CN109266332B - 一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法，（1）以甘油为碳源，3‑氨丙基三乙氧基硅烷为钝化剂合成发射蓝色荧光的CDs；（2）将OPD与Cu2+混合反应生成发射黄色荧光的oxOPD,并将其与合成的发射蓝色荧光的CDs混合，oxOPD猝灭蓝色碳点的荧光，形成蓝色荧光较弱黄色荧光较强的比率型荧光探针；（3）将AChE和BChE分别与对应的底物ATCh和BTCh反应以后，加入荧光探针，ATCh和BTCh在AChE和BChE的催化下会产生带有巯基的硫代胆碱，与探针中的Cu2+结合，从而使产生的oxOPD减少，探针的黄色荧光减弱，被猝灭的蓝色碳点的荧光恢复。具有灵敏度高、选择性好、检测简便。

Description

一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制 备方法
技术领域
本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于碳点的荧光传感平台定量测定血液中乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)的方法。
背景技术
胆碱酯酶(ChEs)是中枢神经系统中的催化胆碱酯形成胆碱的水解反应的关键酶，人体中的胆碱酯酶主要分为两种，乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)，AChE和BChE在人体中有着不同的生化功能，AChE主要结合在红细胞的细胞膜，而BChE则主要存在于血浆中，AChE对于维持神经递质乙酰胆碱的水平方面具有至关重要的作用，AChE的异常表达可能与一些神经系统疾病如阿尔兹海默症等有关。此外，AChE和BChE活性被认为是有机磷中毒、神经毒剂中毒、肝硬化、肝癌和急性心肌梗死的诊断性双标记物。因此，发展对全血中AChE和BChE活性的同时、有区别、高度敏感和稳健的检测方法具有重要意义。
目前，广泛使用的检测ChEs活性的方法是Ellman的比色法。但是，该方法灵敏度较低，具有假阳性效应，并且容易受到血液背景干扰。胆碱氧化酶偶联多酶实验也是一个检测ChEs活性的有效方法，但是操作费时。此外，还有一些方法可用于测定ChEs活性，包括薄层色谱和质谱等，但是这些方法所需的仪器昂贵而难以普及。近年来，一些荧光纳米材料包括半导体量子点、金纳米粒和上转换纳米材料等逐渐被应用于ChEs活性的检测，但是这些探针通常是基于单个荧光强度信号的变化，这种探针不能避免来自探针浓度、光源、仪器效率和测量条件的干扰。然而，比率荧光探针利用在同一激发波长下可以输出两个发射波长的特性可以克服上述缺点，改进探针的分析性能。
碳点（CDs）由于其突出的优势，例如制备前体丰富，制备方便，多色发射，高量子产率，异常光稳定性，低细胞毒性和高生物相容性等，最近在生物传感、生物成像、药物输送、癌症治疗和光催化领域受到极大关注。尤其是强光致发光特性使CDs成为荧光生物传感器发展的理想选择。近年来，基于CDs的荧光探针被广泛应用于检测金属离子，DNA，生物分析物和酶等。然而，这些生物传感器大都完全依赖于单个荧光强度信号输出。据我们所知，目前还没有基于CDs的比率荧光探针用于重要酶的检测。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法，基于碳点的比率荧光传感平台，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，大大减少了来自探针浓度，光源，仪器效率和测量条件的干扰，可以直接应用于血液中AChE和BChE的区分检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法，步骤如下：
（1）、合成发射蓝色荧光的CDs [Zou, C.; Foda, M. F.; Tan, X.; Shao, K.;Wu, L.; Lu, Z.; Bahlol, H. S.; Han, H., Carbon-Dot and Quantum-Dot-CoatedDual-Emission Core-Satellite Silica Nanoparticles for RatiometricIntracellular Cu(2+) Imaging. Anal Chem 2016,88 (14), 7395-403.]:以甘油为碳源，3-氨丙基三乙氧基硅烷为钝化剂，在反应釜中，氮气氛围下，在高温高压的作用下碳化形成发蓝色荧光的CDs；其发射波长范围在450-470 nm；
（2）、合成发射黄色荧光的氧化型邻苯二胺(oxOPD)[Sun, J.; Wang, B.; Zhao,X.; Li, Z. J.; Yang, X., Fluorescent and Colorimetric Dual-Readout Assay forInorganic Pyrophosphatase with Cu(2+)-Triggered Oxidation of o-Phenylenediamine. Anal Chem 2016,88 (2), 1355-61.]：将邻苯二胺固体（OPD）溶解于水溶液中，超声分散，加入CuSO4溶液，在孵育条件下发生氧化还原反应，生成发射黄色荧光的oxOPD；其发射波长的范围在555-575 nm；
（3）、合成比率型荧光探针：将步骤（1）所得的发蓝色荧光的CDs与步骤（2）所得的发黄色荧光的oxOPD混合，共孵育，CDs的蓝色荧光被oxOPD猝灭，得到蓝色荧光较弱黄色荧光较强的比率型荧光探针；孵育温度20-45℃，时间0.5-3.0 h；
（4）、检测AChE：将血液稀释，加入二乙异丙嗪37 ℃孵育30 min，抑制血液中的AChE的活性，再加入AChE的底物ATCh反应，继续加入步骤（3）中的比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的比值，根据标准曲线，得到血液中AChE的含量。所用二乙异丙嗪的浓度为10-30 μM，所用ATCh的浓度为400-1000 μM；
（5）、检测BChE：将血液稀释，加入BChE的底物BTCh反应，37 ℃孵育30 min，然后加入步骤（3）中的比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的比值，根据标准曲线，得到血液中AChE的含量。所用BTCh的浓度为400-1000 μM。
本发明定量检测血液中的AChE和BChE活性的原理是：邻苯二胺在Cu2+的催化下能够被氧化成具有黄色荧光的oxOPD，oxOPD和发蓝光的CDs混合以后，由于内滤效应的作用，CDs的蓝色荧光被oxOPD猝灭，oxOPD的黄色荧光保留，因此可以得到蓝色荧光较弱黄色荧光较强的比率荧光探针，其蓝色荧光和黄色荧光的比值与探针中的Cu2+浓度有关。AChE和BChE可以催化相应的底物ATCh和BTCh产生含有-SH的硫代胆碱，可以与探针中的Cu2+结合，使得探针的蓝色荧光与黄色荧光的比值发生变化。在底物浓度一定的情况下，酶的活性越高，蓝色荧光与黄色荧光的比值越大。二乙异丙嗪是BChE的特异性抑制剂。血液中同时含有AChE和BChE，AChE具有底物特异性，BChE具有底物非特异性，因此以ATCh为底物，加入二乙异丙嗪抑制血液中的BChE，可以检测血液中AChE的活性，以BTCh为底物，可以检测血液中的BChE的活性。
有益效果：本发明用Cu2+与邻苯二胺产生发黄色荧光的oxOPD，猝灭蓝色碳点的荧光，构成比率荧光探针，其蓝色荧光与黄色荧光的强度比与Cu2+浓度有关，Cu2+能够与AChE和BChE催化相应的底物ATCh和BTCh产生的硫代胆碱结合，因此可于检测AChE和BChE的活性。与传统的单信号检测方法相比，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，并且可以减少来自探针浓度，光源，仪器效率和测量条件的干扰，可以直接应用于血液中AChE和BChE的检测。整个检测过程环保、安全、方便。
附图说明
图1A是实施例1制备得到的CDs的透射电子显微镜图；如图所示，CDs粒径约在10nm，均匀分散（图中标尺为20nm）。
图1B是实施例1制备得到的CDs的紫外吸收以及荧光发射图；如图所示，CDs在290nm处有特征吸收，其荧光发射波长在450-470 nm。
图2是实施例2中的CDs的pH稳定性图；如图所示，CDs在pH=4.0-9.2条件下荧光强度基本保持稳定。
图3是实施例3制备得到的oxOPD的紫外吸收和荧光发射图；如图所示，oxOPD在410nm处有特征吸收，其发射波长在555-575 nm。
图4A是实施例4中Cu2+浓度对比率荧光探针的影响图；如图所示，随着Cu2+浓度的增大，460 nm处的蓝色荧光逐渐减弱，570 nm处的黄色荧光逐渐增强。
图4B是实施例4中Cu2+浓度对比率荧光探针的影响图；如图所示，随着Cu2+浓度的增大，570 nm处的黄色荧光与460 nm处的蓝色荧光的比值逐渐增大。
图5是实施例5中ATCh的浓度优化图。如图所示，随着Cu2+浓度的增大，460 nm处的蓝色荧光与570 nm处的黄色荧光与的比值逐渐增大。
图6A是实施例6中AChE浓度与比率荧光探针的荧光变化祥光图；如图所示，随着AChE浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光逐渐增强，黄色荧光逐渐减弱。
图6B是实施例6中AChE浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值的相关图；如图所示，随着AChE浓度的增大比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值逐渐增大，在0-4.0 U/L范围内，AChE的浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值呈线性相关，线性回归方程为y=0.038x+0.115,相关系数r2=0.989。
图7是实施例7中BTCh的浓度优化图。如图所示，随着Cu2+浓度的增大，460 nm处的蓝色荧光与570 nm处的黄色荧光与的比值逐渐增大。
图8A是实施例8中BChE浓度与比率荧光探针的荧光变化相关图；如图所示，随着BChE浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光逐渐增强，黄色荧光逐渐减弱。
图8B是实施例8中BChE浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值的相关图；如图所示，随着BChE浓度的增大比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值逐渐增大，在0-1.2 U/L范围内，BChE的浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值呈线性相关,线性回归方程为y=0.159x+0.111,相关系数r2=0.992。
具体实施方式
邻苯二胺、甘油、3-氨丙基三乙氧基硅烷、ATCh（碘化乙酰硫代胆碱）（阿拉丁试剂有限公司）；乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、BTCh（碘化乙酰硫代胆碱）、盐酸二乙异丙嗪（西格玛奥德里奇贸易有限公司）。
实施例1 发射蓝色荧光的CDs的合成，步骤如下：
取9ml的甘油，加入1 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀，将混合液转移至反应釜中，通氮气15 min，除去反应釜内多余的空气后将反应釜密封，于200 ℃条件下反应2.5 h。得到的溶液冷却至室温，用500 Da的透析袋透析纯化得到发蓝色荧光的CDs。其透射电镜图如图1所示。
实施例2 所合成CDs的pH稳定性的考察，步骤如下：
取10 μL上述合成的发射蓝色荧光的碳点分散在pH为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.2的缓冲溶液中，混合均匀后测定其在不同pH缓冲液中的荧光强度，考察所合成的发蓝色荧光的碳点的pH稳定性，结果如图2所示。
实施例3 发黄色荧光的oxOPD的制备，步骤如下：
称取0.54 mg邻苯二胺固体于5 ml水溶液中超声分散，加入5 ml CuSO4溶液，混合均匀，将混合液置于37 ℃恒温摇床中孵育2 h得到发黄色荧光的oxOPD。其紫外吸收和荧光发射图如图3所示。
实施例4 比率型荧光探针的制备，步骤如下:
将制备的发蓝色荧光的碳点分散在pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入由Cu2+和邻苯二胺反应制备的oxOPD，混合液在4-55 ℃孵育0.5-3.0 h，得到黄光较强蓝光较弱的比率荧光探针。考察Cu2+浓度，对探针制备效果的影响，结果如图4所示。
实施例5 考察ATCh浓度对检测AChE的影响，步骤如下:
将AChE分散在pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，使其最终活性为14.0 U/L，加入不同浓度的底物ATCh（50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 μM）于37 ℃下孵育30min，然后加入上述比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的强度的比值，考察ATCh浓度对检测AChE的影响，结果如图5所示。
实施例6 对AChE的定量检测，步骤如下:
将不同活性的AChE（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0、14.0 U/L）分散在pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物ATCh，于37 ℃下孵育30 min，然后加入上述比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的强度的比值，所得荧光图如图6A所示，荧光强度的比值与AChE活性的相关性如图6B所示。
实施例7 考察BTCh浓度对检测BChE的影响，步骤如下:
将BChE分散在pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，使其最终活性为5.0 U/L，加入不同浓度的底物BTCh（50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 μM）于37 ℃下孵育30 min，然后加入上述比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的强度的比值，考察BTCh浓度对检测BChE的影响，结果如图7所示。
实施例8 对BChE的定量检测，步骤如下:
将不同活性的BChE（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 U/L）分散在pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物BTCh，于37 ℃下孵育30min，然后加入上述比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的强度的比值，所得荧光图如图8A所示，荧光强度的比值与BChE活性的相关性如图8B所示。
实施例9 实际血液样品中AChE的检测，步骤如下：
血液样品用水稀释100倍后冷冻保存待用，检测AChE时，取少量血液样品分散于pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入浓度为20 μM的二乙异丙嗪于37 ℃孵育20 min后，加入底物ATCh，于37 ℃下孵育30 min，然后加入上述比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的强度的比值，根据标准曲线，计算得到血液中AChE的含量。实施例中三个样本的血液检测到的AChE活性如表1所示。可见，三个健康人血液中的AChE活性一致，且每次检测结果均在误差范围内。
实施例10 实际血液样品中BChE的检测，步骤如下：
血液样品用水稀释100倍后冷冻保存待用，检测BChE时，取少量血液样品分散于pH=7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物BTCh，于37 ℃下孵育30 min，然后加入上述比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的强度的比值，根据标准曲线，计算得到血液中BChE的含量。实施例中三个样本的血液检测到的BChE活性如表1所示。可见，三个健康人血液中的BChE活性均处于正常水平，且每次检测结果均在误差范围内。
表1
Figure 771237DEST_PATH_IMAGE001

Claims (7)

1.一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法，步骤如下：
（1）、合成发射蓝色荧光的CDs:以甘油为碳源，3-氨丙基三乙氧基硅烷为钝化剂，在反应釜中，氮气氛围下，在高温高压的作用下碳化形成发蓝色荧光的CDs；
（2）、合成发射黄色荧光的oxOPD：将邻苯二胺固体溶解于水溶液中，超声分散，加入CuSO4溶液，在孵育条件下发生氧化还原反应，生成发射黄色荧光的oxOPD；
（3）、合成比率型荧光探针：将步骤（1）所得的发蓝色荧光的CDs与步骤（2）所得的发黄色荧光的oxOPD混合共孵育，CDs的蓝色荧光被oxOPD猝灭，得到蓝色荧光较弱黄色荧光较强的比率型荧光探针。
2.权利要求1所述的用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中CDs发射波长范围在450-470 nm；步骤（2）中oxOPD发射波长的范围在555-575 nm。
3.权利要求1所述的用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于步骤（3）中共孵育温度20-45℃，时间0.5-3.0 h。
4.权利要求1-3任一项所述的比率型荧光探针定量检测血液中AChE的方法，其特征在于，将血液稀释，加入二乙异丙嗪37℃孵育30 min，抑制血液中的AChE的活性，再加入AChE的底物ATCh反应，继续加入步骤（3）中的比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的比值，根据标准曲线，得到血液中AChE的含量。
5.权利要求1-3中任一项所述的比率型荧光探针用于定量检测血液中BChE的方法，其特征在于，将血液稀释，加入BChE的底物BTCh反应，37℃孵育30 min，然后加入步骤（3）中的比率荧光探针孵育后，测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的比值，根据标准曲线，得到血液中AChE的含量。
6.根据权利要求4所述的比率型荧光探针定量检测血液中AChE的方法，其特征在于，二乙异丙嗪的浓度为10-30 μM，所用ATCh的浓度为400-1000 μM。
7.根据权利要求5所述的比率型荧光探针定量检测血液中BChE的方法，其特征在于，BTCh的浓度为400-1000 μM。
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