CN110028503B - 一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针及其制备方法与应用,该荧光探针为HBTP‑Cu2+复合物,且本发明公开的HBTP‑Cu2+复合物以HBTP和硫代胆碱(经乙酰胆碱酯酶特异性催化乙酰胆碱产生)与Cu2+的竞争结合作为基本作用机制,并以HBTP发光作为荧光信号报告基团。当向体系中加入乙酰胆碱酯酶时,硫代胆碱可与HBTP‑Cu2+复合物结构中的Cu2+配位结合,复合物结构从而瓦解,HBTP的存在形式由有序聚集转变为单体分散在体相溶液中,并产生溶液的颜色和荧光变化。通过核磁共振法、紫外‑可见吸收光谱法、荧光光谱法研究了其对乙酰胆碱酯酶的识别效果,结果表明HBTP‑Cu2+复合物在纯水溶剂体系中能够高效选择性识别乙酰胆碱酯酶,且对乙酰胆碱酯酶具有很高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于酶活性检测技术领域,涉及一种用于检测细胞内源性乙酰胆碱酯酶的方法策略。更具体地,涉及一种荧光探针及其制备方法和它在检测乙酰胆碱酯酶中的应用。
背景技术
乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种控制羧肽酶和氨肽酶功能的胆碱酯酶,能够选择性催化水解底物乙酰胆碱(ATCh),这是一种神经信号传递的神经递质。AChE有助于促进神经元发育和神经再生,主要分布在人体内由脑,肝和脊髓组成的组织中。此外,越来越多的证据表明血液中异常升高的碱性磷酸酶水平与各种疾病如癌症,心脏病,骨骼疾病和肝脏疾病有关。因此,开发特异性和灵敏检测乙酰胆碱酯酶活性的方法在临床诊断中有重要的意义。现今对乙酰胆碱酯酶的检测主要依赖Ellman法,电化学法,表面增强共振拉曼散射方法,比色法和荧光法等手段,上述方法大多需要复杂的仪器,限制了其实际应用。诸多方法中,光谱分析手段由于操作简便,灵敏度高,响应速度快,成本低而受到更多关注,并有较为广阔的商用价值,是目前具有应用价值的乙酰胆碱酯酶分析方法。
因此,如何提供一种高灵敏度、高选择性的荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是针对现有技术中存在的问题,提供一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针。
为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针,所述荧光探针为HBTP-Cu2+复合物,且所述HBTP-Cu2+复合物的结构单元HBTP的结构式为:
所述荧光探针以HBTP作为荧光报告基团,可以通过肉眼对目标物乙酰胆碱酯酶进行可视化鉴别,也可进入活细胞中对细胞内源性乙酰胆碱酯酶进行测定。
本发明的另一目的是提供一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针的制备方法。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针的制备方法,所述方法具体步骤如下所述:
室温下于PBS缓冲溶液中加入探针母液和CuCl2溶液,搅拌发生配位反应,得到目标产物HBTP-Cu2+复合物荧光探针。
具体制备方案如下:
室温下于2mL PBS缓冲溶液中(pH=8.0)加入探针母液(8μL,2.5mmol·L-1)和CuCl2溶液(0.1μL,0.1mol·L-1,0.5equ.),即按照2:1的摩尔比混合,发生配位作用,得到HBTP-Cu2+复合物的水溶液。
以上所述的荧光探针的合成路线,如下所示:
通过采用上述技术方案,本发明的有益效果如下:
本发明公开的制备方法相较传统的有机分子探针,省去了繁琐的有机合成步骤。该制备方法的优点在于,制备方法简便易行,可于纯水环境中原位构建,且所得产物HBTP-Cu2+复合物可直接用于后续识别检测。
优选的,所述PBS缓冲溶液的pH值控制在7.0~8.0之间。
需要说明的是,本发明优选该PBS缓冲溶液的pH值为7.0~8.0是以生理环境的pH值作为依据,其更有利于后期细胞内酶活性的测定。
作为优选,本发明实验所采用的pH为7.4,
优选的,所述探针母液与所述CuCl2溶液的摩尔比为2:1,且所述探针母液的浓度为2.0~3.0mmol/L,所述CuCl2溶液的浓度为0.05~0.20mol/L。
另外,参见说明书附图1~2,发明人通过核磁共振氢谱、质谱进行表征,表明复合物HBTP-Cu2+合成成功。
本发明还有一个目的,就是提供HBTP-Cu2+复合物在溶剂体系中选择性识别乙酰胆碱酯酶的应用。
优选的,水的体积百分数为95~100%。
该策略检测乙酰胆碱酯酶的优点在于,HBTP-Cu2+复合物可于水环境中原位构建,产物可直接进入检测的环节,且具有极低的检测限。
另外,本发明还提供HBTP-Cu2+复合物进入细胞中检测细胞内源性乙酰胆碱酯酶中的应用。
本发明提供了一种具有大斯托克斯位移的荧光探针HBTP,该探针具有激发态分子内质子转移性质,Cu2+与其发生配位作用时荧光猝灭。HBTP-Cu2+复合物可以通过乙酰胆碱酯酶特异性催化乙酰胆碱产生的硫代胆碱与Cu2+的竞争性配位破坏复合物配位结构,从而引起HBTP的释放,通过开启型荧光实现对乙酰胆碱酯酶的检测。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明提供了一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针及其制备方法与应用。本发明公开的荧光探针通过在水溶液中将探针母液和CuCl2溶液混合即可快速得到该复合物,相较传统的有机分子探针,省去了繁琐的有机合成步骤,制备方法简便易行,可于纯水环境中原位构建,且所得产物HBTP-Cu2+复合物可直接用于后续识别检测。因此本发明所公开的用于检测乙酰胆碱酯酶的方法策略极具市场应用与推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明荧光探针HBTP和HBTP-Cu2+复合物的1H NMR图。
图2附图为本发明HBTP-Cu2+复合物的HRMS图。
图3附图是本发明荧光探针HBTP与Cu2+配位的结合比例荧光谱图。
图4附图为本发明荧光探针HBTP,HBTP-Cu2+复合物以及EDTA-Cu2+复合物的荧光发射光谱图。
图5附图为本发明HBTP-Cu2+复合物对乙酰胆碱酯酶选择性检测的荧光图。
图6附图为相对荧光强度值I514nm/I650nm与乙酰胆碱酯酶活性的线性响应曲线。
图7附图为本发明HBTP-Cu2+复合物对HEK293细胞内源性乙酰胆碱酯酶检测的荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种高灵敏度、高选择性的用于检测乙酰胆碱酯酶的HBTP-Cu2+复合物荧光探针及其制备方法与应用。
为更好地理解本发明,下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述,但不可理解为对本发明的限定,对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整,也视为落在本发明的保护范围内。
本发明公开了一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针,所述荧光探针为HBTP-Cu2+复合物,且所述HBTP-Cu2+复合物的结构单元HBTP的结构式为:
一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针的制备方法,所述方法具体步骤如下所述:
室温下于PBS缓冲溶液中加入探针母液和CuCl2溶液,搅拌发生配位反应,得到目标产物HBTP-Cu2+复合物荧光探针。
优选的,所述PBS缓冲溶液的pH值控制在7.5~8.5之间。
优选的,所述探针母液与所述CuCl2溶液的摩尔比为2:1,且所述探针母液的浓度为2.0~3.0mmol/L,所述CuCl2溶液的浓度为0.05~0.20mol/L。
一种HBTP-Cu2+复合物荧光探针在溶剂体系中选择性识别乙酰胆碱酯酶的应用。
为了进一步实现本发明的技术效果,所述溶剂体系中,水的体积百分数为95~100%。
一种HBTP-Cu2+复合物荧光探针进入细胞中检测细胞内源性乙酰胆碱酯酶中的应用。
下面,将结合具体实施例,对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1
HBTP-Cu2+复合物的制备方法:室温下于2mL PBS缓冲溶液中(pH=7.5)加入探针母液(8μL,2.0mmol·L-1)和CuCl2溶液(0.1μL,0.05mol·L-1,0.5equ.),即按照2:1的摩尔比混合,发生配位作用,得到HBTP-Cu2+复合物的水溶液。
实施例2
HBTP-Cu2+复合物的制备方法:室温下于2mL PBS缓冲溶液中(pH=7.8)加入探针母液(8μL,2.5mmol·L-1)和CuCl2溶液(0.1μL,0.1mol·L-1,0.5equ.),即按照2:1的摩尔比混合,发生配位作用,得到HBTP-Cu2+复合物的水溶液。
实施例3
HBTP-Cu2+复合物的制备方法:室温下于2mL PBS缓冲溶液中(pH=8.0)加入探针母液(8μL,2.8mmol·L-1)和CuCl2溶液(0.1μL,0.15mol·L-1,0.5equ.),即按照2:1的摩尔比混合,发生配位作用,得到HBTP-Cu2+复合物的水溶液。
实施例4
HBTP-Cu2+复合物的制备方法:室温下于2mL PBS缓冲溶液中(pH=8.2)加入探针母液(8μL,2.8mmol·L-1)和CuCl2溶液(0.1μL,0.15mol·L-1,0.5equ.),即按照2:1的摩尔比混合,发生配位作用,得到HBTP-Cu2+复合物的水溶液。
为了进一步验证本发明的优异效果,发明人还进行了如下实验:
实验1
HBTP-Cu2+复合物的制备方法:室温下于2mL PBS缓冲溶液中(pH=8.5)加入探针母液(8μL,3.0mmol·L-1)和CuCl2溶液(0.1μL,0.2mol·L-1,0.5equ.),即按照2:1的摩尔比混合,发生配位作用,得到HBTP-Cu2+复合物的水溶液。
具体参见说明书附图1和图2,图1为荧光探针HBTP和HBTP-Cu2+复合物在重水中的1HNMR图,图2为HBTP-Cu2+复合物的HRMS图。
由图1可看出Cu2+与HBTP配位形成纯净的HBTP-Cu2+复合物,在图2中,m/z=403.5932为HBTP与Cu2+按摩尔比为2:1结合生成的配合物HBTP-Cu2+([C46H40N4O2S2Cu]2+)的信号峰,其与理论计算值(403.5939)一致。
综上从1HNMR和HRMS图谱证明了HBTP-Cu2+复合物制备成功。
实验2
确定荧光探针HBTP与Cu2+配位的结合比例
通过等摩尔连续变化法(Job法)测得Cu2+与HBTP的结合比。室温下于12支离心管中分别加入2mL PBS缓冲溶液(pH=7.4),依次加入0,1.6,3.2,4.8,6.4,8.0,9.6,11.2,12.8,14.4和16μL的HBTP母液(2.5mmol·L-1),分别测其荧光光谱F1,随后分别加入4.0,3.6,3.2,2.8,2.4,2.0,1.6,1.2,0.8,0.4和0μL的CuCl2溶液(10.0mmol·L-1),此时保证每支样品管中Cu2+与HBTP的总浓度为16μM,分别测其荧光光谱F2。取650nm处的前后荧光强度数值,计算荧光猝灭强度即为ΔInt.650nm,并作ΔInt.650nm与[Cu2+]/([Cu2+]+[HBTP])的关系图,如图3所示。
通过图3得知,固定Cu2+和HBTP总浓度为20μM,改变二者比例,考察荧光变化。荧光猝灭值在[Cu2+]/([Cu2+]+[HBTP])达到0.33时达到最大,说明Cu2+与HBTP比例达到1:2时荧光猝灭程度最高,从而说明Cu2+与HBTP的结合比为1:2。
实验3
室温下于2mL PBS缓冲溶液(pH=7.4)中加入HBTP母液(8μL,2.5mmol·L-1),获得其荧光光谱后加入CuCl2溶液(0.1μL,0.1mol·L-1),并测其荧光光谱,最后向其中加入EDTA溶液(0.2μL,0.1mol·L-1),同时考察荧光光谱变化,具体参见附图4。
由图4可知,证明引起HBTP荧光猝灭的原因是其与Cu2+的配位作用,并且该配位作用可逆,可通过另一种结合能力更强的螯合剂将Cu2+竞争下来,以实现HBTP的荧光恢复。
实验4
HBTP-Cu2+复合物在纯水体系中对乙酰胆碱酯酶识别性能的研究
分别取0.3mL PBS溶液于一系列2mL比色管中,然后向每支比色管中加入底物乙酰胆碱(2μL,0.1mol·L-1),再依次向每支比色管中分别加入乙酰胆碱酯酶(1μL,10U/mL),阴离子(F-,Cl-,I-,CO3 2-,HCO3 -,NO3 -,NO2 -,PO4 2-,ppi,S2-和AcO-)的水溶液(0.1mol·L-1)1μL,此时阴离子浓度为复合物浓度的10倍,混匀后于37℃放置30分钟,再将比色管的溶液分别加至一系列含有HBTP-Cu2+复合物水溶液的5mL比色管中,测试其吸收光谱和荧光光谱。结论如下:
当在HBTP-Cu2+复合物中分别加入上述各种阴离子的水溶液时,只有乙酰胆碱酯酶的加入使HBTP-Cu2+复合物体系的荧光呈现开启响应。
在荧光光谱中,乙酰胆碱酯酶的加入使HBTP-Cu2+复合物的纯水体系在650nm处的发射峰明显增强,而其他阴离子的加入对HBTP-Cu2+复合物水溶液的荧光没有较明显的影响(结合说明书附图5)。
实验5
HBTP-Cu2+复合物对乙酰胆碱酯酶最低检测限的测定
在37℃时,通过荧光发射光谱,根据乙酰胆碱酯酶的滴定实验,通过3sB/S计算,得到HBTP-Cu2+复合物对乙酰胆碱酯酶的最低检测限达0.018mU·mL-1,说明HBTP-Cu2+复合物对乙酰胆碱酯酶的检测灵敏度高,表明该复合物在水溶液中对乙酰胆碱酯酶高效检测方面有潜在的应用价值。并且通过图(6)表明荧光探针的相对荧光强度I514nm/I650nm与ALP的浓度在0~60mU·mL-1范围内线性相关(r2=0.992)
实验6
HBTP-Cu2+复合物对于HEK293细胞内源性乙酰胆碱酯酶的检测
将本发明用于HEK293细胞中内源性乙酰胆碱酯酶的荧光成像应用,具体步骤如下:首先将HEK293细胞与NEM(5mmol·L-1)一起培养30分钟以消除细胞内硫醇,以防对荧光研究产生干扰。用PBS缓冲液洗涤后,将细胞与制备的HBTP-Cu2+复合探针(5μmol·L-1)一起培养30分钟,并在458nm激发下记录荧光图像。
图7为HBTP-Cu2+复合物对细胞内源性乙酰胆碱酯酶检测的荧光成像图。由图7a可以看出,在观察条件下复合物本身是不发光的,并且细胞样品中剩余的物质不能诱导HBTP荧光恢复。然而,在用100μmol·L-1乙酰胆碱进一步处理30分钟后,观察到红色荧光,如图7b所示,说明乙酰胆碱酯酶特异性催化乙酰胆碱产生的硫代胆碱与Cu2+的竞争性配位破坏复合物配位结构,使HBTP释放,恢复其荧光。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言,由于其与实施例公开的方法相对应,所以描述的比较简单,相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
3.根据权利要求2所述的一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针的制备方法,其特征在于,所述PBS缓冲溶液的pH值控制在7.5~8.5之间。
4.根据权利要求2所述的一种测定乙酰胆碱酯酶的荧光探针的制备方法,其特征在于,所述HBTP母液与所述CuCl2溶液的摩尔比为2:1,且所述HBTP母液的浓度为2.0~3.0mmol/L,所述CuCl2溶液的浓度为0.05~0.20mol/L。
5.如权利要求1所述的荧光探针或根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法制备的荧光探针在溶剂体系中选择性识别乙酰胆碱酯酶的应用。
6.根据权利要求5所述的荧光探针在溶剂体系中选择性识别乙酰胆碱酯酶的应用,其特征在于,所述溶剂体系中,水的体积百分数为95~100%。
7.一种如权利要求1所述的荧光探针或根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法制备的荧光探针以非疾病的治疗与诊断的目的进入细胞中检测细胞内源性乙酰胆碱酯酶中的应用。
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荧光铜纳米粒子检测乙酰胆碱酯酶活性;张楠等;《青岛科技大学学报(自然科学版)》;20181231;第39卷(第6期);第17-25页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN110028503A (zh) | 2019-07-19 |
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