JPS58209990A - アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法 - Google Patents
アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アデノシン−リン酸（以下ＡＭＰという）を
アデノシンニリン酸（以下ＡＴＰという）へ変換する方
法に関するものである。
アデノシンニリン酸（以下ＡＴＰという）へ変換する方
法に関するものである。
生体内において、生命を維持するだめに数多くの生合成
反応が酵素を触媒として営まれている。
反応が酵素を触媒として営まれている。
それらのうち、特に重要な結合反応を行うに当ってはＡ
ＴＰがエネルギー源又は補助因子として必要である。こ
の際、ＡＴＰはエネルギー源または補助因子として働い
たのち、アデノシンニリン酸（以下ＡＤＰという）又は
ＡＭＰに分解され、消費されてしまうことになる。一方
、最近、生体内の反応を工業的に工場内の反応器中で再
現しようとする試みが盛んに行われるようになってきて
いる。これは近代化学工業の見直しから生体内反応の省
エネルギー性、無公害性などが注目されるようになった
ものであり、特にファインケミカルの分野において必須
の技術になろうとしており、加水分解反応、異性化反応
などの技術分野においてはすでに実用化が成功している
。しかし、結合反応においては上述のようＩｃＡＴＰと
いう高価な物質をエネルギー源または補助因子として消
費するだめに少なくとも経済的には成り立ち得ないとい
う問題点が実用化を妨げている。すなわち、 ＡＴＰが
消費された産物であるＡＤＰ、ＡＭＰ、特に最低のエネ
ルギーレベルに消費されつくしたＡＭＰをＡＴＰに再生
変換することがこの問題点を打開する重要な技術となる
のである。
ＴＰがエネルギー源又は補助因子として必要である。こ
の際、ＡＴＰはエネルギー源または補助因子として働い
たのち、アデノシンニリン酸（以下ＡＤＰという）又は
ＡＭＰに分解され、消費されてしまうことになる。一方
、最近、生体内の反応を工業的に工場内の反応器中で再
現しようとする試みが盛んに行われるようになってきて
いる。これは近代化学工業の見直しから生体内反応の省
エネルギー性、無公害性などが注目されるようになった
ものであり、特にファインケミカルの分野において必須
の技術になろうとしており、加水分解反応、異性化反応
などの技術分野においてはすでに実用化が成功している
。しかし、結合反応においては上述のようＩｃＡＴＰと
いう高価な物質をエネルギー源または補助因子として消
費するだめに少なくとも経済的には成り立ち得ないとい
う問題点が実用化を妨げている。すなわち、 ＡＴＰが
消費された産物であるＡＤＰ、ＡＭＰ、特に最低のエネ
ルギーレベルに消費されつくしたＡＭＰをＡＴＰに再生
変換することがこの問題点を打開する重要な技術となる
のである。
このような観点から、ＡＴＰの再生変換に関する研究が
種々行われている。たとえば、生体内では解糖系の反応
などによりＡＴＰの生産が行われているので、これを利
用した試みが知られている。
種々行われている。たとえば、生体内では解糖系の反応
などによりＡＴＰの生産が行われているので、これを利
用した試みが知られている。
すなわち、微生物菌体を用いて消費されたＡＴＰの再生
補給を行うというものなどがある。しかし。
補給を行うというものなどがある。しかし。
これは副反応の併発、変換効率の悪さなどの点で実用の
レベルには達していない。
レベルには達していない。
一方、耐熱性の酵素ではないが、ＡＴＰ変換酵素の利用
も試みられている。たとえば、ホワイトサイズらはアデ
ノシンを酵素的に変換して得たＡＭＰを大大腸菌のアデ
ニル酸キナーゼおよび酢酸キナーゼでＡＴＰに変換して
いる（ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティ、 ｉｏ。
も試みられている。たとえば、ホワイトサイズらはアデ
ノシンを酵素的に変換して得たＡＭＰを大大腸菌のアデ
ニル酸キナーゼおよび酢酸キナーゼでＡＴＰに変換して
いる（ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティ、 ｉｏ。
巻、１号、３０４頁、 １９７８年）。さらに、ホワイ
トサイズらは大腸菌の上記両酵素をブロムシアンで固定
化し、ＡＭＰからＡＴＰへの連続変換を試みているが、
安定化剤非存在下では活性残存率は数パーセント以下に
すぎず、また長期安定性もすこぶる悪かつたことを報告
している（エンザイム・エンジニアリング、２巻、２１
７頁、 １９７４年、イー・ケー・パイら編、プレナム
プレス）。しかも。
トサイズらは大腸菌の上記両酵素をブロムシアンで固定
化し、ＡＭＰからＡＴＰへの連続変換を試みているが、
安定化剤非存在下では活性残存率は数パーセント以下に
すぎず、また長期安定性もすこぶる悪かつたことを報告
している（エンザイム・エンジニアリング、２巻、２１
７頁、 １９７４年、イー・ケー・パイら編、プレナム
プレス）。しかも。
固定化酵素を用い、安定化剤を添加しても１反応に長時
間を要し、変換効率もあまり高く々い上に。
間を要し、変換効率もあまり高く々い上に。
化学工業的なレベルでの長期間の運転には利用できない
ものである。
ものである。
本発明者らは、特に最低のエネルギーレベルに分解した
産物であるＡＭＰをＡＴＰに変換再生することにつき鋭
意研究した結果、最適生育温度が５０℃ないし８５℃で
ある微生物の産生ずる変換酵素を使用すると、短時間、
高収率で長期間安定してＡＭＰをＡＴＰに変換できるこ
とを見い出し。
産物であるＡＭＰをＡＴＰに変換再生することにつき鋭
意研究した結果、最適生育温度が５０℃ないし８５℃で
ある微生物の産生ずる変換酵素を使用すると、短時間、
高収率で長期間安定してＡＭＰをＡＴＰに変換できるこ
とを見い出し。
先に特許出願した（特願昭５７−１０３３７号）。しか
しながら、この方法では、ＡＭＰとＡＴＰの濃度比を１
：１の付近で実施しており、そのため。
しながら、この方法では、ＡＭＰとＡＴＰの濃度比を１
：１の付近で実施しており、そのため。
高価なＡＴＰを多数に使用しなければならず、化学工業
的レベルでのＡＴＰＯ連続変換は経済的に好ましくない
。しかも、ときにはＡＴＰへの変換率が変動する現象も
みられた。
的レベルでのＡＴＰＯ連続変換は経済的に好ましくない
。しかも、ときにはＡＴＰへの変換率が変動する現象も
みられた。
そこで本発明者らは、この点を改良するためＫさらに鋭
意研究した結果、ＡＭＰとＡＴＰの混合比を特定の条件
に制御すると、安価で、かつ操作性良く長期間安定して
Ａ Ｍ Ｐを実質−Ｆはとんど１００％ Ａ Ｔ Ｐに
変換できることを見い出し１本発明を完成した。
意研究した結果、ＡＭＰとＡＴＰの混合比を特定の条件
に制御すると、安価で、かつ操作性良く長期間安定して
Ａ Ｍ Ｐを実質−Ｆはとんど１００％ Ａ Ｔ Ｐに
変換できることを見い出し１本発明を完成した。
すなわち１本発明は最適生育温度が５０’Ｃないし８５
℃である微生物の産生ずるアデノシン−リン酸をアデノ
シンニリン酸に変換する酵素又はアデノシンニリン酸を
アデノシンニリン酸に変換する酵素を固定化し、得られ
たアデノシン−リン酸をアデノシンニリン酸に変換する
固定化酵素及びアデノシンニリン酸をアデノシンニリン
酸に変換する固定化酵素を組み合わせてアデノシン−リ
ン酸をアデノシンニリン酸に変換させるに際し、アデノ
シンニリン酸の濃度を下記（イ）式を満足する条件に制
御することを特徴とするアデノシン−リン酸のアデノシ
ンニリン酸への変換方法である。
℃である微生物の産生ずるアデノシン−リン酸をアデノ
シンニリン酸に変換する酵素又はアデノシンニリン酸を
アデノシンニリン酸に変換する酵素を固定化し、得られ
たアデノシン−リン酸をアデノシンニリン酸に変換する
固定化酵素及びアデノシンニリン酸をアデノシンニリン
酸に変換する固定化酵素を組み合わせてアデノシン−リ
ン酸をアデノシンニリン酸に変換させるに際し、アデノ
シンニリン酸の濃度を下記（イ）式を満足する条件に制
御することを特徴とするアデノシン−リン酸のアデノシ
ンニリン酸への変換方法である。
（但し、ＡＭＰはアデノシン−リン酸の濃度（ｍＭ）。
ＡＴＰはアデノシンニリン酸の濃度（ｍＭ ）を表し。
γはアデノシンニリン酸をアデノシンニリン酸に変換す
る酵素の固定化酵素活性とアデノシン−リン酸をアデノ
シンニリン酸に変換する酵素の固定化酵素活性との比で
、１以上り正数を表わす。）本発明は、ＡＭＰをＡＤＰ
に変換することと。
る酵素の固定化酵素活性とアデノシン−リン酸をアデノ
シンニリン酸に変換する酵素の固定化酵素活性との比で
、１以上り正数を表わす。）本発明は、ＡＭＰをＡＤＰ
に変換することと。
ここで生成したＡＤＰをＡＴＰに変換することから成り
、ＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素としては。
、ＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素としては。
例えば、アデニル酸キナーゼが使用され、この際Ａ Ｍ
ｌ）へのリン酸供与体としてＡＴＰが使用される。次
いでＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素としては１例えば、
酢酸キナーゼ、カルバミン酸キナーゼ、クレアチンキナ
ーゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、ポリリン酸キナーゼなど多くのものが使用でき
るが、リン酸供与体の価格、ＡＴＰへの変換活性、酵素
の入手の容易さなどを勘案すると酢酸キナーゼを使用す
るのが最も有利であり、この際リン酸供与体としてはア
セチルリン酸が使用される。このように、アデニル酸キ
ナーゼと酢酸キナーゼを使用するに際して各酵素のリン
酸供与体としてはＡＴＰとアセチルリン酸を使用するこ
とになるが、リン酸供与体としてのＡＴＰは最終変換物
であるＡＴＰを循環使用することができるので、結局リ
ン酸供与体としてはアセチルリン酸だけを供給ずｈばよ
いことになる。このようなシステム化により効率的な設
計がはかれるのもこれら両酵素の利点である。
ｌ）へのリン酸供与体としてＡＴＰが使用される。次
いでＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素としては１例えば、
酢酸キナーゼ、カルバミン酸キナーゼ、クレアチンキナ
ーゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、ポリリン酸キナーゼなど多くのものが使用でき
るが、リン酸供与体の価格、ＡＴＰへの変換活性、酵素
の入手の容易さなどを勘案すると酢酸キナーゼを使用す
るのが最も有利であり、この際リン酸供与体としてはア
セチルリン酸が使用される。このように、アデニル酸キ
ナーゼと酢酸キナーゼを使用するに際して各酵素のリン
酸供与体としてはＡＴＰとアセチルリン酸を使用するこ
とになるが、リン酸供与体としてのＡＴＰは最終変換物
であるＡＴＰを循環使用することができるので、結局リ
ン酸供与体としてはアセチルリン酸だけを供給ずｈばよ
いことになる。このようなシステム化により効率的な設
計がはかれるのもこれら両酵素の利点である。
以上のように、二種類の変換酵素を使用することにより
Ａ、ＭＰをＡＴＰに変換することが可能になるが、これ
ら酵素は最適生育温度が５０℃ないし８５℃である微生
物の産生ずる酵素であることが必要である。このような
微生物としては、バチルス・ステアロサーモフィルス、
バチルス・プレビス。
Ａ、ＭＰをＡＴＰに変換することが可能になるが、これ
ら酵素は最適生育温度が５０℃ないし８５℃である微生
物の産生ずる酵素であることが必要である。このような
微生物としては、バチルス・ステアロサーモフィルス、
バチルス・プレビス。
バチルス・コアギユランス、バチルス・サーモプロテオ
リティクス、バチルス・アシドカルダリウスなどのバチ
ルス属の微生物、クロストリジウム属の微生物、サーモ
アクチノマイセス属の微生物。
リティクス、バチルス・アシドカルダリウスなどのバチ
ルス属の微生物、クロストリジウム属の微生物、サーモ
アクチノマイセス属の微生物。
アクロモバクタ−属の微生物、ストレプトマイセス属の
微生物、ミクロポリスボラ属の微生物、サーマス・アク
アティクス、サーマス・ザーモフィルス、サーマス・フ
ジブスなどのサーマス属の微生物、ザーモミクロビウム
属の微生物、カルブリア属の微生物などがあげられる。
微生物、ミクロポリスボラ属の微生物、サーマス・アク
アティクス、サーマス・ザーモフィルス、サーマス・フ
ジブスなどのサーマス属の微生物、ザーモミクロビウム
属の微生物、カルブリア属の微生物などがあげられる。
また、これら微生物の遺伝子を導入した常温生育微生物
も含まれる。なお、これら微生物の中でもアデル酸キナ
ーゼ、酢酸キナーゼの両酵素の産生に特に適したものは
バチルス・ステアロサーモフィルスである。
も含まれる。なお、これら微生物の中でもアデル酸キナ
ーゼ、酢酸キナーゼの両酵素の産生に特に適したものは
バチルス・ステアロサーモフィルスである。
この微生物から得られる両酵素は精製が容易であり、比
活性が高い。
活性が高い。
本発明において、上記酵素を固定化して使用する。その
ためには、酵素を適当な担体、たとえばセルロース、デ
キストラン、アガロースなどのような多糖類の誘導体、
ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重合体、架橋ポ
リアクリルアミドなどのようなどニルポリマーの誘導体
、Ｌ−アラニン−し−グルタミン酸共重合体、ポリアス
パラギン酸などのようなポリアミノ酸またはポリアミド
の誘導体、ガラス、アルミナ、ヒドロキシアパタイトな
どのような無機物の誘導体などに結合、包括あるいは吸
着せしめればよく、これをカラムなどの反応器に充填し
て使用すればよい。
ためには、酵素を適当な担体、たとえばセルロース、デ
キストラン、アガロースなどのような多糖類の誘導体、
ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重合体、架橋ポ
リアクリルアミドなどのようなどニルポリマーの誘導体
、Ｌ−アラニン−し−グルタミン酸共重合体、ポリアス
パラギン酸などのようなポリアミノ酸またはポリアミド
の誘導体、ガラス、アルミナ、ヒドロキシアパタイトな
どのような無機物の誘導体などに結合、包括あるいは吸
着せしめればよく、これをカラムなどの反応器に充填し
て使用すればよい。
本発明の実施にあたって、ＡＭＰをＡＴＰに変換すると
きの温度としては、常温伺近ないし酵素産生微生物の最
適生育温度の５℃以下に設定するのが好ましい。まだ、
ＡＭＰをＡＴＰに変換するときのＰＨとしては、中性付
近、すなわち６．５〜１１、好ましくは６．５〜９．０
．さらに好ましくは７〜８の範囲が使用される。緩衝液
としては、これらのＰ Ｈに適した通常のものを使用す
ることができる。たとえば７付近では、リン酸塩、イミ
ダゾール塩、トリス塩酸塩、コリジン塩、バルビタール
塩酸塩などをあげることができる。また、アデニル酸キ
ナーゼと酢酸キナーゼの反応をより効果的に進行させる
ために２種々の２価金属イオンを使用することができる
が、２価金属イオンとしては、たとえば、マグネシウム
イオン、マンガンイオンが特に推奨される。
きの温度としては、常温伺近ないし酵素産生微生物の最
適生育温度の５℃以下に設定するのが好ましい。まだ、
ＡＭＰをＡＴＰに変換するときのＰＨとしては、中性付
近、すなわち６．５〜１１、好ましくは６．５〜９．０
．さらに好ましくは７〜８の範囲が使用される。緩衝液
としては、これらのＰ Ｈに適した通常のものを使用す
ることができる。たとえば７付近では、リン酸塩、イミ
ダゾール塩、トリス塩酸塩、コリジン塩、バルビタール
塩酸塩などをあげることができる。また、アデニル酸キ
ナーゼと酢酸キナーゼの反応をより効果的に進行させる
ために２種々の２価金属イオンを使用することができる
が、２価金属イオンとしては、たとえば、マグネシウム
イオン、マンガンイオンが特に推奨される。
本発明でＡＭＰをＡＴＰに変換するには１例えば、ＡＭ
Ｐを０．１μＭ〜４Ｍ、好ま１シクけ１μＭ〜２Ｍ、さ
らに好ましくは１０μＭ〜５００ｍＭ、アセチルリン酸
をｏ、ｉμＲ４〜５００ｍＭ 、好捷しくは１μＭ〜４
ｏ。
Ｐを０．１μＭ〜４Ｍ、好ま１シクけ１μＭ〜２Ｍ、さ
らに好ましくは１０μＭ〜５００ｍＭ、アセチルリン酸
をｏ、ｉμＲ４〜５００ｍＭ 、好捷しくは１μＭ〜４
ｏ。
ｍＭ、さらに好ましくは１０μＭ〜３００ｎｓＭ、およ
びＡＴＰを（イ）式を満足する眠を充填層型反応器の一
端から供給し９反応器内でＡＭＰ−＋ＡＤＰ−）ＡＴＰ
の変換を行わしめることができる。そのときに反応器か
ら溶出した反応液を適当な分析システムで分析し、ＡＭ
Ｐ、ＡＤＰ、ＡＴＰの各濃度およびＡＴＰへの変換率を
求めることができる。このとき、流速としては１反応器
の大きさにより異なるが、たとえば、０．３μｔ／時間
からｌＸｌ０ｔ／時間の間の適当な流速を選定すること
ができる。また。
びＡＴＰを（イ）式を満足する眠を充填層型反応器の一
端から供給し９反応器内でＡＭＰ−＋ＡＤＰ−）ＡＴＰ
の変換を行わしめることができる。そのときに反応器か
ら溶出した反応液を適当な分析システムで分析し、ＡＭ
Ｐ、ＡＤＰ、ＡＴＰの各濃度およびＡＴＰへの変換率を
求めることができる。このとき、流速としては１反応器
の大きさにより異なるが、たとえば、０．３μｔ／時間
からｌＸｌ０ｔ／時間の間の適当な流速を選定すること
ができる。また。
反応器へのＡＭＰ、ＡＴＰおよびアセチルリン酸の供給
装置としては、外部から制御信号によシ送液流量を変え
ることのできるものなら特に限定されないが、たとえば
、パルスモータ−で駆動される定量ポンプなどが利用で
きる（以下、これを可変量送液装置という）。さらに、
各基質溶液槽と可変量送液装置の間に自動調節弁を設け
、外部信号によシ自Ｒつ１調節弁の開閉を制御すること
により各基質溶液の流量や濃度を変えることができる。
装置としては、外部から制御信号によシ送液流量を変え
ることのできるものなら特に限定されないが、たとえば
、パルスモータ−で駆動される定量ポンプなどが利用で
きる（以下、これを可変量送液装置という）。さらに、
各基質溶液槽と可変量送液装置の間に自動調節弁を設け
、外部信号によシ自Ｒつ１調節弁の開閉を制御すること
により各基質溶液の流量や濃度を変えることができる。
自動ル４節弁としては、たとえば、電磁弁を用いること
ができる。また１反応器は勿論室温で使用してもよいが
、温度を維持する手段を付加する方が好ましい。また９
反応器からの反応液の分析システムとしては、ＡＭＰ、
ＡＤＰ、ＡＴＰを検出する方法であれば特に限定されな
いが、たとえば。
ができる。また１反応器は勿論室温で使用してもよいが
、温度を維持する手段を付加する方が好ましい。また９
反応器からの反応液の分析システムとしては、ＡＭＰ、
ＡＤＰ、ＡＴＰを検出する方法であれば特に限定されな
いが、たとえば。
高速液体クロマトグラフ装置を用いるのが好ましい。
本発明で化学工業上、長期にわた多安定で経済的にＡＭ
Ｐを実質上１００チＡＴＰに変換するためには（イ）式
を満足するように制御することが必要で。
Ｐを実質上１００チＡＴＰに変換するためには（イ）式
を満足するように制御することが必要で。
特にＡＴＰ濃度を（イ）式に加えて、 ｏ、ｏｓｘ−、
−ｘγ２ ＡＭＰ以下に制御することが好・ましい。 （イ）式を
満足するように制御するには、以下の方法を用いること
ができる。すなわち、（イ）式および演算に必要なデー
タを演算制御装置にあらかじめ入力し、これらと分析シ
ステムからの分析データから、ＡＭＰのＡＴＰへの変換
率を演算処理し、上記可変量送液装置および自動調節弁
の少なくとも１つに演算制御装置から信号を送信し、流
量あるいは濃度を変え、（イ）式を満足するように制御
すればよい。そのときの演算に必要なデータとは、ＡＭ
Ｐ、ＡＴＰの原料濃度及びアゾンシンニリン酸をアデノ
シン三す、ン酸に変換する酵素の固定化酵素活性と、ア
デノシン−リン酸をアデノシンニリン酸に変換する酵素
の固定化酵素活性の比であり９分析データとは９反応器
からの反応液中のＡＭＰ 、 ＡＤＰ 、 ＡＴＰの各
濃度である。また、演算制御装置とは、演算機能と外部
装置へ制御信号を出せる機能を備えたもので、たとえば
、マイクロコンピー−ターが使用できる。さらに固定化
酵素活性とは固定化された酵素の活性を表わし１例えば
アデニル酸キナーゼの場合はＡＭＰ＋ＡＴＰ→２・ＡＤ
Ｐなる方向の活性を示し、酢酸キナーゼの場合はＡＤＰ
＋アセチ）ｖＩ）ン酸→ＡＴＰ十酢酸なる方向の活性を
示す。
−ｘγ２ ＡＭＰ以下に制御することが好・ましい。 （イ）式を
満足するように制御するには、以下の方法を用いること
ができる。すなわち、（イ）式および演算に必要なデー
タを演算制御装置にあらかじめ入力し、これらと分析シ
ステムからの分析データから、ＡＭＰのＡＴＰへの変換
率を演算処理し、上記可変量送液装置および自動調節弁
の少なくとも１つに演算制御装置から信号を送信し、流
量あるいは濃度を変え、（イ）式を満足するように制御
すればよい。そのときの演算に必要なデータとは、ＡＭ
Ｐ、ＡＴＰの原料濃度及びアゾンシンニリン酸をアデノ
シン三す、ン酸に変換する酵素の固定化酵素活性と、ア
デノシン−リン酸をアデノシンニリン酸に変換する酵素
の固定化酵素活性の比であり９分析データとは９反応器
からの反応液中のＡＭＰ 、 ＡＤＰ 、 ＡＴＰの各
濃度である。また、演算制御装置とは、演算機能と外部
装置へ制御信号を出せる機能を備えたもので、たとえば
、マイクロコンピー−ターが使用できる。さらに固定化
酵素活性とは固定化された酵素の活性を表わし１例えば
アデニル酸キナーゼの場合はＡＭＰ＋ＡＴＰ→２・ＡＤ
Ｐなる方向の活性を示し、酢酸キナーゼの場合はＡＤＰ
＋アセチ）ｖＩ）ン酸→ＡＴＰ十酢酸なる方向の活性を
示す。
この活性を測定するには、所定量の固定化酵素。
たとえば、活性の度合に応じて５〜１０μＬを、活性測
定用溶液に加え、遊離の酵素と同様にして分光光度計で
吸光度変化として追跡して測定した。
定用溶液に加え、遊離の酵素と同様にして分光光度計で
吸光度変化として追跡して測定した。
酵素活性１単位とは、３０℃でアデニル酸キナーゼの場
合、１分間に１マイクロモルのＡＤＰを生成する量を、
酢酸キナーゼの場合、１分間に１マイクロモルのＡＴＰ
を生成する量である。
合、１分間に１マイクロモルのＡＤＰを生成する量を、
酢酸キナーゼの場合、１分間に１マイクロモルのＡＴＰ
を生成する量である。
本発明に用いられるＡＴＰとしては、上記反応による最
終変換物であるＡＴＰを循環使用しても勿論よい。この
場合には、結局、リン酸供与体としては、アセチルリン
酸だけを供給すればよいことになる。
終変換物であるＡＴＰを循環使用しても勿論よい。この
場合には、結局、リン酸供与体としては、アセチルリン
酸だけを供給すればよいことになる。
本発明によれば、ＡＭＰからＡＴＰへの変換において、
従来与られた変換率の変動を克服でき。
従来与られた変換率の変動を克服でき。
しかも長期間にわたり効率的、連続的ならびに経済的に
実質上１００チの変換率でＡＴＰに変換できる。しかも
操作性がよいため、ＡＴＰ変換率を長期にわたり安定に
維持できる。また９本発明でリン酸供与体としてのＡＴ
Ｐは、充填層型反応器でＡＭＰからＡＴＰに変換された
ものでもよいことは利点の１つである。さらに、出発原
料としては純粋なＡＭＰである必要はなく、（イ）式を
満足するように制御すれば、ＡＭＰにＡＤＰ、ＡＴＰの
加わりた混合物でもよく、この点も化学工業上採用する
場合、非常に有利な点である。
実質上１００チの変換率でＡＴＰに変換できる。しかも
操作性がよいため、ＡＴＰ変換率を長期にわたり安定に
維持できる。また９本発明でリン酸供与体としてのＡＴ
Ｐは、充填層型反応器でＡＭＰからＡＴＰに変換された
ものでもよいことは利点の１つである。さらに、出発原
料としては純粋なＡＭＰである必要はなく、（イ）式を
満足するように制御すれば、ＡＭＰにＡＤＰ、ＡＴＰの
加わりた混合物でもよく、この点も化学工業上採用する
場合、非常に有利な点である。
また、最初に述べたような生体内で行われている。結合
反応を筆体外の化学工業的な反応として行う、いわゆる
バイオリアクターの稼動が可能になる。たとえば、生体
内の最も重要な反応であるアミノ酸活性化酵素によるタ
ンパク質合成反応やペグチド合成反応などは、ＡＴＰを
エネルギー源として必要とし、その際、使用される高価
なＡＴＰはＡＭＰに消費分解されるため、生体外でこの
反応を行う場合、ＡＭＰをＡＴＰに変換再生することが
実用上不可欠なことであった。本発明によれば、このよ
うな反応の実用化が可能になり、この価値は工業上計り
知れないものがある。
反応を筆体外の化学工業的な反応として行う、いわゆる
バイオリアクターの稼動が可能になる。たとえば、生体
内の最も重要な反応であるアミノ酸活性化酵素によるタ
ンパク質合成反応やペグチド合成反応などは、ＡＴＰを
エネルギー源として必要とし、その際、使用される高価
なＡＴＰはＡＭＰに消費分解されるため、生体外でこの
反応を行う場合、ＡＭＰをＡＴＰに変換再生することが
実用上不可欠なことであった。本発明によれば、このよ
うな反応の実用化が可能になり、この価値は工業上計り
知れないものがある。
なお、上のように目的とする合成反応とＡＴＰの再生反
応とを組み合わせる場合、生成ＡＭＰを目的生成物、リ
ン酸供与体の反応生成物（たとえば酢酸など）などから
分離するシステムも必要になる。これはクロマトグラフ
ィーなどの技術により可能となり、目的とする反応系、
ＡＴＰの再生系、ＡＭＰの分離系の３者を組み合わせた
化学工業上の１つのシステムとして完成させることにな
る。
応とを組み合わせる場合、生成ＡＭＰを目的生成物、リ
ン酸供与体の反応生成物（たとえば酢酸など）などから
分離するシステムも必要になる。これはクロマトグラフ
ィーなどの技術により可能となり、目的とする反応系、
ＡＴＰの再生系、ＡＭＰの分離系の３者を組み合わせた
化学工業上の１つのシステムとして完成させることにな
る。
本発明は、このようにＡＴＰの再生利用に極めて有用に
適用できるものであるが、観点をかえて。
適用できるものであるが、観点をかえて。
ＡＭＰを原料としたＡＴＰの生産法としてとらえること
もできる。すなわち、ＡＴＰは医薬品としても重要な物
質であり、工業的レベルで生産されている。しかし、現
行法の発酵法では副産物ができやすいとか、生産性が悪
いなどの問題があり。
もできる。すなわち、ＡＴＰは医薬品としても重要な物
質であり、工業的レベルで生産されている。しかし、現
行法の発酵法では副産物ができやすいとか、生産性が悪
いなどの問題があり。
ＡＴＰの価格も高いものにならざるをえなかった。
しかし９本発明によればこのような問題を一挙に排除で
き、高純度のＡＴＰが生産性よく供給できることも可能
である。本発明にはこのような目的も包含されている。
き、高純度のＡＴＰが生産性よく供給できることも可能
である。本発明にはこのような目的も包含されている。
次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１〜４．比較例１〜３
ｍ 性化ＣＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）
５ｙを洗浄膨潤後、バチルス・ステアロサーモフィルス
Ｎ ＣＡｌ３Ｏ３株（最適生産温度６０℃）より得られ
た酢酸キナーゼ２０００単位を加えて反応させて固定化
酢酸キナーゼ１０００単位を得た。この操作を酢酸キナ
ーゼのかわりにアデニル酸キナーゼの２５０単位を用い
て同様に行い１００単位の固定化アデニル酸キナーゼを
得た。このときの酢酸キナーゼの同定化酵素活性とアデ
ニル酸キナーゼの固定化酵素活性の比は１０であった。
５ｙを洗浄膨潤後、バチルス・ステアロサーモフィルス
Ｎ ＣＡｌ３Ｏ３株（最適生産温度６０℃）より得られ
た酢酸キナーゼ２０００単位を加えて反応させて固定化
酢酸キナーゼ１０００単位を得た。この操作を酢酸キナ
ーゼのかわりにアデニル酸キナーゼの２５０単位を用い
て同様に行い１００単位の固定化アデニル酸キナーゼを
得た。このときの酢酸キナーゼの同定化酵素活性とアデ
ニル酸キナーゼの固定化酵素活性の比は１０であった。
これら両固定化酵素を内径１．６ｃｒｎで長さが１０副
のガラス製カラムに充填し、 １０？？ＩＭ塩化マグネ
シウムを含む２５ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液、 ＰＨ
７，５に溶解した各基質を１５０ｄ／時間の流速でカラ
ムに供給した。このカラムに可変所送液装置、を磁弁及
びマイクロコンピュータ−を設置した。カラム内の温度
を３０℃に保った。カラムより溶出された反応液中のＡ
ＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ濃度を高速液体クロマトグラ装置
で定量した。なお、ＡＭＰ濃度を１．５ｍＭ 、アセチ
ルリン酸濃度を５ｍＭに固定した。
のガラス製カラムに充填し、 １０？？ＩＭ塩化マグネ
シウムを含む２５ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液、 ＰＨ
７，５に溶解した各基質を１５０ｄ／時間の流速でカラ
ムに供給した。このカラムに可変所送液装置、を磁弁及
びマイクロコンピュータ−を設置した。カラム内の温度
を３０℃に保った。カラムより溶出された反応液中のＡ
ＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ濃度を高速液体クロマトグラ装置
で定量した。なお、ＡＭＰ濃度を１．５ｍＭ 、アセチ
ルリン酸濃度を５ｍＭに固定した。
次にマイクロコンピュータ−で０．０６３ ｍＭ ＡＴ
Ｐ（ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．０４２゜実施例１）
。
Ｐ（ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．０４２゜実施例１）
。
０．０７ｍＭＡＴＰ （ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．
０４７゜実施例２ ） 、 ０．１３ｍＭ ＡＴＰ （
ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．０８７．実施例３ ）
、 ０．１９ｍＭ ＡＴＰ （ＡＴＰとＡＭＰの濃度比
は０．１２７゜実施例４）と（イ）式を満足するように
種々変えてＡＴＰへの変換率を求めた。
０４７゜実施例２ ） 、 ０．１３ｍＭ ＡＴＰ （
ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．０８７．実施例３ ）
、 ０．１９ｍＭ ＡＴＰ （ＡＴＰとＡＭＰの濃度比
は０．１２７゜実施例４）と（イ）式を満足するように
種々変えてＡＴＰへの変換率を求めた。
その結果、いずれもカラムに供給後、わずかに２０分後
に、すてにＡＭＰは検出されず、９８．５％のＡＴＰ、
１．５％のＡＤＰが検出された。
に、すてにＡＭＰは検出されず、９８．５％のＡＴＰ、
１．５％のＡＤＰが検出された。
別に比較のため、ＡＴＰ濃度を０．０３ｍＭＡＴＰ（Ａ
ＴＰとＡＭＰの濃度比は０．０２゜比較例１）。
ＴＰとＡＭＰの濃度比は０．０２゜比較例１）。
０．０２４ｍＭ ＡＴＰ （ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は
０．０１６゜比較例２ ） 、 ０．０１４ｍＭ ＡＴ
Ｐ （ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．００９゜比較例３
）に変えて実施例１〜４と同様にして行った。
０．０１６゜比較例２ ） 、 ０．０１４ｍＭ ＡＴ
Ｐ （ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．００９゜比較例３
）に変えて実施例１〜４と同様にして行った。
その結果、比較例１においては、Ａ’ｉ’Ｐが９５％。
ＡＤＰが３％、ＡＭＰが２チ検出され、比較例２におい
ては、ＡＴＰが８９％、ＡＤＰが８％、ＡＭＰが３％検
出され、比較例３においては、ＡＴＰが７２チ、ＡＤＰ
が２０チ、ＡＭＰが８チ検出された。
ては、ＡＴＰが８９％、ＡＤＰが８％、ＡＭＰが３％検
出され、比較例３においては、ＡＴＰが７２チ、ＡＤＰ
が２０チ、ＡＭＰが８チ検出された。
実施例５
実施例２と同条件で反応を開始した後、２０分後にカラ
ムからの溶出液をＡＴＰとＡＭＰの濃度比が０．０４７
になるようにカラムに循環供給した。
ムからの溶出液をＡＴＰとＡＭＰの濃度比が０．０４７
になるようにカラムに循環供給した。
その結果９反応器からの溶出液をＡＴＰの代りに用いて
後、２０分以後５時間にわたり、ＡＴＰは９８チから９
８，５φの間に維持していた。
後、２０分以後５時間にわたり、ＡＴＰは９８チから９
８，５φの間に維持していた。
実施例６
実施例１と同様にして得た固定化酢酸キナーゼ２０００
単位、固定化アデニル酸キナーゼ２００単位を内径２．
０鋸で長さが１２ｃｒｎのガラス製カラムに充填し、
２５ｍＭ塩化マグネシウムと０．０４好）リウムアジド
を含む５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液。
単位、固定化アデニル酸キナーゼ２００単位を内径２．
０鋸で長さが１２ｃｒｎのガラス製カラムに充填し、
２５ｍＭ塩化マグネシウムと０．０４好）リウムアジド
を含む５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液。
Ｐｆｌ ７．５ Ｋ溶かした３、０ｍＭ ＡＭＰ 、
０．１３ｍＭ ＡＴＰ（ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．
０４３ ） 、 １０ｍＭアセチルリン酸を３００ｒｎ
ｖ時間の流速でカラムに供給して（イ）式を満足するよ
うにＡＭＰとＡＴＰの流量と濃度を保った。
０．１３ｍＭ ＡＴＰ（ＡＴＰとＡＭＰの濃度比は０．
０４３ ） 、 １０ｍＭアセチルリン酸を３００ｒｎ
ｖ時間の流速でカラムに供給して（イ）式を満足するよ
うにＡＭＰとＡＴＰの流量と濃度を保った。
その結果１反応開始後１０日間にわた＃）ＡＴＰへの変
換率は９８．５％から９９．０％の間に維持されていた
。
換率は９８．５％から９９．０％の間に維持されていた
。
実施例７
実施例６と同条件で反応を開始した後、３０分後にカラ
ムからの溶出液（９８％のＡＴＰを含む）を、ＡＴＰ（
７）代りＫＡＴＰとＡＭＰ（７）濃度比が０．０４３に
なるようにカラムに循環供給した。
ムからの溶出液（９８％のＡＴＰを含む）を、ＡＴＰ（
７）代りＫＡＴＰとＡＭＰ（７）濃度比が０．０４３に
なるようにカラムに循環供給した。
その結果１反応開始後１０日間にわたりＡＴＰへの変換
率は９８．２〜９８．７ ％で推移していた。
率は９８．２〜９８．７ ％で推移していた。
代理人 児玉雄三
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１１最適生育温度が５０℃ないし８５℃である微生物
の産生ずるアデノシン−リン酸をアデノシンニリン酸に
変換する酵素又はアデノシンニリン酸をアデノシンニリ
ン酸に変換する酵素を固定化し、得られたアデノシン−
リン酸をアデノシンニリン酸に変換する固定化酵素及び
アデノシンニリン酸をアデノシンニリン酸に変換する固
定化酵素を組み合わせてアデノシン−リン酸をアデノシ
ンニリン酸に変換させるに際し、アデノシンニリン酸の
濃度を下記（イ）式を満足する条件に制御することを特
徴とするアデノシン−リン酸のアデノシンニリン酸への
変換方法。 （但し、ＡＭＰはアデノシン−リン酸の濃度（ｍＭ）
。 ＡＴＰはアデノシンニリン酸の濃度（ｍＭ）を表し、γ
はアデノシンニリン酸をアデノシンニリン酸に変換する
酵素の固定化酵素活性とアデノシン−リン酸をアデノシ
ンニリン酸忙変換する酵素の固定化酵素活性との比で、
１以上の正数を表す。） （２） アデノシン−リン酸をアデノシンニリン酸に
変換する酵素が、アデニル酸キナーゼであり。 アデノシンニリン酸をアデノシンニリン酸に変換する酵
素が、酢酸キナーゼである特許請求の範囲第１項記載の
変換方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57090424A JPS58209990A (ja) | 1982-05-27 | 1982-05-27 | アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法 |
| DE8383300361T DE3368682D1 (en) | 1982-01-26 | 1983-01-25 | Process for producing physiologically active substance by multienzyme process and apparatus for the same |
| EP19830300361 EP0084975B1 (en) | 1982-01-26 | 1983-01-25 | Process for producing physiologically active substance by multienzyme process and apparatus for the same |
| DK29683A DK29683A (da) | 1982-01-26 | 1983-01-26 | Fremgangsmaade til fremstilling af fysiologisk aktivt stof ved en multienzymproces og apparat til dens udoevelse |
| CA000420264A CA1194825A (en) | 1982-05-27 | 1983-01-26 | Process for producing physiologically active substance by multienzyme process |
| US06/461,308 US4882276A (en) | 1982-05-27 | 1983-01-26 | Process for producing physiologically active substance by multienzyme process |
| US07/202,606 US4960696A (en) | 1982-05-27 | 1988-06-06 | Process for producing physiololgically active substance by multienzyme process |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57090424A JPS58209990A (ja) | 1982-05-27 | 1982-05-27 | アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58209990A true JPS58209990A (ja) | 1983-12-07 |
Family
ID=13998219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57090424A Pending JPS58209990A (ja) | 1982-01-26 | 1982-05-27 | アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4882276A (ja) |
| JP (1) | JPS58209990A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60203197A (ja) * | 1984-03-29 | 1985-10-14 | Kazutomo Imahori | アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0630599B2 (ja) * | 1989-03-03 | 1994-04-27 | ユニチカ株式会社 | フルクトース―１，６―二リン酸の製造法 |
| US5995539A (en) * | 1993-03-17 | 1999-11-30 | Miller; William J. | Method and apparatus for signal transmission and reception |
| US5367516A (en) * | 1993-03-17 | 1994-11-22 | Miller William J | Method and apparatus for signal transmission and reception |
| CA2233623C (en) * | 1995-10-03 | 2006-08-29 | David A. Barclay | Microwave assisted chemical processes |
| JP4199119B2 (ja) * | 2001-11-21 | 2008-12-17 | ユニチカ株式会社 | 目視判定可能なａｔｐ測定方法およびその試薬 |
| TWI463015B (zh) * | 2010-08-06 | 2014-12-01 | Ind Tech Res Inst | 偵測微生物含量之方法及試劑 |
| WO2018228247A1 (zh) * | 2017-06-15 | 2018-12-20 | 安徽古特生物科技有限公司 | 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3846239A (en) * | 1972-07-24 | 1974-11-05 | Monsanto Co | Process for the preparation of heat-resistant alpha-galactosidase enzyme |
| GB1455993A (en) * | 1973-01-12 | 1976-11-17 | Novo Industri As | Glucose isomerase |
| US4011139A (en) * | 1974-11-26 | 1977-03-08 | Standard Brands Incorporated | Process for producing α-1,6 glucosidases using thermophilic microorganisms |
| US4164444A (en) * | 1976-03-15 | 1979-08-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for preparing adenosine triphosphate |
| US4220722A (en) * | 1978-02-10 | 1980-09-02 | Syva Company | Method for conjugating to polyamino compounds employing haloacyl groups and compositions prepared thereby |
| ZA792410B (en) * | 1978-05-22 | 1980-08-27 | R Sharp | Production of enzymes |
| JPS5519239A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-09 | Green Cross Corp:The | Interferon-producing attractant |
| US4424278A (en) * | 1981-11-16 | 1984-01-03 | Research Corporation | Cancer detection procedure using an acyl carrier protein |
-
1982
- 1982-05-27 JP JP57090424A patent/JPS58209990A/ja active Pending
-
1983
- 1983-01-26 US US06/461,308 patent/US4882276A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60203197A (ja) * | 1984-03-29 | 1985-10-14 | Kazutomo Imahori | アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4882276A (en) | 1989-11-21 |
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