TWI463015B - 偵測微生物含量之方法及試劑 - Google Patents

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Description

偵測微生物含量之方法及試劑
本發明關於腺苷三磷酸(ATP)擴增的方法，特別是關於應用腺苷三磷酸偵測微生物含量之方法及試劑。
在工業及醫療使用上，水中微生物的含量必須監控在標準值或幾乎為零的條件下，才得以維持相關製程或應用於製藥技術及臨床醫學的診斷。以目前的偵測技術，對於微量的水中微生物尚無法準確地偵測其存在的狀況。水中微生物通常會聚集繁衍，分泌多醣體等高分子聚合物包裹菌體，形成所謂的生物膜。生物膜一旦形成，不論用清洗藥劑、強酸強鹼、甚至是臭氧等，都難以將生物膜完全去除。以台灣的高科技產業為例，當管線中發現生物膜時，解決的方法僅能將整個管線全部更新。醫學上亦無法用抗生素穿透生物膜而完全殺死細菌。因此，相關領域中皆積極發展靈敏度高的偵測方法，希望在生物膜形成之前準確地偵測微量的微生物，以有效防範生物膜的形成。
目前檢測水中微生物的方法，冷光偵測方法為其中一種常用方式。冷光偵測方法係利用螢火蟲發光酵素(Luciferase)及發光素(Luciferin)，與微生物細胞內的腺苷三磷酸(ATP)反應，發出冷光，藉由冷光儀判斷冷光的強度以判斷微生物的含量。但是此方法受人為操作因素影響很大，偵測靈敏度不高，而且費用較高。
WO03/044222A1記載一種簡化的ATP測量試劑及方法，在乙醯磷酸(acetyl phosphate)及葡萄糖存在下，以醋酸激酶(acetate kinase)及葡萄糖激酶(glucokinase)或己糖激酶(hexokinase)作用，產生葡萄糖-6-磷酸，再於NAD(P)及色原體(chromogen)存在下，以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及氫傳遞酶(diaphorase)或電子傳遞物質酵素作用，產生顏色，根據顏色目測ATP的含量。
WO01/53513A1揭露一種ATP再生反應系統，係將AMP以腺苷激酶(adenylate kinase)轉變為ADP，再以聚磷酸合成酶(polyphosphoric acid synthase)轉變為ATP及聚磷酸化合物。同篇專利申請案另揭露一種ATP再生反應系統，AMP在聚磷酸化合物存在下以磷酸轉移酶(phosphotransferase)轉變為ADP，再以聚磷酸合成酶轉變為ATP。
WO2006/118093A1記載一種分析樣本中ATP的方法，包括四步驟：(1)混合腺苷單磷酸(AMP)、磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)、腺苷激酶及丙酮酸激酶與樣本混合，培養一段時間；(2)加入酸及丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase)，培養一段時間；(3)加入酸、鐵(II)及顯色劑，培養一段時間；(4)根據顯色結果判斷ATP的濃度。
本發明人基於冷光偵測法的缺點，積極研發靈敏度及穩定度提高的偵測微生物含量的方法，進而完成本發明。
本發明係基於以發光酵素偵測ATP的方法，藉由再生循環ATP的方式，使可偵測的ATP量提高，進一步達到靈敏度及穩定度提升的偵測微生物含量的方法。
本發明提供一種擴增腺苷三磷酸的方法，包括：在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate;ATP)存在下，混合腺苷三磷酸-硫酸化酸(ATP-sulfurylase)、五硫磷酸腺苷(adenosine 5’ phosphosulfate;APS)、腺苷酸激酶(adenylate kinase;ADK)、尿苷三磷酸(uridine triphosphate;UTP)、醋酸激酶(acetate kinase)、乙醯磷酸(acetyl phosphate)、發光素(luciferin)、及發光酵素(luciferase)後，進行反應。
本發明更提供一種偵測微生物含量的方法，包括：將一樣本與腺苷三磷酸-硫酸化酶、五硫磷酸腺苷、腺苷酸激酶、尿苷三磷酸、醋酸激酶、乙醯磷酸、發光素、及發光酵素混合，進行反應而發光；以及藉由發光強度判定該樣本中微生物的含量。
本發明再提供一種偵測微生物含量的試劑，包括：腺苷三磷酸-硫酸化酶、五硫磷酸腺苷、腺苷酸激酶、尿苷三磷酸、醋酸激酶、乙醯磷酸、發光素、及發光酵素。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
請參考第1圖，一般利用ATP進行之冷光反應如反徑途徑110所示，即ATP與發光素(luciferin)、及發光酵素(luciferase)在有氧條件下，會產生焦磷酸(PPi)、腺苷單磷酸(adenosine monophosphate;AMP)、氧化發光素(oxyluciferin)、二氧化碳(CO2 )等反應產物並產生冷光(發光)。本發明之擴增腺苷三磷酸(ATP)的方法是基於利用前述反應產物焦磷酸(PPi)與腺苷單磷酸(AMP)進行ATP的再生循環。
請繼續參考第1圖，途徑110之反應產物焦磷酸(PPi)在混合腺苷三磷酸-硫酸化酶(ATP-sulfurylase)、五硫磷酸腺苷(APS)時，可以產生ATP及硫酸離子(SO4 2- )，即反應途徑112，如此便能再產生ATP(即ATP再生)。
而途徑110之反應產物腺苷單磷酸(AMP)在混合腺苷酸激酶(ADK)、尿苷三磷酸(UTP)、醋酸激酶(acetate kinase)、乙醯磷酸(acetyl phosphate)則可以產生腺苷二磷酸(ADP)，再進一步形成乙酸及ATP，即反應途徑114，如此亦能再產生ATP(即ATP再生)。
因此，本發明之方法藉由上述ATP再生雙循環組成三種途徑(110、112及114)的模式，擴增ATP量。故即使起始步驟以微量ATP存在，經過上述110、112、114途徑(含雙循環再生)反應後，ATP量可擴增為起始的數倍至數十倍以上。一實施例中，本發明之雙循環途徑使ATP量擴增約5倍以上。
而且，當上述112途徑及114途徑產生的ATP，再循環進行110途徑時，可產生更多的光。因此，此技術領域之人士可根據此特性，適宜設計應用於相關研究及產業利用。
目前的冷光偵測方法僅以微生物體內的ATP作為起始基質，偵測由ATP轉變為光的發光量(僅110途徑)。當樣本中的微生物含量極微量時，產生的發光量也會相對地低，則在樣本中其他非ATP的雜質作用影響下，造成背景值干擾的現象，所得到的偵測值準確度不高。因此，目前常用的冷光偵測方法的靈敏度僅能達到約104 CFU/ml的微生物量。
本發明之擴增ATP的方法，因為利用上述雙循環再生ATP組成之三種途徑，於微生物的偵測上，即使樣本中微生物含量低，也可透過上述的三種途徑擴增ATP量，進而產生較大的發光量，提高偵測準確度及穩定性。因此，使用本發明方法偵測微生物時，可減少背景值的干擾，靈敏度可達104 CFU/ml以下的微生物量，較佳可偵測約102 CFU/ml的微生物量，相當於一般偵測用的冷光儀之偵測極限。
再者，根據本發明之方法，所有欲反應的基質及酵素可在同一時間加入同一反應管中進行反應，簡化操作流程及降低人為操作的誤差，即為一步驟性操作(one step process)。上述之基質及酵素也可根據各基質及酵素特性，先後分次加入同一管中，例如發光素及發光酵素可於加入所有基質及酵素後加入。
而且，上述基質及酵素可在開放空間及室溫下進行反應。反應時間較佳為30秒至10分鐘，可獲得較佳的偵測值。
本發明之方法及試劑中所使用之各基質及酵素的濃度，可依所操作的檢測儀器、環境條件、樣本狀態等因素適當調整。本發明之一實施例，ATP-硫酸化酶為約5x10-4 -5x10-6 U/mL，五硫磷酸腺苷為約0.1-10nM，腺苷酸激酶為約0.5-5U/mL，尿苷三磷酸(UTP)為約0.01-1μ M，醋酸激酶為約0.5-5U/mL，乙醯磷酸為約5-50μ M，發光素(luciferin)為約50μM-400μM，及發光酵素(luciferase)為約0.5U/mL-10U/mL，但不限於此。
本發明之一實施例，上述基質及酵素可存在於Tris緩衝液(tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer)中，該Tris緩衝液的濃度可為約25-75mM，但不限於此。
本發明一實施例中，上述緩衝液可更包括鎂離子，濃度可為2-10mM，以提供發光酶活性。該鎂離子可藉由添加氯化鎂而存在於上述緩衝液中。
本發明之偵測微生物含量的方法及試劑可用於偵測飲用水、生活用水、工業用水、生物樣本、或類似性質的樣本。
本發明基於上述三種途徑的雙循環模式，提供使ATP擴增的新穎方法，並應用於偵測微生物的含量上，使偵測的靈敏度及穩定度提升，及簡化操作流程。
下列實施例比較本發明之雙循環途徑模式及習知經發光酵素途徑偵測ATP途徑、經發光酵素途徑與經ATP-硫 酸化酶途徑偵測ATP的單循環模式、及經發光酵素途徑與經ADK及醋酸激酶途徑偵測ATP的單循環模式，所產生的發光量，進一步說明本發明之功效。然而本發明之範圍不限於此，當以後述之申請專利範圍為準。
[實施例1]雙循環模式及單循環模式的比較
如下表1所示之各反應物及其濃度，添加於冷光儀TD-20/20 Luminometer(Turner Designs,Sunnyvale,CA)中。經反應30秒後，分別檢測雙循環組及單循環組所產生的發光量(RLU 1000X)。重複3次上述步驟，計算所得發光量的平均值。結果如第2圖所示。
(1)ATP-硫酸化酶獲得自Sigma A8957-10UN。
(2)五硫磷酸腺苷(APS)獲得自Sigma A5508-5MG。
(3)乙醯磷酸(AcoP)獲得自Sigma A0262-500MG。
(4)以27 mg焦磷酸(PPi)(Nacalai tesque 31816-25 500G)溶於1 ml ddH2 O溶液中。
(5)以100 UN腺苷酸激酶(ADK)(Sigma M3003 1KU)溶於100μl Tris溶液中，每1μl為1 UN。
(6)醋酸激酶獲得自Sigma A7437-250UN。
(7)以5.5 mg尿苷三磷酸(UTP)(Sigma U6750 100MG)溶於1 ml ddH2 O溶液中。
(8)緩衝液1為50 mM Tris，pH=7.6。
(9)緩衝液2的調配：以6 mM的MgCl2 、1 U的冷光酵素(Sigma L9506-1MG)、及1 mM的冷光素(Sigma L6882-.2MG)，溶於1 ml緩衝液1中。
如第2圖所示之結果，雙循環組所產生的發光量平均為6065RLU，單循環組所產生的發光量平均為1158RLU。此結果顯示，在短時間的反應下，雙循環系統可產生高於單循環系統約5倍的發光值，可提高以冷光儀檢測的靈敏度。
[實施例2]　雙循環模式、單循環模式及習知冷光偵測途徑的比較
將實施例1調配的各反應物根據下表2所示之濃度，添加於冷光儀TD-20/20 Luminometer(Turner Designs,Sunnyvale,CA)中。經反應3分鐘後，分別檢測各組所產生的發光量(RLU 1000X)。重複3次上述步驟，計算所得發光量的平均值。結果如第3圖及表3所示。
(10)以5.5mg腺苷三磷酸(ATP)(Sigma A2383 25G)溶於1ml ddH2 O溶液中。
如第3圖及表3所示之結果，本案的雙循環模式(D組)所產生的發光量為習知經發光酵素途徑之發光量的20倍以上。跟經發光酵素途徑及經ATP-硫酸化酶途徑的單循環模式、及經發光酵素途徑及經ADK與醋酸激酶的單循環模式相比，本案雙循環模式所得的發光值提高約6倍。
[實施例3]雙循環模式與單循環模式在不同菌種偵測上的比較
分別取大腸桿菌(E. coli BL21) 101 -105 CFU/ml，培養於LB液態培養液、綠膿桿菌(Psudomonas aeruginosa PAO1)101 -105 CFU/ml，培養於LB液態培養液、及仙人掌桿菌(B. cereus ) 101 -105 CFU/ml，培養於LB液態培養液，每一菌株分為兩組，一組進行本案雙循環系統，如實施例1之雙循環組之條件與步驟；另一組進行經發光酵素途徑及經ATP-硫酸化酶途徑的單循環系統，如實施例1之單循環組之條件與步驟。。結果分別如第4、5、6圖所示。
結果顯示，各菌種在101 、102 CFU/ml的低菌數範圍內，經發光酵素途徑及經ATP-硫酸化酶途徑的單循環系統所得的發光量非常微量，在習知冷光儀的偵測中無法有效辨別。然而，以本案的雙循環系統檢測102 CFU/ml以下的低菌數範圍，所得的發光值已達到習知冷光儀可偵測的範圍。換言之，應用本案的雙循環系統可有效分辨菌數含量低的樣本，可提升冷光儀偵測的靈敏度。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
110．．．反應途徑
112．．．反應途徑
114．．．反應途徑
第1圖顯示本發明之雙循環系統的生化反應，包括：ATP經過發光酵素的反應途徑(110)；由反應途徑(110)產生的焦磷酸(PPi)，經過ATP-硫酸化酶再生ATP的反應途徑(112)；以及由反應途徑(112)產生的腺苷單磷酸(AMP)，經過腺苷酸激酶(ADK)及乙酸激酶再生ATP的反應途徑(114)。
第2圖顯示本案實施例1之雙循環組及單循環組所產生的發光值。
第3圖顯示本案實施例2之發光值，A柱表示經發光酵素途徑反應所得的發光值；B柱表示經發光酵素途徑及經ATP-硫酸化酶途徑之單循環模式所得的發光值；C柱表示經發光酵素途徑及經ADK與醋酸激酶途徑之單循環模式所得的發光值；及D柱表示以本案雙循環模式之反應所得的發光值。
第4圖顯示以雙循環模式及單循環模式偵測大腸桿菌(E. coli BL21)的發光值。
第5圖顯示以雙循環模式及單循環模式偵測綠膿桿菌(Psudomonas aeruginosa PAO1)的發光值。
第6圖顯示以雙循環模式及單循環模式偵測仙人掌桿菌(B. cereus )的發光值。
110．．．第一途徑
112．．．第二途徑
114．．．第三途徑

Claims (7)

  1. 一種偵測微生物含量的方法，包括：將一樣本與腺苷三磷酸-硫酸化酶(ATP-sulfurylase)、五硫磷酸腺苷(adenosine 5’ phosphosulfate)、腺苷酸激酶(adenylate kinase)、尿苷三磷酸(uridine triphosphate)、醋酸激酶(acetate kinase)、乙醯磷酸(acetyl phosphate)、發光素(luciferin)、及發光酵素(luciferase)混合，進行反應而發光；以及藉由發光強度判定該樣本中微生物的含量，其中該腺苷三磷酸-硫酸化酶的濃度為5x10-4 ~5x10-6 U/mL，該五硫磷酸腺苷的濃度為0.1~10nM，該腺苷酸激酶的濃度為0.5~5U/mL，該尿苷三磷酸的濃度為0.01~1μM，該醋酸激酶的濃度為0.5~5U/mL，該乙醯磷酸的濃度為5~50μM，該發光素的濃度為50~400μM，及該發光酵素的濃度為0.5~10U/mL。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之偵測微生物含量的方法，其中該樣本包括飲用水、生活用水、工業用水、或生物樣本。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之偵測微生物含量的方法，其中該反應為一步驟性操作(one-step process)。
  4. 如申請專利範圍第1-3項任一項所述之偵測微生物含量的方法，其中該方法偵測104 CFU/ml以下的微生物含量。
  5. 一種偵測微生物含量的試劑，包括：腺苷三磷酸-硫酸化酶(ATP-sulfurylase)、五硫磷酸腺苷(adenosine 5’ phosphosulfate)、腺苷酸激酶(adenylate kinase)、尿苷三磷酸(uridine triphosphate)、醋酸激酶(acetate kinase)、乙醯磷酸(acetyl phosphate)、發光素(luciferin)、及發光酵素(luciferase)，其中該腺苷三磷酸-硫酸化酶的濃度為5x10-4 ~5x10-6 U/mL，該五硫磷酸腺苷的濃度為0.1~10nM，該腺苷酸激酶的濃度為0.5~5U/mL，該尿苷三磷酸的濃度為0.01~1μM，該醋酸激酶的濃度為0.5~5U/mL，該乙醯磷酸的濃度為5~50μM，該發光素的濃度為50~400μM，及該發光酵素的濃度為0.5~10U/mL。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之偵測微生物含量的試劑，其中該試劑用於偵測飲用水、生活用水、工業用水、或生物樣本中的微生物含量。
  7. 如申請專利範圍第5或6項所述之偵測微生物含量的試劑，其中該試劑偵測104 CFU/ml以下的微生物含量。
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