CN113527389B - 快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速检测β‑半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用。该快速检测β‑半乳糖苷酶的荧光探针，其化学结构式如(I)所示：
本发明制备的近红外荧光探针结构新颖、水溶性好、灵敏度高、响应速度快；本发明制备的近红外荧光探针荧光背景低、抗干扰能力强、选择性好，能实时检测活细胞和活体斑马鱼内源性β‑半乳糖苷酶的活性；本发明的近红外荧光探针的制备方法原料易得、反应条件可控、合成简单。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其涉及一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶是一种特异性水解D-半乳糖的水解酶，它在维持正常的生命活动中具有重要作用。同时，β-半乳糖苷酶的过量表达与一系列的生理疾病密切相关，例如卵巢癌、肾小管损伤、莫尔丘综合症、GM1神经节苷脂沉积症等。研究表明，β-半乳糖苷酶在多种卵巢癌细胞中的活性均高于正常细胞，所以，β-半乳糖苷酶被广泛认为是卵巢癌的特异性生物标记物。因此，开发一种高效、高灵敏度的近红外荧光探针用于检测β-半乳糖苷酶的活性在卵巢癌相关诊断治疗方面具有重要意义。
荧光探针技术因其操作简单、灵敏度高、检测限低、响应快、抗干扰能力强等优点被广泛用于检测活细胞、组织或生物体中的生物标记物。目前，已报道了许多检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，包括近红外荧光探针、绿色发光荧光探针、黄色发光荧光探针。其中，近红外荧光探针由于组织穿透能力强，背景干扰低的优点更适用于检测活细胞和活体组织中的β-半乳糖苷酶。但是，目前只有大约十个基于β-半乳糖苷酶的近红外荧光探针被报道，这些近红外荧光探针存在着有机溶剂含量高或者响应速度慢或者无法用于活体组织检测等缺点，因此，发展一种水溶性的近红外荧光探针用于快速识别和灵敏检测活体中的β-半乳糖苷酶具有重要实际意义。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用，用以解决现有技术中近红外荧光探针水溶性差、响应速度慢或者无法用于活体组织检测的技术问题。
本发明的第一方面提供一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其化学结构式如(I)所示：
本发明的第二方面提供一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴与4-羟基苯甲醛在4-丁基溴化铵、氢氧化钠存在的条件下反应，经分离纯化得到中间体a；
将中间体a与NaBH4反应，经分离纯化得到中间体b；
将中间体b与PBr3反应，经分离纯化得到中间体c；
将IR-780与间苯二酚和K2CO3反应，经分离纯化得到中间体d；
将中间体c和中间体d在K2CO3和四丁基碘化铵存在的条件下回流反应，经分离纯化得到中间体e；
将中间体e与甲醇钠反应，经分离纯化得到探针目标化合物(I)。
本发明的第三方面提供一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在制备检测β-半乳糖苷酶的活性的产品中的应用，该检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于体内或体外检测β-半乳糖苷酶的活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明制备的近红外荧光探针结构新颖、水溶性好、灵敏度高(0.00013U/mL)、响应速度快(8min)；
本发明制备的近红外荧光探针荧光背景低、抗干扰能力强、选择性好，能实时检测活细胞和活体斑马鱼内源性β-半乳糖苷酶的活性；
本发明的近红外荧光探针的制备方法原料易得、反应条件可控、合成简单。
附图说明
图1为本发明荧光探针的HRMS谱图；
图2为本发明荧光探针与β-半乳糖苷酶反应前后的荧光光谱图；
图3为本发明荧光探针与不同时间的β-半乳糖苷酶反应的荧光光谱图；
图4为本发明荧光探针与不同浓度的β-半乳糖苷酶反应的荧光光谱图；
图5为本发明荧光探针对β-半乳糖苷酶的检测限测试图；
图6为本发明荧光探针对β-半乳糖苷酶的酶动力表征的双倒数图；
图7为本发明荧光探针在活细胞(A549和SKOV3)中检测β-半乳糖苷酶的荧光成像图；
图8为本发明荧光探针检测活体斑马鱼中β-半乳糖苷酶的荧光成像图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的第一方面提供一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其化学结构式如(I)所示：
本发明的近红外荧光探针与β-半乳糖苷酶的作用机制如下：荧光探针(I)由于含有吸电子的连接基团和识别基团，荧光探针处于荧光淬灭状态。当荧光探针识别β-半乳糖苷酶时，发生苯醚键断裂，催化离去D-半乳糖基团，然后自切除基团发生分子内的电荷转移，得到具有强近红外荧光的化合物(II)，通过监测产物的荧光强度，可以实时检测β-半乳糖苷酶的活性。
本发明的第二方面提供一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
S1、将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴与4-羟基苯甲醛在4-丁基溴化铵、氢氧化钠存在的条件下反应，经分离纯化得到中间体a。其中，2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴与4-羟基苯甲醛的摩尔比为1：(0.9～1.1)，进一步为1:1；2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴与4-丁基溴化铵的摩尔比为1：(0.1～0.3)，进一步为1:0.2；2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴与氢氧化钠的摩尔比为1：(0.5～2)，进一步为1：1.1。
S2、将中间体a与NaBH4反应，经分离纯化得到中间体b。其中，中间体a与NaBH4的摩尔比为1：(1～4)，进一步为1：(1.8～2.2)。
S3、将中间体b与PBr3反应，经分离纯化得到中间体c。其中，中间体b与PBr3摩尔比为1：(0.5～2)，进一步为1：0.5。
S4、将IR-780与间苯二酚和K2CO3反应，经分离纯化得到中间体d。其中，IR-780与间苯二酚、K2CO3的摩尔比为1：(1～3)：(1～3)，进一步为1：2：2。
S5、将中间体c和中间体d在K2CO3和四丁基碘化铵存在的条件下回流反应，经分离纯化得到中间体e。其中，中间体c与中间体d的摩尔比为1：(1～1.5)，进一步为1:1.2；中间体c与K2CO3、四丁基碘化铵的摩尔比为1：(1～5)：(0.2～1)，进一步为1:3:0.2。
S6、将中间体e与甲醇钠反应，经分离纯化得到目标化合物f，即探针目标化合物(I)。其中，中间体e与甲醇钠的摩尔比为1：(2～10)，进一步为1:6.4。
进一步地，上述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴溶解于氯仿中制成溶液A，将4-丁基溴化铵溶解于水:氯仿＝1:1的混合溶剂中制成溶液B，将4-羟基苯甲醛溶解在含有NaOH的水中制成溶液C，将溶液A和溶液C缓慢加入到溶液B中，在40～50℃搅拌过夜后，产物分别用NaOH水溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥有机相，硅胶柱层析分离，得到中间体a。
(2)将中间体a溶解于CHCl3和iPrOH的混合溶剂中，再分批加入NaBH4室温反应2～10小时，加入含有10wt％柠檬酸水溶液，并分别用10wt％的NaHCO3溶液和水洗涤后，收集有机相，并用Na2SO4干燥、真空蒸发溶剂、硅胶柱层析分离，得到中间体b。
(3)将中间体b溶解于二氯甲烷中，再加入PBr3，在-2～2℃反应1～5小时，将反应混合物依次用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，减压干燥，得到中间体c。
(4)将IR-780溶于乙腈中制成溶液D，将间苯二酚和K2CO3溶于乙腈中制成溶液E，将溶液D和溶液E混合，40～60℃反应2～10小时，真空蒸发溶剂，粗产物通过柱色谱纯化，得到中间体d。
(5)将K2CO3和四丁基碘化铵溶解于丙酮溶液中，再加入中间体c和中间体d，在60～80℃回流反应12～48小时，将反应液减压浓缩后硅胶柱层析分离，得到中间体e。
(6)将中间体e溶解于无水甲醇中制成溶液F，再将甲醇钠溶解于无水甲醇中制成溶液G，将溶液F和溶液G混合，常温搅拌反应1～5小时，随后用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析分离，得到目标化合物f。
在本发明的一个具体实施方式中，上述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，合成路线如下：
本发明的第三方面提供一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在制备检测β-半乳糖苷酶的活性的产品中的应用，该检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于体内或体外检测β-半乳糖苷酶的活性。
进一步地，该检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于水环境中β-半乳糖苷酶的定性定量检测。更进一步地，应用于浓度为0～0.03U/mL的β-半乳糖苷酶的定性定量的检测。
进一步地，该检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于细胞和斑马鱼内源性的β-半乳糖苷酶成像和检测，所述细胞适用于非治疗目的。
实施例1
一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)中间体a的合成：将糖基溴(0.02mol,8.20g)溶解在20ml氯仿中得到溶液A；将4-丁基溴化铵(4mmol,1.29g)溶解在水:氯仿＝1:1的20ml混合溶剂中搅拌并加热至45℃得到溶液B；将4-羟基苯甲醛(0.02mol,2.44g)溶解在含有NaOH(0.88g,0.022mol)30ml水中得到溶液C；将溶液A和溶液C缓慢加入到溶液B中，在45℃条件下搅拌12小时后，产物分别用20ml 5％NaOH水溶液、饱和食盐水水洗，无水硫酸钠干燥有机相、硅胶柱层析(V石油醚/乙酸乙酯＝5：1)分离得到白色固体(5.08g,产率56％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.93(s,1H),7.86(d,J＝8.6Hz,2H),7.13(d,J＝8.6Hz,2H),5.56–5.47(m,2H),5.23–5.13(m,2H),4.27–4.13(m,3H),2.20(s,3H),2.07(s,6H),2.03(s,3H)。
(2)中间体b的合成：在0℃下，将中间体a(2.0g，4.2mmol)溶解于60mLCHCl3和iPrOH(v/v＝3/1)的混合溶剂中，分批加入NaBH4(0.3g，8.1mmol)，使混合溶液达到室温并搅拌4小时，随后加入150mL含有10％柠檬酸(w/w)的水溶液，用10％(w/w)的NaHCO3溶液(50mL×3)和水(150mL)洗涤后收集有机相，并用Na2SO4干燥，真空蒸发溶剂，并将残余物通过硅胶快速色谱纯化(EtOAc/PE＝1:1)，得到白色固体(1.886g,93.88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30(d,J＝8.2Hz,2H),6.99(d,J＝8.1Hz,2H),5.59–5.38(m,2H),5.08(dd,J＝30.1,10.5Hz,2H),4.63(s,2H),4.16(ddd,J＝39.9,23.4,8.7Hz,3H),2.24–1.99(m,12H)。
(3)中间体c的合成：将中间体b(109mg，0.24mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)中，并冷却至0℃，滴加三溴化磷(1.0M的二氯甲烷溶液，0.12mL，0.12mmol)，并将该溶液在0℃搅拌1h，然后将反应混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(50mL)洗涤，并用盐水(50mL)洗涤，有机层用硫酸钠干燥，过滤，并通过旋转蒸发浓缩，并将残余物在减压下干燥，得到白色固体(107mg,86.3％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(d,J＝8.6Hz,2H),6.97(d,J＝8.6Hz,2H),5.54–5.43(m,2H),5.16–5.00(m,2H),4.48(s,2H),4.29–3.99(m,3H),2.19(s,3H),2.07(s,6H),2.02(s,3H).ESI-HRMS:Calcd for C21H25BrNaO10[M+Na]+539.0523,found539.0513。
(4)中间体d的合成：将IR-780(1g，1.5mmol)溶于20ml无水乙腈中得到溶液D，将间苯二酚(332mg，3.0mmol)和K2CO3(413mg，3.0mmol)溶解于20mL无水乙腈中，氮气条件下，35℃条件下反应30分钟，得到溶液E；然后向溶液E中加入溶液D，在50℃条件下反应4h，TCL检测进度；反应结束后，真空蒸发溶剂，粗产物通过柱色谱纯化(VDCM/VMeOH＝40:1)，获得墨绿色粉末状产物Cy-OH(0.41g，收率65％)。1H NMR(600MHz,chloroform-d):δ8.07(d,J＝14.1Hz,1H),7.30-7.21(m,3H),7.17(d,J＝9.2Hz,1H),7.02(t,J＝7.6Hz,1H),6.83(d,J＝7.5Hz,1H),6.71(d,J＝8.9Hz,1H),6.53(s,1H),5.63(d,J＝14.2Hz,1H),3.74(t,J＝7.2Hz,2H),2.64(t,J＝6.0Hz,2H),2.63(t,J＝6.0Hz,2H),1.91-1.75(m,4H),1.62(s,6H),1.03(t,J＝7.6Hz,3H)。
(5)中间体e的合成：在N2条件下，将碳酸钾(6.22mg,0.045mmol),四丁基碘化铵(1mg,0.003mmol)加入到2.5ml的丙酮溶液中，再将中间体d(10mg,0.018mmol)加入到上述溶液中，常温搅拌30分钟，继续加入中间体c(7.71mg,0.015mmol)，70℃反应24小时；将反应液减压浓缩后，硅胶柱层析分离(VDCM/VMeOH＝40:1)，得到蓝绿色粉末，产率30％。ESI-HRMS:Calcd for C49H54NO12[M]+848.3641,found 848.3608。
(6)荧光探针f的合成：将中间体e(49mg,0.05mmol)溶解在8ml的无水甲醇中得到溶液F，将甲醇钠(17.28mg,0.32mmol)溶解在2ml无水甲醇中得到溶液G，将溶液G逐滴加入到溶液F中，常温搅拌2小时后，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，硅胶柱层析法过柱，得到24.6mg产物，产率61％。ESI-HRMS:Calcd for C41H46NO8[M]+680.3218,found 680.3181。
试验组1
测试实施例1与β-半乳糖苷酶反应的响应效果。
使用PBS(pH＝7.4)缓冲液配制100μM的实施例1中化合物f的溶液，用(pH＝7.4)缓冲液配制1U/mL的β-半乳糖苷酶储液。取100μL上述化合物f的溶液和900μL PBS(pH＝7.4)缓冲液于比色皿中，检测其680nm激发下的荧光光谱图；同时取100μL上述化合物f的溶液、895μL PBS(pH＝7.4)缓冲液和5μL的β-半乳糖苷酶储液于比色皿中，检测其680nm激发下的荧光光谱图，如图2所示。
从图2荧光光谱可以看出，荧光探针本身背景较低，当与β-半乳糖苷酶共孵育后，荧光强度急剧增加，在705nm的荧光强度增加31倍，说明该探针是一种近红外的荧光增强型β-半乳糖苷酶探针。
试验组2
测定实施例1所得荧光探针与β-半乳糖苷酶反应的荧光强度随时间的变化。
向比色皿中加入上述化合物f的溶液(工作浓度10μM)、PBS(pH＝7.4)缓冲液，β-半乳糖苷酶(工作浓度0.02U/mL)，每隔1分钟检测该反应体系在680nm激发下的荧光光谱图，如图3所示。
从图3可以看出，8分钟以内，反应体系在的荧光强度随与β-半乳糖苷酶的反应时间成正比关系，8分钟以后，荧光强度几乎不变，说明该探针在8分钟可以快速检测β-半乳糖苷酶，响应速度快。
试验组3
测定实施例1所得荧光探针与不同浓度的β-半乳糖苷酶反应的荧光光谱图。
向比色皿中加入上述化合物f的溶液(工作浓度10μM)、PBS(pH＝7.4)缓冲液和不同工作浓度(0,0.004,0.008,0.012,0.016,0.02,0.03,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20,0.24,0.28U/mL)的β-半乳糖苷酶，检测反应体系8分钟后的荧光光谱图，如图4所示。
从图4可以看出，在一定浓度范围内，反应体系在705nm处的荧光强度随β-半乳糖苷酶的浓度增加而增加，说明该探针可以检测不同浓度下的β-半乳糖苷酶。
试验组4
测定实施例1所得荧光探针检测β-半乳糖苷酶的检测限。
向比色皿中加入上述化合物f的溶液(工作浓度10μM)、PBS(pH＝7.4)缓冲液和(0、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02、0.03U/mL)β-半乳糖苷酶反应8分钟后在705nm处的荧光强度和β-半乳糖苷酶的线性关系图，如图5所示。
从图5中可以看出705nm处的荧光强度和β-半乳糖苷酶浓度呈良好的线性关系，说明在(0-0.03U/mL)的范围内，荧光探针可以定量检测β-半乳糖苷酶的活性。同时，依据线性关系，测得该探针检测β-半乳糖苷酶的检测限为0.00013U/mL，说明探针对β-半乳糖苷酶具有极低的检测限。
试验组5
测定实施例1所得荧光探针β-半乳糖苷酶的酶动力表征的双倒数图。
将0.02U/mL的β-半乳糖苷酶与不同浓度(1、2、4、6、8、10、15、20、30μM)的荧光探针反应，测试其荧光强度随反应时间的变化。荧光强度与反应时间曲线的斜率即为反应速率。将反应速率的倒数对荧光探针浓度的倒数进行双倒数作图，测试β-半乳糖苷酶对该探针的Km和Vmax，如图6所示。
从图6中可以看出双倒数图呈良好的线性关系，并且通过计算得到β-半乳糖苷酶对该探针的Km和Kcat分别为23.51μM和58.13s-1，表明β-半乳糖苷酶对该探针具有良好的亲和力和催化速率。
试验组6
测定实施例1所得荧光探针检测活细胞中的β-半乳糖苷酶。
将实施例1所得荧光探针(工作浓度10μM)与活细胞(A549和SKOV3)共孵育30分钟，用PBS洗涤后对细胞进行近红外荧光成像；同时，将SKOV3与500μMβ-半乳糖苷酶抑制剂共孵育1小时，再用PBS洗去残留的抑制剂，再将该探针(工作浓度10μM)与SKOV3共孵育30分钟后，进行近红外荧光成像，如图7所示。
从图7中可以看出A549和SKOV3细胞均表现出了红色荧光，说明该探针可以检测内源性β-半乳糖苷酶的活性；同时由于SKOV3的荧光强度大于A549细胞，说明该探针可以区分卵巢癌细胞和其他癌细胞；并且，β-半乳糖苷酶抑制剂实验说明该探针可以特异性检测活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性。
试验组7
测定实施例1所得荧光探针对活体斑马鱼中β-半乳糖苷酶的成像检测。
将生长0～7天的斑马鱼幼苗培养于6孔板中分成三组，即实验组1、实验组2和空白对照组，每组5条斑马鱼幼苗。空白对照组为加入上述化合物f溶液，使探针工作浓度为10μM，孵育0小时用荧光倒置显微镜进行明场成像和红色通道的荧光成像。实验组1为加入上述化合物f溶液，使探针工作浓度为10μM，斑马鱼孵育6小时后直接用荧光倒置显微镜进行明场成像和红色通道的荧光成像；同时，实验组2为将斑马鱼与500μMβ-半乳糖苷酶抑制剂共孵育1小时，再用PBS洗去残留的抑制剂，再将该探针(工作浓度10μM)与斑马鱼共孵育6小时后，对斑马鱼进行近红外荧光成像，如图8所示。
从图8中可以看出，随着孵育时间的增加，斑马鱼的荧光强度越强，说明该探针可以检测斑马鱼中的内源性的β-半乳糖苷酶的活性，而与β-半乳糖苷酶抑制剂共孵育的斑马鱼则几乎无荧光，说明该探针可以特异性检测活体组织中内源性β-半乳糖苷酶的活性。
由上可知，本发明的荧光探针与β-半乳糖苷酶作用后，在705nm处(红光)的荧光强度从弱到强不断增加，属于增强型近红外荧光探针。该荧光探针与0-0.03U/mL的β-半乳糖苷酶具有良好的线性响应关系，可实现低浓度的定性定量的检测，并且该探针对β-半乳糖苷酶的检测限为1.30×10-4U/mL，表现出了极高的灵敏度；该荧光探针可检测细胞及斑马鱼中内源性β-半乳糖苷酶的活性，在β-半乳糖苷酶相关疾病的检测方面具有潜在的应用价值。
为进一步体现本发明荧光探针的优势，现将本发明荧光探针与已报道的近红外β-半乳糖苷酶荧光探针性能总结至表1。
表1
通过表1可以看出，本发明荧光探针水溶性好、可用于长时间的活细胞和活体组织的检测；与水溶性好的荧光探针相比，本发明探针与β-半乳糖苷酶的响应时间只有8min，响应速率更快；并且，本发明探针能实现活细胞、活体斑马鱼内源性的检测和成像，具有卵巢癌疾病诊断的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其特征在于，其化学结构式如(I)所示：
2.根据权利要求1所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴与4-羟基苯甲醛在4-丁基溴化铵、氢氧化钠存在的条件下反应，经分离纯化得到中间体a；
将所述中间体a与NaBH4反应，经分离纯化得到中间体b；
将所述中间体b与PBr3反应，经分离纯化得到中间体c；
将IR-780与间苯二酚和K2CO3反应，经分离纯化得到中间体d；
将所述中间体c和所述中间体d在K2CO3和四丁基碘化铵存在的条件下回流反应，经分离纯化得到中间体e；
将所述中间体e与甲醇钠反应，经分离纯化得到探针目标化合物(I)；
合成路线如下：
3.根据权利要求2所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴与4-羟基苯甲醛、4-丁基溴化铵、氢氧化钠的摩尔比为1：(0.9～1.1)：(0.1～0.3)：(0.5～2)；所述中间体a与NaBH4的摩尔比为1：(1～4)；所述中间体b与PBr3摩尔比为1：(0.5～2)。
4.根据权利要求2所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述IR-780与间苯二酚、K2CO3的摩尔比为1：(1～3)：(1～3)。
5.根据权利要求2所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述中间体c与中间体d、K2CO3、四丁基碘化铵的摩尔比为1：(1～1.5)：(1～5)：(0.2～1)；所述中间体e与甲醇钠的摩尔比为1：(2～10)。
6.根据权利要求2所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴溶解于氯仿中制成溶液A，将4-丁基溴化铵溶解于水:氯仿＝1:1的混合溶剂中制成溶液B，将4-羟基苯甲醛溶解在含有NaOH的水中制成溶液C，将溶液A和溶液C缓慢加入到溶液B中，在40～50℃搅拌过夜后，产物分别用NaOH水溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥有机相，硅胶柱层析分离，得到中间体a；
(2)将中间体a溶解于CHCl3和iPrOH的混合溶剂中，再分批加入NaBH4室温反应2～10小时，加入含有10wt％柠檬酸水溶液，并分别用10wt％的NaHCO3溶液和水洗涤后，收集有机相，并用Na2SO4干燥、真空蒸发溶剂、硅胶柱层析分离，得到中间体b；
(3)将中间体b溶解于二氯甲烷中，再加入PBr3，在-2～2℃反应1～5小时，将反应混合物依次用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，减压干燥，得到中间体c；
(4)将IR-780溶于乙腈中制成溶液D，将间苯二酚和K2CO3溶于乙腈中制成溶液E，将溶液D和溶液E混合，40～60℃反应2～10小时，真空蒸发溶剂，粗产物通过柱色谱纯化，得到中间体d；
(5)将K2CO3和四丁基碘化铵溶解于丙酮溶液中，再加入中间体c和中间体d，在60～80℃回流反应12～48小时，将反应液减压浓缩后硅胶柱层析分离，得到中间体e；
(6)将中间体e溶解于无水甲醇中制成溶液F，再将甲醇钠溶解于无水甲醇中制成溶液G，将溶液F和溶液G混合，常温搅拌反应1～5小时，随后用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析分离，得到探针目标化合物(I)。
7.一种如权利要求1所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在制备检测β-半乳糖苷酶的活性的产品中的应用，其特征在于，所述检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于体内或体外检测β-半乳糖苷酶的活性。
8.根据权利要求7所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在制备检测β-半乳糖苷酶的活性的产品中的应用，其特征在于，所述检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于水环境中β-半乳糖苷酶的定性定量检测。
9.根据权利要求8所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在制备检测β-半乳糖苷酶的活性的产品中的应用，其特征在于，所述检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于浓度为0～0.03U/mL的β-半乳糖苷酶的定性定量的检测。
10.根据权利要求7所述快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在制备检测β-半乳糖苷酶的活性的产品中的应用，其特征在于，所述检测β-半乳糖苷酶的活性的产品应用于细胞和斑马鱼内源性的β-半乳糖苷酶成像和检测，所述细胞适用于非治疗目的。
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Non-Patent Citations (3)
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| A novel near-infrared fluorescent probe for sensitive detection of β-galactosidase in living cells;Jingtuo Zhang et al.;《Analytica Chimica Acta》;20170308;第968卷;第97-104页 * |
| Enzyme-mediated nutrient release: glucose-precursor activation by β-galactosidase to induce bacterial growth;Naama Karton-Lifshin et al.;《Org. Biomol. Chem.》;20130224;第11卷;第2903-2910页 * |
| Specific Near-Infrared Probe for Ultrafast Imaging of Lysosomal β‑Galactosidase in Ovarian Cancer Cells;Xueqi Li et al.;《Anal. Chem.》;20200326;第92卷;第5772-5779页 * |
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