CN115925767A - 检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针及其制备方法、使用方法和应用 - Google Patents
检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针及其制备方法、使用方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种检测β‑半乳糖苷酶的红光发射探针及其制备方法、使用方法和应用，涉及分析化学技术领域。检测β‑半乳糖苷酶的红光发射探针，其结构式如下所示：
本申请还提供一种检测β‑半乳糖苷酶的红光发射探针的制备方法和使用方法。检测β‑半乳糖苷酶的红光发射探针的应用，用于定量分析β‑半乳糖苷酶。检测β‑半乳糖苷酶的红光发射探针的应用，用于辅助早期诊断结肠肿瘤或者用于制备能够辅助早期诊断结肠肿瘤的试剂。本申请提供的检测β‑半乳糖苷酶的红光发射探针，结合喹喔啉基团和刚性五元环，构建新型香豆素衍生物，通过连接β‑半乳糖苷酶识别位点，能够快速实现β‑半乳糖苷酶的检测。
Description
技术领域
本申请涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针及其制备方法、使用方法和应用。
背景技术
作为一种溶酶体外糖苷酶，β-半乳糖苷酶(β-Gal)在人体内起着至关重要的作用，可以清除各种底物中的半乳糖残基，如神经节苷脂、鞘脂、糖蛋白和硫酸角蛋白(RSC.Adv.2016,6,97216-97225；Nat.Commun.2017,8,987)。此外，β-半乳糖苷酶可以抑制细胞增殖，降低菌落形成，诱导细胞周期停滞，并促进培养的结肠癌细胞凋亡，并阻止结肠癌异种移植的生长(Gastroenterolog.2021,160,1179-1193.e1114)。因此，监测活细胞或组织内的β-半乳糖苷酶活性从而监测肿瘤的发生引起了人们极大的兴趣。
已经探索了一些检测β-半乳糖苷酶的方法，如磁共振、正电子发射断层扫描和单光子发射计算机断层扫描等(Chem.Coummun.2017,53,4505-4508；J.Am.Chem.Soc.2018,140(28),8671–8674)。然而，这些方法由于成本高、操作费力、灵敏度适中以及对活细胞中β-半乳糖苷酶的监测无效而受到阻碍(J.Microbiol.Biotechnol.2011,21,236-242)。由于荧光探针的优点，如先进的灵敏度、方便的操作程序、便宜的仪器和强大的生物成像能力，荧光探针在监测活细胞中的β-半乳糖苷酶活性方面受到了广泛关注(Proc NatlAcad SciU SA.1995,92,160-164)。
目前开发出一种大斯托克斯位移、高荧光量子产率的红光发射荧光探针用于细胞中β-半乳糖苷酶的检测和辅助早期诊断结肠肿瘤的成像仍然具有一定的挑战。
发明内容
本申请的目的在于提供一种检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针及其制备方法、使用方法和应用，以解决上述问题。
为实现以上目的，本申请采用以下技术方案：
一种检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针，其结构式如下所示：
本申请还提供一种所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的制备方法，包括：
将5-乙基-8-羟基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛加入丙酮中，再加入2-(乙酰氧基甲基)-6-溴四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸三酯和氢氧化钠，搅拌进行第一步反应后将体系蒸发旋干，进行第一分离纯化得到2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-乙基-7-甲酰基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酰基三乙酸盐；
将2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-乙基-7-甲酰基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酰基三乙酸盐加入甲醇中，再加入甲醇钠，进行第二步反应后过滤，将固体进行第二分离纯化得5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛；
将5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛加入无水乙醇中，再加入2-(苯并[d]噻唑-2-基)乙腈，搅拌进行第三步反应，反应完毕后过滤，将固体进行第三分离纯化得(E)-2-(苯并[d]噻唑-2-基)-3-(5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基基)氧)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-基)丙烯腈。
优选地，所述5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛和所述2-(苯并[d]噻唑-2-基)乙腈的摩尔比为1:1。
优选地，所述第一反应、所述第二反应和所述第三反应均在常温下进行。
优选地，所述第一分离纯化、所述第二分离纯化和所述第三分离纯化各自独立的使用柱层析进行。
本申请还提供一种所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的使用方法，包括：
将所述检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针用二甲基亚砜溶解，然后与水相液体混合得到混合溶液；
将所述混合溶液与β-半乳糖苷酶反应。
优选地，所述混合溶液中二甲基亚砜和所述水相液体的体积比为5：5；
优选地，当检测硫化氢时，所述水相液体为pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。
优选地，所述反应结束后，所述检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针在476nm激发波长下发射640nm的红色荧光。
本申请还提供一种所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的应用，用于定量分析β-半乳糖苷酶。
本申请还提供一种所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的应用，用于辅助早期诊断结肠肿瘤或者用于制备用来辅助早期诊断结肠肿瘤的试剂或器件。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针，结合喹喔啉基团和刚性五元环，构建新型香豆素衍生物，通过连接β-半乳糖苷酶识别位点，能从各种生物活性物质中快速选择性检测β-半乳糖苷酶，从而辅助早期诊断结肠肿瘤。通过检测β-半乳糖苷酶含量能够辅助早期诊断结肠肿瘤。该探针检测β-半乳糖苷酶时具有较大的斯托克斯位移，高荧光量子产率，红光发射，高的灵敏度和选择性，以及显著的荧光开启效应，在分析化学、生命科学、生物医疗等技术领域有着巨大的应用前景。
本申请提供的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的制备方法，工艺简单。
本申请提供的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的使用方法，操作简单。
本申请提供的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针，可以用于定量检测β-半乳糖苷酶；同时还可以用于辅助早期诊断结肠肿瘤，或者用于制备用来辅助早期诊断结肠肿瘤的试剂或器件。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为实施例得到的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
本实施例提供一种检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针，其合成路线如下所示：
具体制备方法如下：
1.合成2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-乙基-7-甲酰基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酰基三乙酸盐
将0.2g(811.98μmol)5-乙基-8-羟基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛加入8mL丙酮中，再加入0.4g(974.38μmol)的2-(乙酰氧基甲基)-6-溴四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸三酯和65mg(1.62mmol)氢氧化钠，在常温搅拌过夜，将其蒸发旋干，柱层析分离纯化得到2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-乙基-7-甲酰基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酰基三乙酸盐120mg，产率25.63％。
2.合成5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛
将0.2g(346.86μmol)2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-乙基-7-甲酰基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酰基三乙酸盐加入6mL甲醇中，再加入1.87mg(346.86μmol)甲醇钠，常温过夜，过滤，将固体柱层析纯化得5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛72mg，产率50.82％。
3.合成(E)-2-(苯并[d]噻唑-2-基)-3-(5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基基)氧)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-基)丙烯腈
将50mg(122.41μmol)5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛加入4mL无水乙醇中，再加入25.59mg(146.90μmol)2-(苯并[d]噻唑-2-基)乙腈，常温搅拌反应过夜，反应完毕后，过滤，将固体柱层析纯化得所述的红光发射探针42mg，产率为60.76％。
使用上述红光发射探针在体外环境中检测β-半乳糖苷酶：
红光发射探针光谱性质实验：将探针溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配置成浓度为1mM的探针溶液，分别配置浓度为10mM的β-半乳糖苷酶。具体测试方式为：取20μL 1mM的探针溶液，再加入20μL 10mM的分析物溶液，最后加入的980μL的分析纯DMSO和980μL PBS，所有测试均保持有机相和水相的体积比为5:5(每一个测试样品总体积为2mL)。例如当要求测试探针与100μMβ-半乳糖苷酶反应后的荧光强度，配制样品情况为：取20μL的1mM的探针溶液，20μL的10mM的β-半乳糖苷酶水溶液，再加入980μL的分析纯DMSO和980μL的PBS缓冲溶液于2mL的样品管中，室温下震荡摇匀30分钟后即可用476nm的激发波长测量其荧光发射强度，其他测试操作与上述步骤类似。
该探针检测β-半乳糖苷酶荧光明亮，具有高的灵敏度，非常适合活细胞内源性β-半乳糖苷酶的成像/定量分析，能够用于结肠癌的成像研究。
本申请提供的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针，结合喹喔啉基团和刚性五元环，构建新型香豆素衍生物，当与β-半乳糖苷酶反应后在476nm激发波长下发射640nm的红光，荧光现象明显。可将其用于辅助早期诊断结肠肿瘤的成像，在生物化学、生命医疗等领域都具有较大的实际应用价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针，其特征在于，其结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的制备方法，其特征在于，包括：
将5-乙基-8-羟基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛加入丙酮中，再加入2-(乙酰氧基甲基)-6-溴四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸三酯和氢氧化钠，搅拌进行第一步反应后将体系蒸发旋干，进行第一分离纯化得到2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-乙基-7-甲酰基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酰基三乙酸盐；
将2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-乙基-7-甲酰基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三酰基三乙酸盐加入甲醇中，再加入甲醇钠，进行第二步反应后过滤，将固体进行第二分离纯化得5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛；
将5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛加入无水乙醇中，再加入2-(苯并[d]噻唑-2-基)乙腈，搅拌进行第三步反应，反应完毕后过滤，将固体进行第三分离纯化得(E)-2-(苯并[d]噻唑-2-基)-3-(5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基基)氧)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-基)丙烯腈。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述5-乙基-8-((3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-7-甲醛和所述2-(苯并[d]噻唑-2-基)乙腈的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一步反应、所述第二步反应和所述第三步反应均在常温下进行。
5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一分离纯化、所述第二分离纯化和所述第三分离纯化各自独立的使用柱层析进行。
6.一种权利要求1所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的使用方法，其特征在于，包括：
将所述检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针用二甲基亚砜溶解，然后与水相液体混合得到混合溶液；
将所述混合溶液与β-半乳糖苷酶反应。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述混合溶液中二甲基亚砜和所述水相液体的体积比为5：5；
优选地，所述水相液体为pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求6或7所述的使用方法，其特征在于，所述反应结束后，所述检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针在476nm激发波长下发射640nm的红色荧光。
9.一种权利要求1所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的应用，其特征在于，用于定量分析β-半乳糖苷酶。
10.一种权利要求1所述的检测β-半乳糖苷酶的红光发射探针的应用，其特征在于，用于辅助早期诊断结肠肿瘤或者用于制备用来辅助早期诊断结肠肿瘤的试剂或器件。
Priority Applications (1)
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2022
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