CN113307759B - 一种菁类近红外荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菁类近红外荧光探针及其制备方法与应用，本发明公开的菁类近红外荧光探针是以酯酶对花菁染料中键连的酯键的水解作为基本作用机制，并以花菁‑氨基醇的H‑型聚集体发光作为荧光信号报告基团。当向体系中加入酯酶时，酯酶可切断Cy‑NE结构中的酯键，O‑离子引起Smiles重排反应，从而导致溶液的颜色和荧光变化。本发明通过比色法、紫外‑可见吸收光谱法、荧光光谱法研究了菁类近红外荧光探针对酯酶的识别效果，结果表明此近红外荧光探针在PBS溶液体系中能够高效选择性识别酯酶，且对酯酶具有很高的响应灵敏度。

Description

一种菁类近红外荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于酯酶检测技术领域，涉及一种用于检测羧酸酯酶的方法策略，尤其涉及一种基于Smiles重排过程的荧光探针Cy-NE的检测方法。本发明同时还涉及该探针的合成方法及其在检测酯酶中的应用。
背景技术
迄今，已经报道了几例检测酯酶活性的荧光探针，检测的信号多是探针酶切后释放的物质，酯酶催化探针中酯键断裂时，探针荧光恢复，从而反映出酯酶活性。不足之处是，单一通道或者发射的探针容易受到测试环境(如温度、pH、溶剂极性等)和探针浓度等因素的影响。
与紫外-可见光相比，近红外(NIR)光对生物样品的光损伤小、组织的穿透性好、受复杂生命系统的自身荧光干扰弱，更利于生物成像。且具有两个发射信号的比率型荧光探针为定量分析提供内置校正，可用于准确检测复杂生命环境中的酯酶活性。
目前报道的比率型酯酶荧光探针大多基于分子内电荷转移(ICT)和荧光共振能量转移(FRET)的光物理机制设计，荧光发射峰位移小(通常在100nm以内)，容易受到两个发射信号的串扰，不利于肿瘤细胞/组织的精准成像。
因此，如何开发一种能用于酯酶活性精准检测且具有较大发射峰位移的近红外比率型荧光探针仍然是一个挑战。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种高选择性和高敏感性的菁类近红外荧光探针。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种菁类近红外荧光探针，所述荧光探针Cy-NE的结构式为：
Figure BDA0003056755230000021
所述菁类近红外荧光探针以Cy-NE和酯酶作用作为基本作用机制，并以Cy-NE发光作为荧光信号报告基团。当向体系中加入酯酶时，酯酶可与探针结构中的酯键作用，探针结构从而改变，释放的物质经过smiles重排反应使得在紫外吸收发生红移，且在与酯酶作用过程中，在583nm会出现聚集峰，这种双通道荧光变化的特点更易达到检测酯酶活性的目的。
其中，所述荧光探针Cy-NE的合成方法具体包括如下步骤：
(1)以二氯甲烷为反应溶剂，氨基花菁Cy-N为底物，2,6-二甲基吡啶为反应用碱，逐渐加入乙酰氯的二氯甲烷溶液，于室温条件下搅拌反应10-12h；
(2)将步骤(1)得到的反应溶液减压蒸馏，随后用水与二氯甲烷萃取得到反应粗产物；
(3)向步骤(2)得到的反应粗产物中加入二氯甲烷溶剂，随后经柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝50：1)提纯，即可得到所述菁类近红外荧光探针Cy-NE。
本发明通过实验筛选，Cy-NE合成过程中的催化剂使用的是吡啶类物质，本发明以2,6-二甲基吡啶为例。
优选的，所述氨基花菁Cy-N与乙酰氯的摩尔比为1:(50～100)，所述Cy-NE与2,6-二甲基吡啶的摩尔比为1:(3～9)。
以及，上述单体化合物Cy-NE的合成路线如下：
Figure BDA0003056755230000022
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明公开的制备方法与传统的荧光探针制备方法相比，操作简单、提纯方便。
示范性的，本发明最优选的制备方案为：
步骤一：N-甲基-N-羟乙基花菁(Cy-N)的合成；
以无水DMF作为溶剂，以七甲川花菁、2-甲氨基乙醇作为底物。
向圆底烧瓶中加入0.12g的七甲川花菁，再加入5-10mL的无水DMF让其溶解；随后加入150μL的甲氨基乙醇，密闭条件下加热至80℃反应6小时；
步骤二：将步骤一的产物(Cy-N)经萃取(二氯甲烷:水)后，有机相经减压蒸馏除去溶剂，再用无水二氯甲烷溶在圆底烧瓶中，加入2,6-二甲基吡啶作为催化剂，密闭条件下慢慢滴加乙酰氯，冰浴搅拌过夜，即可得到所述菁类近红外荧光探针。
示范性的，参见说明书附图1～3，本发明通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、紫外光谱及荧光光谱的表征，以表明所述菁类近红外荧光探针合成成功。
本发明还有一个目的，就是提供菁类近红外荧光探针在对酯酶的选择性识别和定量检测中的应用。
在一些应用场景中，所述荧光探针在缓冲溶液中选择性检测酯酶的应用。
进一步的，所述酯酶在肿瘤细胞中过度表达。
本发明公开的Cy-NE是基于Smiles重排的一种近红外荧光探针，酯酶作用探针酯键后释放出荧光团CY-N，在pH的作用下CY-N经重排为CY-O，并且在重排过程中会发生荧光团与酯酶的聚集，从而可以更加直观的呈现出酯酶对探针的作用，且基于Cy-NE荧光探针检测酯酶的机理如下：
Figure BDA0003056755230000041
该策略检测酪氨酸酶的优点在于，所述菁类近红外荧光探针能够高效选择性识别酯酶，且对酯酶具有较高的灵敏度，少量的探针即可对酯酶作出响应。
具体地，在Cy-NE荧光探针的缓冲体系中，加入酯酶的水溶液，若受体化合物的缓冲体系由蓝色变为淡绿色，则加入的是酯酶；若Cy-NE荧光探针的缓冲体系颜色无明显变化，则加入的不是酯酶。
在Cy-NE荧光探针的缓冲体系中，加入酯酶的水溶液，在相应的紫外光谱中，酯酶的加入使组装体的缓冲体系在585nm和760nm处的吸收峰增强，同时在688nm处的吸收峰减弱，而其他酯酶的加入对探针于缓冲体系的紫外光谱无明显影响。
在含有Cy-NE的缓冲体系中，加入酯酶的水溶液，在相应的荧光光谱中，酯酶的加入使Cy-NE的缓冲体系在583nm和790nm处的发射峰明显增强，且Cy-NE的缓冲体系在颜色由蓝色变为绿色，而其他物质的加入对Cy-NE水溶液的荧光没有较明显的影响。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种菁类近红外荧光探针及其制备方法与应用。
首先，本发明公开的Cy-NE探针是以Cy-NE和酯酶作用作为基本作用机制，并以Cy-NE发光作为荧光信号报告基团。当向体系中加入酯酶时，酯酶可与探针结构中的酯键作用，探针结构从而改变，释放的物质经过smiles重排反应使得在紫外吸收发生红移，且在与酯酶作用过程中，在583nm会出现聚集峰，这种双通道荧光变化的特点更简易达到检测酯酶活性的目的。
其次，本发明还公开了所述菁类近红外荧光探针的制备方法。该制备方法操作简单、提纯方便快捷，具有良好的工业化应用潜力。
最后，本发明公开了所述菁类近红外荧光探针的应用，所述菁类近红外荧光探针Cy-NE在纯水溶剂体系中能够高效选择性识别酯酶，并对酯酶具有很高的灵敏度。
综合上述分析可知，本发明制备的菁类近红外荧光探针可高灵敏度、高选择性的检测酯酶，该方法策略极具市场应用与推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明Cy-NE在氘代DMSO中的核磁共振氢谱。
图2为本发明Cy-NE在氘代DMSO中的核磁共振碳谱。
图3为本发明Cy-NE的质谱图。
图4为本发明Cy-NE在缓冲体系中与酯酶相互作用时的紫外可见光谱图。
图5为本发明Cy-NE在缓冲体系中与不同浓度的酯酶相互作用时的荧光光谱图。
图6为本发明Cy-NE在缓冲体系中与酯酶及其他生物分析相互作用时的荧光光谱图。
图7中(a)为空白对照；(b)为HepG2细胞与探针Cy-NE孵育30min后的荧光成像；(c)为HepG2细胞外加酯酶后再与探针Cy-NE孵育30min后的荧光成像；(d)为HepG2细胞经酯酶抑制剂(AEBSF)处理后再与探针Cy-NE孵育30min后的荧光成像。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种高灵敏度、高选择性的用于检测酯酶的菁类近红外荧光探针及其制备方法与应用。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1
菁类近红外荧光探针化合物(Cy-NE)的合成：
将CY-N(0.43mmol)与2.6-二甲基吡啶(2.1mmol)混合于二氯甲烷(20mL)中，22℃加热搅拌10h即可；待反应结束后减压蒸馏除去溶剂，得到蓝色固体；随后将反应粗产物用二氯甲烷与水萃取后减压蒸馏除去溶剂，再用二氯甲烷与甲醇经柱色谱提纯后，得到纯的荧光探针Cy-NE。
实施例2
菁类近红外荧光探针化合物(Cy-NE)的合成：
将CY-N(0.43mmol)与2.6-二甲基吡啶(3.9mmol)混合于二氯甲烷(20mL)中，密闭条件下滴加用无水二氯甲烷稀释的乙酰氯(43.0mmol)，室温搅拌反应10h即可；待反应结束后减压蒸馏除去溶剂，得到蓝色固体；随后将反应粗产物用二氯甲烷与水萃取后，有机相减压蒸馏除去溶剂，再用二氯甲烷与甲醇经柱色谱提纯后，得到纯的荧光探针Cy-NE。
实施例3
菁类近红外荧光探针化合物(Cy-NE)的合成：
将CY-N(0.43mmol)与2.6-二甲基吡啶(2.58mmol)混合于二氯甲烷(20mL)中，密闭条件下滴加用无水二氯甲烷稀释的乙酰氯(34.0mmol)，室温搅拌反应10h即可；待反应结束后减压蒸馏除去溶剂，得到蓝色固体；随后将反应粗产物用二氯甲烷与水萃取后，有机相减压蒸馏除去溶剂，再用二氯甲烷与甲醇经柱色谱提纯后，得到纯的荧光探针Cy-NE。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，其中一个或几个实施例的组合同样也可以实现本发明目的。
为了进一步验证本发明的优异效果，发明人还进行了如下实验：
实验1：探针的合成及结构表征
1.探针化合物(Cy-NE)的合成
将CY-N(0.43mmol)与2.6-二甲基吡啶(1.7mmol)混合于二氯甲烷(20mL)中，22℃加热搅拌12h即可；待反应结束后减压蒸馏除去溶剂，得到蓝色固体；随后将反应粗产物用二氯甲烷与水萃取后减压蒸馏除去溶剂，再用二氯甲烷与甲醇经柱色谱提纯后，得到纯的荧光探针Cy-NE。
2.测试分析：
图1为探针Cy-NE的1H NMR图谱，具体谱峰值为：1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.56(d,J＝13.5Hz,2H),7.52(d,J＝7.5Hz,2H),7.35(t,J＝7.7Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),7.15(t,J＝7.4Hz,2H),5.97(d,J＝13.4Hz,2H),4.30(s,2H),4.08(d,J＝7.1Hz,4H),3.88(s,2H),3.37(s,3H),1.95(s,3H),1.76–1.71(m,2H),1.60(s,12H),1.25(t,J＝7.0Hz,6H)，其与探针基团相对应，可证明探针合成成功。
图2为探针Cy-NE的13C NMR图谱，具体谱峰值为：13C NMR(126MHz,DMSO)δ173.50,170.67,169.03,142.55,142.11,140.90,128.83,124.22,123.89,122.73,110.25,96.67,63.03,56.58,48.26,38.43,28.91,24.81,22.03,21.13,12.10，与探针基团对应，进一步证实该探针结构正确。
图3为探针Cy-NE的质谱图谱，具体信息为：M+：具体分子式为:C39H51N3O2 +，理论计算值:593.3976，实测值：593.3969，与探针对应，进一步证实该探针结构正确。
实验2：菁类近红外荧光探针对酯酶的选择性识别
分别取2mL的PBS缓冲溶液(10mmol·L-1)于一系列5mL比色管中，再依次向每支比色管中分别加入Glu,GSH,Asp,Na2S,NaHCO3,MgCl2,NaHSO3 -,Al3+,Pancreatin,Glucose,Telomerase,PKA,Elastase,Thrombin,Urea,TB,Esterase的水溶液(5×10-3mol·L-1)10μL，此时氨基酸浓度为组装体浓度的2倍，混匀后放置37℃环境中孵育3h，测试其吸收光谱和荧光光谱。结论如下：
(1)当在Cy-NE荧光探针体系中分别加入上述各种氨基酸的水溶液时，只有酯酶的加入使Cy-NE缓冲溶液体系由蓝色变浅绿色(结合说明书附图4)。
(2)在荧光光谱中，随着酯酶的加入Cy-NE荧光探针的缓冲体系在625nm处的发射峰明显增强(结合说明书附图5)。
(3)在荧光光谱中，酯酶的加入使Cy-NE荧光探针的缓冲体系在625nm处的发射峰明显增强，而其他氨基酸、离子以及蛋白质的加入对Cy-NE缓冲溶液的荧光没有较明显的影响(结合说明书附图6)。
因此，本发明制备的Cy-NE可实现在缓冲体系中选择性比色-荧光双通道识别酯酶。
实验3：菁类近红外荧光探针对酯酶最低检测限的测定
在25℃时，利用荧光发射光谱，根据酯酶对Cy-NE溶液的滴定实验，通过3sB/S计算，得到Cy-NE对酯酶的最低检测限达0.032mU/mL，说明Cy-NE对酯酶的检测灵敏度低，表明该探针在缓冲溶液中酯酶高效检测方面有潜在的应用价值。
实验4：荧光探针对于HepG2细胞内源性酯酶的检测
将HepG2细胞用(7μM)探针Cy-NE孵育30min，或者将HepG2细胞用(7μM)酯酶或酯酶抑制剂(AEBSF)预处理30min后再与探针Cy-NE孵育30min。之后在激光共聚焦下测量活细胞的荧光成像，分别收集红色发光区域和近红外区域的荧光信号。
图7中(a)为空白对照；(b)为HepG2细胞与探针Cy-NE孵育30min后的荧光成像；(c)为HepG2细胞外加酯酶后再与探针Cy-NE孵育30min后的荧光成像；(d)为HepG2细胞经酯酶抑制剂(AEBSF)处理后再与探针Cy-NE孵育30min后的荧光成像。由图7可知，探针在HepG2细胞内有明显的红色荧光出现，外加酯酶时红色荧光增强，当引入酯酶抑制剂(AEBSF)时红色荧光强度大幅降低，明显抑制了荧光。
由此可以得知该探针在细胞内仍具有良好的响应，为下一步生物体内的应用提供了一定的理论依据。
综上所述，本发明毋需繁冗复杂的有机合成步骤便制得Cy-NE，以及该荧光探针可于缓冲溶液中由比色-荧光双通道单一选择性识别酯酶，且该探针对酯酶的检测灵敏度很高，适于市面推广与应用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种菁类近红外荧光探针，其特征在于，所述荧光探针Cy-NE的结构式为：
Figure FDA0003662125680000011
2.一种如权利要求1所述的菁类近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)以二氯甲烷为反应溶剂，氨基花菁Cy-N为底物，2,6-二甲基吡啶为反应用碱，逐渐加入乙酰氯的二氯甲烷溶液，于室温条件下搅拌反应10-12h；
(2)将步骤(1)得到的反应溶液减压蒸馏，随后用水与二氯甲烷萃取得到反应粗产物；
(3)向步骤(2)得到的反应粗产物中加入二氯甲烷溶剂，随后经柱色谱提纯，即得到所述菁类近红外荧光探针Cy-NE；
合成路线如下：
Figure FDA0003662125680000012
3.根据权利要求2所述的一种菁类近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述氨基花菁Cy-N与乙酰氯的摩尔比为1:(50～100)，所述Cy-NE与2,6-二甲基吡啶的摩尔比为1:(3～9)。
4.一种如权利要求1所述的菁类近红外荧光探针或如权利要求2所述方法制备的荧光探针在对酯酶的非诊断目的的选择性识别和定量检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括所述荧光探针在缓冲溶液中非诊断目的的选择性检测酯酶的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酯酶在肿瘤细胞中过度表达。
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