CN111763234A - 一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测β‑半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针化学结构式如(I)所示：
Figure DDA0002536594390000011
本发明提供的荧光探针灵敏度高，检测限低(0.168mU/mL)，选择性好，响应快，能特异性地检测β‑半乳糖苷酶的活性和含量，并基于该荧光探针首次建立了β‑半乳糖苷酶抑制剂筛选的荧光方法，其测试结果与商品化底物的测试结果一致，方法可靠。

Description

一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，涉及一种β-半乳糖苷酶的荧光增强型探针及其制备方法和在抑制剂筛选方面的应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶是一种水解糖苷键的水解酶，它广泛存在于各种动植物及微生物中，在维持正常的生命活动中具有重要作用。不仅如此，β-半乳糖苷酶的活性及含量还与多种疾病密切相关，例如卵巢癌、肾小管损伤、莫尔丘综合症、GM1神经节苷脂沉积症等。因此，发展一种廉价、高效、高灵敏度的检测方法用于β-半乳糖苷酶的活性检测和抑制剂筛选具有重要实际意义。
到目前为止，传统的β-半乳糖苷酶检测技术包括磁共振、比色法、化学发光法、电化学法、荧光探针法等。其中，荧光探针法因其灵敏度高、选择性好、操作简便、响应速度快、检测效率高等优点称为医学领域的研究热点。虽然目前报道了较多的β-半乳糖苷酶的荧光探针，但这类探针的合成相对复杂，成本相对较高，并且探针主要用于β-半乳糖苷酶在细胞水平或活体水平的成像诊断。用于β-半乳糖苷酶抑制剂筛选方面的探针极少报道。因此，发展一种用于β-半乳糖苷酶的活性检测和抑制剂筛选且廉价易得的、灵敏度高的β-半乳糖苷酶荧光探针具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种成本低、水溶性好、灵敏度高、比率型响应、可用于β-半乳糖苷酶的定性、定量活性检测和抑制剂筛选的荧光探针及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
提供一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其化学结构式如(I)所示：
Figure BDA0002536594370000021
本发明还提供上述检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其合成路线如下：
Figure BDA0002536594370000022
具体步骤如下：
1)将2,4-二羟基苯甲醛、丙酸钠混合，再加入丙酸酐、三乙胺，加热回流1～3小时，发生关环反应，反应完全后冷却，析出大量白色固体，纯化处理得到化合物a(3-甲基-7-(1-氧代丙氧基)-2H-黄酮-2酮)；
2)将化合物a溶于甲醇中，加入K2CO3后，室温(10～35℃)搅拌0.5～5小时，发生酯水解反应，反应完全后，用盐酸调节体系pH值至3-4，析出大量固体，将固体洗涤、真空干燥得到白色固体b(3-甲基-7-羟基-2H-香豆素)；
3)将化合物b、Na2SO4和Cs2CO3溶于乙腈溶液中，搅拌5～10min，然后加入2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物，在氮气氛围下室温反应2～12小时，发生成醚反应，待反应完全后，萃取、洗涤、柱层析得到白色固体c(3-甲基-7-((3,4,5-三乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧代)-2H-香豆素)；
4)将化合物c溶于甲醇中，加入甲醇钠后，室温搅拌1～3小时，发生脱乙酰基反应，反应完全后用稀盐酸调节pH值至6，提纯得到目标探针化合物d(3-甲基-7-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧代)-2H-香豆素)。
按上述方案，步骤1)所述2,4-二羟基苯甲醛、丙酸钠、丙酸酐与三乙胺的摩尔比为1：1～3：1～5：1～3。
按上述方案，步骤1)所述加热回流温度为150～180℃。
按上述方案，步骤2)所述化合物a与K2CO3的摩尔比为1：1～5。
按上述方案，步骤3)所述化合物b、Na2SO4、Cs2CO3与2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物的摩尔比为1：1～5：1～6：1～5。
按上述方案，步骤4)所述化合物c与甲醇钠的摩尔比为1：1～5。
本发明还包括上述检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在定性定量检测β-半乳糖苷酶的活性和含量方面的应用。
本发明还包括上述检测β-半乳糖苷酶的荧光探针用于β-半乳糖苷酶的抑制剂活性筛选方面的应用。
本发明的荧光探针与β-半乳糖苷酶的作用原理如下：荧光探针(I)由于含有吸电子半乳糖基团作为识别基团，使荧光探针处于荧光淬灭状态，当荧光探针检测到β-半乳糖苷酶时，半乳糖苷键首先断裂，释放出荧光基团3-甲基-7-羟基-2H-香豆素(II)，其荧光信号在465nm处的荧光逐渐变强，在390nm处的荧光信号逐渐减弱，通过检测荧光信号在465nm和390nm处荧光比值的变化，可以定性定量检测β-半乳糖苷酶的活性及含量。基于此原理，在检测体系中加入不同浓度的β-半乳糖苷酶的抑制剂，抑制剂可以特异性的抑制β-半乳糖苷酶的活性，从而减弱了体系释放荧光基团的能力，其荧光比值信号(465nm比390nm)减弱，其减弱程度与抑制剂的浓度成正比，以抑制剂的浓度为横坐标，以荧光比值信号为纵坐标，可拟合出IC50曲线并得到抑制剂的IC50值，因而可以测试抑制剂的活性并用于抑制剂的活性筛选。
Figure BDA0002536594370000031
本发明的有益效果在于：1、本发明提供的荧光探针灵敏度高，检测限低(0.168mU/mL)，选择性好，响应快，能特异性地检测β-半乳糖苷酶的活性和含量，并基于该荧光探针首次建立了β-半乳糖苷酶抑制剂筛选的荧光方法，其测试结果与商品化底物的测试结果一致，方法可靠。2、本发明提供的荧光探针通过对β-半乳糖苷酶实施荧光比率检测，即利用双重荧光信号的比值作为检测信号，因而比以往发现的单增强型探针检测准确性更高。3、本发明提供的荧光探针的制备方法合成步骤简便，原料易得，反应条件温和可控，相比于现有商品化的荧光探针成本较低。
附图说明
图1为本发明实施例1所得荧光探针的1H NMR谱图；
图2为实施例1所得荧光探针的13C NMR谱图；
图3为实施例1所得荧光探针的HRMS谱图；
图4为实施例1所得荧光探针的荧光基团的1H NMR谱图；
图5为实施例1所得荧光探针的荧光基团的13C NMR谱图；
图6为实施例1所得荧光探针的荧光基团的HRMS谱图；
图7为荧光探针检测β-半乳糖苷酶的高效液相色谱和质谱图；
图8为荧光探针检测β-半乳糖苷酶响应的紫外吸收光谱图；
图9为荧光探针检测β-半乳糖苷酶响应的荧光光谱图；
图10为荧光探针检测β-半乳糖苷酶时的荧光比值I465/I390与响应时间的关系图；
图11为不同浓度的β-半乳糖苷酶对荧光探针的滴定测试图；
图12为不同浓度的β-半乳糖苷酶对荧光探针在465nm处的滴定实验图；
图13为不同浓度的荧光探针对β-半乳糖苷酶的滴定测试图；
图14为荧光探针对β-半乳糖苷酶及其他分析物的选择性实验图；
图15为以荧光探针为底物测试不同浓度D-半乳糖对β-半乳糖苷酶的IC50抑制活性图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其制备方法包括以下步骤：
1)化合物a的合成：称取1g的2,4-二羟基苯甲醛(7.2mmol)，1.57g的丙酸钠(16.3mmol)置于25mL的圆底烧瓶中，量取3.16mL丙酸酐(24.5mmol)，1.15mL干燥的三乙胺(8.3mmol)加入到上述体系中，加热到170℃回流2h，TLC监测反应完全，反应结束后，冷却至室温，加水搅拌，此时有大量白色固体析出，然后用乙酸乙酯萃取，水洗有机相三次，无水MgSO4干燥，旋干，然后通过柱层析(丙烯酸乙酯:石油醚＝1:6，v/v)得到淡黄色固体，再用丙烯酸乙酯重结晶，真空干燥后得到产物a 1.1g，产率约为65％。产物a的1H NMR(400MHz,CDCl3)波谱：δ7.50(s,1H),δ7.40(d,1H),δ7.08(s,1H),δ7.01(s,1H),δ2.63(q,2H),δ2.21(t,3H),δ1.27(t,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ172.43,δ161.91,δ153.71,δ152.16,δ138.83,δ127.69,δ125.20,δ118.27,δ117.33,δ109.94,δ27.85,δ17.18,δ9.19；HRMS(ESI)calcd for C13H13O4 +:233.0808；Found:233.0522[M+H]+。
2)化合物b的合成：称取0.5g化合物a(2.15mmol)溶于40mL的甲醇中，加入0.595g的K2CO3(4.3mmol)，室温(25℃)搅拌30min，TLC监测反应完全，固体析出，用乙酸乙酯萃取，水洗有机相三次，无水Na2SO4干燥，旋干，不需进一步纯化，真空干燥得到白色固体(化合物b)0.35g，产率约为92％。化合物b的1H NMR谱图如图4所示，1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)波谱：δ10.43(s,1H),δ7.73(s,1H),δ7.42(d,1H),δ6.76(m,1H),δ6.71(d,1H),δ2.04(t,3H)；13CNMR谱图如图5所示，13C NMR(100MHz,(CD3)2SO):δ162.12,δ160.57,δ154.89,δ140.47,δ129.07,δ120.36,δ113.39,δ112.20,δ102.29,δ16.90；HRMS谱图如图6所示，HRMS(ESI)calcd for C10H9O3 +:177.0546；Found:177.0510[M+H]+。
3)化合物c的合成：称取200mg的化合物b(1.052mmol)，373.6mg Na2SO4(2.63mmol)，1.713g的Cs2CO3(5.26mmol)溶于30mL的乙腈溶液中，搅拌5min，然后加入648mg的2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物(1.578mmol)，在氮气氛围下室温反应12h，TLC监测反应完全，待反应完后，加水搅拌，然后用二氯甲烷萃取，水洗有机相两次，无水Na2SO4干燥，旋干，然后柱层析(丙烯酸乙酯:石油醚＝1:2，v/v)，真空干燥得到白色固体(化合物c)0.3g，产率约为52％。化合物c的1H NMR(400MHz,CDCl3)波谱：δ7.45(s,1H),δ7.31(d,1H),δ6.94(s,1H),δ6.89(d,1H),δ5.45(m,2H),δ5.12(m,2H),δ4.17(m,3H),δ2.16(s,3H),δ2.15(s,3H),δ2.08(s,3H),δ2.05(s,3H),δ2.00(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ170.47,δ170.20,δ170.08,δ169.36,δ162.10,δ158.33,δ154.44,δ138.92,δ127.94,δ123.69,δ115.13,δ114.03,δ103.83,δ99.01,δ71.41,δ70.70,δ68.37,δ66.84,δ61.43,δ20.73,δ20.69,δ20.66,δ20.58,δ17.05；HRMS(ESI)calcd for C24H26O12 +:507.1497；Found:507.1002[M+H]+。
4)荧光探针d的合成：称取100mg的化合物c(0.2mmol)溶于15mL的甲醇中，加入54mg的甲醇钠(1mmol)，室温搅拌3h，TLC监测反应完全，反应结束后，用稀盐酸调节pH至6左右，用二氯甲烷萃取，无水MgSO4干燥，柱层析(甲醇：二氯甲烷1:5，v/v)，真空干燥后得到浅灰白色固体39mg，即为荧光探针d，产率约为58％。
本实施例所得荧光探针d的1H NMR谱图如图1所示。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO):δ7.84(s,1H),δ7.55(d,1H),δ7.04(s,1H),δ6.99(d,1H),δ5.27(m,1H),δ4.95(m,2H),δ4.72(m,1H),δ4.57(m,1H),δ3.67(m,6H),δ2.07(s,3H)。
本实施例所得荧光探针d的1C NMR谱图如图2所示。13C NMR(100MHz,(CD3)2SO):δ161.97,δ154.47,δ140.15,δ128.84,δ122.15,δ114.23,δ114.05,δ103.35,δ101.21,δ76.16,δ73.70,δ70.59,δ68.61,δ60.88,δ16.98。
本实施例所得荧光探针d的HRMS谱图如图3所示。HRMS(ESI)calcd for C16H18O8,[M+H]+339.1074；Found:339.1051。
由图1-3谱图可以推测荧光探针d结构式为：
Figure BDA0002536594370000061
由图4-6谱图可以推测荧光探针d的荧光基团化合物b结构式为：
Figure BDA0002536594370000062
实施例2
测定实施例1所得荧光探针与β-半乳糖苷酶反应的效果：
向比色皿中加入3mL实施例1制备的荧光探针分子(10μM，溶于在37℃条件下pH值为7.4的PBS缓冲溶液中)作为对照组，测试其紫外吸收光谱和荧光光谱，然后向另一个比色皿中加入3mL实施例1制备的荧光探针分子(10μM，溶于pH值为7.4的PBS缓冲溶液中)和β-半乳糖苷酶(0.10U/mL)的混合液作为实验组测试其紫外吸收光谱和荧光发射光谱。如图7所示为荧光探针检测β-半乳糖苷酶的高效液相色谱和质谱，由图可知β-半乳糖苷酶断裂D-半乳糖苷键，释放荧光基团，说明该探针的反应机理与所设计的一致。如图8为荧光探针检测β-半乳糖苷酶响应的紫外吸收光谱，在紫外吸收光谱中，在没有加入β-半乳糖苷酶时，探针分子(10μM)在317nm处有一个强烈的吸收峰。当加入β-半乳糖苷酶(0.10U/mL)后，随着反应的进行，在375nm处出现了一个新的吸收峰。如图9为荧光探针检测β-半乳糖苷酶响应的荧光光谱，在荧光发射光谱中，在没有加入β-半乳糖苷酶时，可以观察到探针分子(10μM)在波长390nm处有一个相对弱的发射强度。当加入β-半乳糖苷酶(0.10U/mL)后，随着反应的进行，探针分子发生一个红移现象，最大荧光发射波长从390nm转化为465nm，同时荧光信号得到显著增强。如图10所示为荧光探针检测β-半乳糖苷酶时的荧光比值I465/I390与响应时间的关系图，当反应时间达到15min时，荧光强度不再增加，反应结束。
实施例3
测定实施例1所得荧光探针与不同浓度的β-半乳糖苷酶反应强度随浓度的变化：
向七个比色皿中分别加入3mL含实施例1所得荧光探针分子(10μM，溶于在37℃条件下pH值为7.4的PBS缓冲溶液)和不同浓度的β-半乳糖苷酶(0，0.01，0.03，0.05，0.07，0.1，0.15U/mL)的混合液，反应15分钟后，测试各个混合液的荧光光谱。随着β-半乳糖苷酶的浓度加大(0-0.10U/mL)，荧光强度逐渐增加，同时发生一个红移现象。而当加入更大量的β-半乳糖苷酶(0.15U/mL)时，荧光强度不再增加，这说明了0.10U/mL的β-半乳糖苷酶能够催化水解10μM的荧光探针，不同浓度的β-半乳糖苷酶对荧光探针的滴定测试图如图11所示。
实施例4
测定实施例1所得荧光探针与对β-半乳糖苷酶的检测限实验：
如图12所示为不同浓度的β-半乳糖苷酶对荧光探针在465nm处的滴定实验图，向比色皿中分别加入3mL含实施例1所得荧光探针分子(10μM，溶于在37℃条件下pH值7.4的PBS缓冲溶液中)和不同浓度的β-半乳糖苷酶(0，0.01，0.03，0.05，0.07U/mL)的混合液，反应15分钟后，测试各个混合液在465nm处的荧光强度。荧光探针与不同浓度的β-半乳糖苷酶反应在465nm的荧光强度与β-半乳糖苷酶浓度存在一个很好地线性关系，通过这个线性曲线计算出该探针的检测限为0.168mU/mL，该数据表明该荧光探针对β-半乳糖苷酶具有很高的灵敏度。
实施例5
测定实施例1所得荧光探针与β-半乳糖苷酶的酶动力学参数：
向比色皿中分别加入3mL含β-半乳糖苷酶(0.1U/mL，溶于在37℃条件下pH值7.4的PBS缓冲溶液中)和不同浓度的实施例1所得荧光探针分子(1,2,3,5,7,10,15μM)的混合液，反应15分钟后，测试各个混合液的荧光光谱。不同浓度的荧光探针对β-半乳糖苷酶的滴定测试图如图13所示。随着荧光探针浓度加大(0-10μM)，在465nm处的荧光强度也在逐渐增加，当加入更大浓度的荧光探针时(15μM)，荧光强度不再增加，以此计算得到米氏常数Km为14.23μM，最大反应速率Vmax为6.29μM/min，说明该荧光探针与β-半乳糖苷酶具有较好的亲和力。
实施例6
测定实施例1所得荧光探针识别β-半乳糖苷酶的特异性：
向比色皿中分别加入3mL含实施例1所得荧光探针分子(10μM，溶于在37℃下pH值为7.4的PBS缓冲溶液)和不同的待测分析物的混合液(a.缓冲液对比样；b.100μM CaCl2；c.100μM MgCl2；d.100μM ZnCl2；e.100μM半胱氨酸；f.100μM谷胱甘肽；g.100μM葡萄糖；h.1mg/mL胎牛血清；i.1mg/mL人体血浆；j.0.1U/mL抑肽酶；k.0.1U/mL胰蛋白酶；l.0.1U/mL纤维素酶；m.0.1U/mLα-淀粉酶；n.0.1U/mL硫酸酯酶；o.0.1U/mLγ-谷氨酰转肽酶；p.0.1U/mL脂肪酶；q.0.1U/mL亮氨酸氨基转肽酶；r.0.1U/mLβ-半乳糖苷酶)，测试各个混合液在反应0min，10min，20min，30min后在465nm处的荧光强度。如图14所示为荧光探针对β-半乳糖苷酶及其他分析物的选择性实验图，可见在金属离子，生物分子以及各类生物酶存在下，荧光探针的荧光信号基本没有变化，而在加入β-半乳糖苷酶后，其荧光显著增强，说明荧光探针对β-半乳糖苷酶具有很好的特异选择性。
实施例7
测定实施例1所得荧光探针对β-半乳糖苷酶抑制剂的抑制活性测试：
向比色皿中分别加入3mL含实施例1所得荧光探针分子(10μM，溶于37℃下pH值7.4的PBS缓冲溶液中)、β-半乳糖苷酶(0.1U/mL)和不同浓度的D-半乳糖(0,50,100,150,200,250,300,350μM)的混合液，反应15分钟后，测试各个混合液在465nm处的荧光强度。如图15所示为以荧光探针为底物测试不同浓度D-半乳糖对β-半乳糖苷酶的IC50抑制活性图，随着抑制剂D-半乳糖浓度的增加，反应体系的荧光强度是逐渐减弱的，再次说明荧光探针与β-半乳糖苷酶发生了催化反应，其反应位点为β-半乳糖苷酶的催化活性腔。通过拟合得到抑制剂D-半乳糖的IC50值为162.20μM，并且拟合的线性关系良好，说明该探针可用于β-半乳糖苷酶抑制剂的抑制活性测试。
实施例8
将实施例1制备的荧光探针与现有报道的β-半乳糖苷酶探针在检测方法，探针价格和应用方面进行对比，对比结果如下表1所示。
表1
Figure BDA0002536594370000091
由表1可见，本发明的荧光探针具有以下优点：(1)与紫外法相比，本发明的荧光探针法基于荧光显色基团，灵敏度高；(2)与现有荧光方法相比，本发明的荧光探针法其价格便宜，并且可用于β-半乳糖苷酶的抑制剂筛选，具有实际应用前景。

Claims (9)

1.一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其特征在于，其化学结构式如(I)所示：
Figure FDA0002536594360000011
2.一种权利要求1所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，其合成路线如下：
Figure FDA0002536594360000012
具体步骤如下：
1)将2,4-二羟基苯甲醛、丙酸钠混合，再加入丙酸酐、三乙胺，加热回流1～3小时，发生关环反应，反应完全后冷却，析出大量白色固体，纯化处理得到化合物a；
2)将化合物a溶于甲醇中，加入K2CO3后，室温搅拌0.5～5小时，发生酯水解反应，反应完全后，用盐酸调节体系pH值至3-4，析出大量固体，将固体洗涤、真空干燥得到白色固体b；
3)将化合物b、Na2SO4和Cs2CO3溶于乙腈溶液中，搅拌5～10min，然后加入2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物，在氮气氛围下室温反应2～12小时，发生成醚反应，待反应完全后，萃取、洗涤、柱层析得到白色固体c；
4)将化合物c溶于甲醇中，加入甲醇钠后，室温搅拌1～3小时，发生脱乙酰基反应，反应完全后用稀盐酸调节pH值至6，提纯得到目标探针化合物d。
3.根据权利要求2所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)所述2,4-二羟基苯甲醛、丙酸钠、丙酸酐与三乙胺的摩尔比为1：1～3：1～5：1～3。
4.根据权利要求2所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)所述加热回流温度为150～180℃。
5.根据权利要求2所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)所述化合物a与K2CO3的摩尔比为1：1～5。
6.根据权利要求2所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)所述化合物b、Na2SO4、Cs2CO3与2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物的摩尔比为1：1～5：1～6：1～5。
7.根据权利要求2所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤4)所述化合物c与甲醇钠的摩尔比为1：1～5。
8.一种权利要求1所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在定性定量检测β-半乳糖苷酶的活性和含量方面的应用。
9.一种权利要求1所述的检测β-半乳糖苷酶的荧光探针用于β-半乳糖苷酶的抑制剂活性筛选方面的应用。
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