CN110407849B - 一种萘基荧光分子及其制备方法和酪氨酸酶的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种萘基荧光分子及其制备方法和酪氨酸酶的检测方法。本发明利用间萘二酚和羟基酪醇在水溶液中直接反应，首次合成了具有青色荧光发射的萘基荧光分子，其结构式为式Ⅰ。所述的酪氨酸酶检测以酪醇为底物，在水溶液中，该底物分子经酪氨酸酶的催化氧化生成羟基酪醇，羟基酪醇可以与后续加入的间萘二酚发生反应，生成青色荧光的荧光分子(式Ⅰ)。据此根据间萘二酚和羟基酪醇的原位荧光生成反应，以及酪醇能够被酪氨酸酶催化氧化生成羟基酪醇的现象，建立了酪氨酸酶的荧光检测方法。本发明所需试剂简单易得，操作简便，快速准确，受干扰小，易于推广和应用。
Figure DDA0002152371450000011

Description

一种萘基荧光分子及其制备方法和酪氨酸酶的检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种萘基荧光分子及其制备方法和酪氨酸酶的检测方法。
背景技术
酪氨酸酶(Tyrosinase)是一种含铜氧化酶，广泛存在于微生物、动植物以及人体中，在这些生物体内具有非常重要的功能。在植物中，酪氨酸酶对左旋多巴、酚类、木质素等物质的合成起着重要的作用，并且酪氨酸酶与水果和蔬菜的褐变有很大的关系，因此对酪氨酸酶的活性检测和调节等进行研究，在食品保鲜、环境监测等领域有重要的意义。另一方面，哺乳动物中的酪氨酸酶主要涉及两个反应过程：一是催化酪氨酸生成多巴；二是催化多巴形成多巴醌，多巴醌经过一系列反应后能形成黑色素。由于黑色素可以被分泌到表皮与毛发的角质细胞中，因此酪氨酸酶的异常表达会导致严重的皮肤病，如白癫疯，白化病和黑色素瘤等。另外，酪氨酸酶的活性水平也被认为是帕金森病的生物标志物。因此发展快速灵敏高效的酪氨酸酶活性测定方法具有重要意义。
目前，用于检测酪氨酸酶的方法有很多，包括高效液相色谱法、免疫检测法、比色法、分光光度法、电化学检测法、放射性同位素检测法、荧光检测法等。其中，荧光法由于其具有选择性好、灵敏度高以及即时原位、响应快、设备简单等特点，一直是人们的研究重点。目前的酪氨酸酶荧光检测方法，大多集中在以下两种：一种是通过繁琐的有机合成，制备出较为复杂的底物分子，通过酪氨酸酶与底物分子的相互作用来改变底物分子的荧光，从而进行检测；另一种是利用酪氨酸酶的氧化产物多巴醌对荧光材料的淬灭作用进行检测。这两种方法明显存在操作繁琐、试剂消耗量大、检测灵敏度低以及易受活性氧物质干扰等弊端。
相比之下，基于商业化的简单小分子，以及新颖简便的荧光分子生成过程，结合酶促反应特点，构建的荧光“点亮”型分析检测技术，通常操作更加简便，背景干扰更低，检测灵敏度更高，因此基于这一原理发展的酪氨酸酶检测技术将具有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种萘基荧光分子及其制备方法和酪氨酸酶的检测方法。该萘基荧光分子的荧光性能稳定优异，其制备方法简单、反应条件温和、成本较低，并且利用该制备方法及过程用于酪氨酸酶活性的荧光检测，该检测方法所用试剂简单易得、操作方便、快速准确、灵敏度高。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种萘基荧光分子，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002152371430000021
本发明还提供一种萘基荧光分子的制备方法，包括以下步骤：
将羟基酪醇和间萘二酚溶解到超纯水中，室温(25℃)混合均匀，再加入氢氧化钠调节溶液pH值，室温孵育，反应得到式Ⅰ所示的萘基荧光分子；
反应式如下：
Figure BDA0002152371430000031
在上述技术方案中，优选所述羟基酪醇和间萘二酚的投料摩尔比为1：1。
在上述技术方案中，优选调节溶液pH值为7.5～10.5。
在上述技术方案中，优选孵育反应在空气气氛中进行，时间为10～90分钟。
本发明还提供一种酪氨酸酶的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：将酪醇水溶液分别与不同已知活性的酪氨酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到一系列混合溶液；
步骤二：在步骤一制备的一系列混合溶液中分别加入间萘二酚水溶液，进一步混合孵育，加固定量的碱性溶液并进行荧光光谱测试；
步骤三：根据酪氨酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；
步骤四：将酪醇水溶液与待测酪氨酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到待测酪氨酸酶混合溶液；
步骤五：在步骤四制备的待测酪氨酸酶混合溶液中加入间萘二酚水溶液，进一步混合孵育，加固定量的碱性溶液并进行荧光光谱测试，得到待测酪氨酸酶溶液的荧光光谱强度；
步骤六：利用步骤三绘制的标准曲线和步骤五测得的待测酪氨酸酶溶液的荧光光谱强度，计算得到待测酪氨酸酶的活性。
在上述技术方案中，优选步骤一和四中的缓冲溶液是pH＝6.0～8.5的10～100mM醋酸钠缓冲溶液。
在上述技术方案中，优选步骤一和四中的孵育温度为20～37℃，时间为10～60分钟。
在上述技术方案中，优选步骤二和五中的孵育温度为20～37℃，时间为5～40分钟。
在上述技术方案中，优选步骤二和五中的碱性溶液为10～100mM的氢氧化钠或者100～500mM的碳酸钠溶液。
本发明的有益效果是：
本发明首次合成了一种具有青色荧光发射的萘基荧光分子，且荧光性能稳定优异。
本发明的萘基荧光分子的制备方法，合成纯化步骤非常简单，反应条件温和，成本较低，合成产率高，得到的荧光分子及其合成过程都利于开发分析检测应用。
本发明的酪氨酸酶的检测方法，以酪醇为底物，在水溶液中，该底物分子经酪氨酸酶的催化氧化生成羟基酪醇，羟基酪醇可以与后续加入的间萘二酚发生反应，生成青色荧光的萘基荧光分子(式Ⅰ)。据此根据间萘二酚和羟基酪醇的原位荧光生成反应，以及酪醇能够被酪氨酸酶催化氧化生成羟基酪醇的现象，建立了酪氨酸酶的荧光检测方法。该检测方法的检出限为0.01U/mL，具有高灵敏度，高选择性，宽线性范围等优点，并且所用试剂简单易得，操作方便，快速准确，有潜力应用于临床样品中酪氨酸酶活性的准确快速检测。
本发明对操作人员没有特殊技术要求，所需仪器非常普及，所需试剂为商业化产品，所需操作简单、容易掌握和重复。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为羟基酪醇、间萘二酚和式I所示萘基荧光分子的吸收光谱(实线)、日光灯(左a、b、c)及365nm紫外灯(右a、b、c)下照片(插图)；式I所示萘基荧光分子的荧光激发和发射光谱(虚线)。
图2为本发明利用荧光光谱检测酪氨酸酶可行性分析图。
图3为本发明中溶液荧光光谱随酪氨酸酶活性的变化曲线(A)及标准工作曲线(B)；控制酪氨酸酶活性为0～5U/mL，A中的插图为酪氨酸酶活性为0～5U/mL的酪氨酸酶标准溶液在365nm紫外灯下的照片。
图4为本发明用于检测酪氨酸酶活性的特异性。
具体实施方式
下面将结合实施例与附图对本发明作进一步阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。所述方法均为常规方法，所述原料均能从公开商业途径获得。
实施例1
一种萘基荧光分子(式I)的合成与表征
将40mM羟基酪醇和40mM间萘二酚的水溶液按照1：1的体积比在室温(25℃)下混合均匀，加入2M氢氧化钠水溶液调节溶液pH值至9.0，室温下孵育30分钟，得到红褐色粗产品溶液。用1M盐酸溶液调节pH值至沉淀不再析出，转速10000r/min离心10分钟去除上清液，得到粗产品。用柱层析分离提纯得到最终产物(式I)，为黄色粉末。
结构确证结果如下：13C NMR(151MHz,DMSO)δ191.81(s),167.75(s),164.90(s),163.68(s),130.41(s),129.97(s),124.23(s),123.71(s),123.12(d,J＝12.7Hz),109.70(s),103.99(s),94.59(s),93.56(s),89.08(s),57.92(s),45.06(s),39.99(s),39.88(d,J＝20.9Hz),39.61(d,J＝21.0Hz),39.40(s),39.40(s),39.48–39.08(m),39.08–38.94(m),32.56(s)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.26–8.14(m,1H),8.07(d,J＝8.3Hz,1H),7.73–7.60(m,1H),7.51–7.37(m,1H),6.60(s,2H),3.95–3.77(m,2H),2.43(d,J＝11.0Hz,1H),2.32(dd,J＝10.9,2.3Hz,1H),2.18(td,J＝12.3,7.3Hz,1H),1.59(d,J＝12.4Hz,1H).HR-ESI-MS,calcd for C18H14O5:m/z 310.08412；found:[M+H]+m/z 311.09909。
由上述谱图数据，可确认本实施例得到的化合物结构如式I所示：
Figure BDA0002152371430000061
上述实施例中调节溶液的pH值、及孵育时间可以在前述限定范围内的任意值，均可制备得到式I所示的奈基荧光分子，这里不再一一举例。
实施例2
基于上述式I所示的萘基荧光分子的合成过程检测酪氨酸酶的原理和可行性验证
如图1所示，单独的羟基酪醇(a)和间萘二酚水溶液(b)都是没有颜色和荧光的。而当它们混合时，很容易生成结构式为式Ⅰ的萘基荧光分子，低浓度时溶液呈现黄绿色(左c)，并有青色强荧光发射(右c)。本发明的酪氨酸酶活性检测方法示意图和可行性分析如图2所示：羟基酪醇和间萘二酚的混合溶液，37℃孵育40分钟，用荧光分光光度计测量体系的荧光，以458nm激发，在480nm处有明显的荧光发射(c)；在同样条件下，酪醇和间萘二酚的混合溶液没有荧光(a)；而当酪醇和酪氨酸酶共同孵育后，再加入间萘二酚孵育才有明显的荧光(b)，其荧光发射峰位置与c几乎相同。因此，可以将酪醇作为底物，利用酪氨酸酶将酪醇氧化成羟基酪醇，羟基酪醇能与间萘二酚特异性反应生成式Ⅰ所示萘基荧光分子的事实，来进行酪氨酸酶活性的荧光检测。
实施例3
酪氨酸酶活性的荧光检测方法
首先将200μL，1.0mM的酪醇水溶液和200μL的醋酸钠(50mM，pH 7.0)缓冲溶液加入到200μL的超纯水中，之后将配制好的酪醇混合溶液分别与200μL的不同活性酪氨酸酶标准溶液(0～5U/mL，0U/mL，0.01U/mL，0.02U/mL，0.05U/mL，0.1U/mL，0.2U/mL，0.35U/mL，0.5U/mL，0.75U/mL，1U/mL，1.5U/mL，2U/mL，2.5U/mL，3U/mL，4U/mL，5U/mL)、及待测酪氨酸酶溶液，在37℃酶解孵育40分钟，之后分别加入200μL的间萘二酚(1.0mM)水溶液，得到的混合溶液在室温(～25℃)继续孵育20分钟后加入100μL的碳酸钠溶液(500mM)，最后用荧光分光光度计测量溶液的荧光。如图3所示，所得标准溶液的荧光发射光谱强度随酪氨酸酶活性的增强而上升，利用480nm处的荧光强度随酪氨酸酶活性的变化绘制标准曲线。在酪氨酸酶活性范围0.01-1U/mL之间，拟合的线性方程为I480＝2.1+4787C酪氨酸酶(U/mL)，R2＝0.984。其中插图为酪氨酸酶活性为0～5U/mL的酪氨酸酶标准溶液在365nm紫外灯下的照片，可以看出随着酪氨酸酶活性的增强发射的青色荧光程度逐渐增强。利用线性关系，根据待检测溶液的荧光强度值可以计算得到待测溶液酪氨酸酶的活性值。该检测方法能特异性检出0.01U/mL的酪氨酸酶。
本实施例中缓冲液、各步的孵育温度及时间、及所用的碱性溶液可以为前述限定范围内的任意组合，都能实现酪氨酸酶活性的检测，这里不再一一举例。
实施例4
酪氨酸酶活性荧光检测方法的抗干扰性
为了检测本发明中酪氨酸酶检测方法的抗干扰能力，选择的潜在干扰物质包括酪氨酸tyrosine、氧化性物质、金属离子和还原性物质。抗干扰能力的测试与实施例3中的酪氨酸酶活性检测方法基本相同，不同之处在于用上述潜在干扰的氧化性物质、金属离子或还原性物质代替实施例3中的待测酪氨酸酶溶液，其中，潜在干扰物的终浓度是100μM，结果如图4所示，除了二价铜离子Cu2+能够引起体系产生微弱荧光以外，其它测试的潜在干扰物都不影响体系的荧光，本发明方法对酪氨酸酶活性的检测抗干扰能力很好。
还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种萘基荧光分子，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0002419164860000011
2.根据权利要求1所述的萘基荧光分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将羟基酪醇和间萘二酚溶解到超纯水中，室温混合均匀，再加入氢氧化钠调节溶液pH值，室温孵育，反应得到式Ⅰ所示的萘基荧光分子；
反应式如下：
Figure FDA0002419164860000012
3.根据权利要求2所述的萘基荧光分子的制备方法，其特征在于，所述羟基酪醇和间萘二酚的投料摩尔比为1：1。
4.根据权利要求2或3所述的萘基荧光分子的制备方法，其特征在于，调节溶液pH值为7.5～10.5。
5.根据权利要求2或3所述的萘基荧光分子的制备方法，其特征在于，孵育反应在空气气氛中进行，时间为10～90分钟。
6.一种酪氨酸酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将酪醇水溶液分别与不同已知活性的酪氨酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到一系列混合溶液；
步骤二：在步骤一制备的一系列混合溶液中分别加入间萘二酚水溶液，进一步混合孵育，加固定量的碱性溶液并进行荧光光谱测试；
步骤三：根据酪氨酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；
步骤四：将酪醇水溶液与待测酪氨酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到待测酪氨酸酶混合溶液；
步骤五：在步骤四制备的待测酪氨酸酶混合溶液中加入间萘二酚水溶液，进一步混合孵育，加固定量的碱性溶液并进行荧光光谱测试，得到待测酪氨酸酶溶液的荧光光谱强度；
步骤六：利用步骤三绘制的标准曲线和步骤五测得的待测酪氨酸酶溶液的荧光光谱强度，计算得到待测酪氨酸酶的活性。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤一和四中的缓冲溶液是pH＝6.0～8.5的10～100mM醋酸钠缓冲溶液。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤一和四中的孵育温度为20～37℃，时间为10～60分钟。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤二和五中的孵育温度为20～37℃，时间为5～40分钟。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤二和五中的碱性溶液为10～100mM的氢氧化钠或者100～500mM的碳酸钠溶液。
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