH: 6,2; Zeltdauer. 10 Stunden.
Die Menge der gebildeten Fructose wurde polarimetrisch festgestellt, wobei der Isomerlslerungsgrad In % gebildeter Fructose/% anfänglicher Dextrose ausgedrückt wurde. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Beispiel III
Thermophller Bacillus NRRI. Nr. 5650 wurde über Nacht In einer Nährbrühe bei 48°C kultiviert. ImI dieser Kultur wurde In einen 500 ml verschlossenen Erlenmeyer-Kolben überfuhrt, der 100 ml eines Mediums enthielt, dessen Zusammensetzung nachfolgend In Gramm pro U,er destilliertes Wasser angegeben Ist:
Na2HPO4, 2H2O 9
KH2PO4 7
MgSO4, 7H2O 0,5
KCI 0,5
FeSO4 0,01
Antischaummittel 0,1
(NH4)JSO4 3
Xylose 5
wurde gesondert Im Autoklaven behandelt
und vor der Okulierung unter aseptischen Bedingungen zugesetzt.
Die Flasche wurde auf einem sich drehenden Schütteltisch bei 480C während 1 bis 2 Tagen Inkubiert.
Die Glucose-Isomerlslerungsaktlvltät wurde wie In Beispiel II beschrieben ermittelt; das Ergebnis lag bei 32% Umwandlung.
Beispiel IV
Isolierung von Bakterienmutanten, die eine Glucose-Isomerlslerungsaktlvltät In xylosefreien Medien zeigen
Logarithmisch wachsende Zellen In einer Nährbrühe wurden gesammelt und In TRIS-Maleat-Puffer pH 0,6, der 100 Mlkrogramm N-Methyl-N'-nltro-N-nltrosoguanldln pro ml enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei 370C während 30 Minuten Inkubiert, wonach die Zellen gewaschen, mit Wasser verdünnt und auf Nähragar enthaltenen Petrischalen ausgebreitet wurden.
Nach 1 bis 2 Tagen bei 50 bis 6O0C wurden Kolonien der Mutantenstämme auf Petrischalen überführt, die ein xylosefreles Medium enthielten, dessen Zusammensetzung nachfolgend in Gramm pro Liter destilliertem Wasser angegeben Ist:
Hefeextrakt 30
Agar 20
Die Schalen wurden solange Inkubiert, bis ein gutes Wachstum (1 bis 2 Tagen) erhalten wurde. Hiernach wurde die Glucose-Isomeraseaktlvltät der Kolonien nach der einfachen Methode, wie sie In Beispiel I beschrieben 1st, bestimmt.
Die Zahl der ermittelten Mutanten war hoch; etwa eine . In den 2000 bis 3000 gestesteten Kolonien.

Claims (3)

24 OO 323 Patentansprüche:
1. Glucose-Isomerase, dadurch gekennzeichnet, daß sie
a) eine höhere Thermostabllltflt besitzt als eine Glucose-Isomerase, die aus einer üblichen Bacillus coagulans-KultlvIerung stammt,
b) eine mindestens genauso gute Aktivität bei pH S bis 7 besitzt wie eine Glucose-Isomerase, die aus einer üblichen Bacillus coagulans-KuItlvlerung stammt, und
c) dadurch erhältlich 1st, daß man Mlkroorganlsmen-Quel!en auf Medien, welche lediglich Ammlnlak als Stickstoffquelle, Xylose als Kohlenstoffquelle und die üblichen Spurenelemente In Form von anorganischen Salzen enthalten, wobei Agar In einer Konzentration von 1,5 bis 3% dem Medium zugegeben sein kann, bei einer Temperatur zwischen 60 und 65" C züchtet, die sich dabei entwickelnden Kolonien in einem Nährmedium der vöfsiehend angegebenen Zusammensetzung und bei der vorstehend angegebenen Temperatur reinigt, die dabei erhaltenen reinen Kulturen auf Ihre Glucose-Isomerase-Aktlvitat mittels eines halbqnantltatlven Tests untersucht, die Kulturen, die eine positive Reaktion zeigen, selektiert, diese selektierten Kulturen unter aeroben Bedingungen auf einem Nährme-(ilum, das eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle und geringe Mengen an anorganischen Salzen enthält, bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9 und einer Temperatur zwischen 40 und 650C kultiviert und die so gebildete Glucose-Isomerase gewinnt.
2. Verfahren zur Herstellung der Glucose-Isomerase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen-Quellen auf Medien, welche lediglich Ammoniak als Stickstoffquelle, Xylose als Kohlenstoffquelle und die üblichen Spurenelemente In Form von anorganischen Salzen enthalten, wobei Agar In einer Konzentration von 1,5 bis 3« dem Medium zugegeben sein kann, bei einer Temperatur zwischen 60 und 65° C züchtet, die sich dabei entwickelnden Kolonien In einem Nährmedium der vorstehend angegebenen Zusammensetzung und bei der vorstehend angegebenen Temperatur reinigt, die dabei erhaltenen reinen Kulturen auf Ihre Glucose-Isomerase-Aktivität mittels eines halbquantitativen Tests untersucht, die Kulturen, die eine positive Reaktion zeigen, selektiert, diese selektierten Kulturen unter aeroben Bedingungen In einem Nährmedlum, das eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle und geringe Mengen an anorganischen Salzen enthalt, bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9 und einer Temperatur zwischen 40 und 65° C kultiviert und die so gebildete Glucose-Isomerase gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der aeroben Kultivierung der selektierten Kulturen eine Kohlenstoffquelle einsetzt, die Xylose enthalt.
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