CN110632050B - 利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法，是将具有荧光性能的共价有机纳米球与酪氨酸在缓冲溶液中涡旋混匀，加入一系列不同浓度的酪氨酸酶溶液，在室温~40℃下孵育0.5~1.5 h；在激发波长为432 nm，发射波长为580 nm下进行荧光测量；根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭共价有机纳米球的荧光程度不同，构建体系在580 nm处的荧光强度与酪氨酸酶溶液之间的线性关系，即可定量检测酪氨酸酶浓度。本发明建立的荧光分析法能快速、高灵敏、高选择性地实现酪氨酸酶检测；本发明整个实验过程操作非常简单，无需任何修饰和标记，成本低，应用性强。

Description

利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法
技术领域
本发明涉及一种酪氨酸酶活性的荧光检测方法，尤其涉及一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶活性的方法，属于荧光生物传感技术领域。
背景技术
酪氨酸酶是一种含铜酶，作为一种重要的氧化还原酶，其广泛存在于微生物、动植物及人体中，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶。医学研究表明，酪氨酸酶的缺失或者过表达，均会影响黑色素的产生，从而导致患皮肤癌、白癜风、白化病、黑色素瘤等疾病的风险增加。目前，酪氨酸酶已经被作为黑色素瘤的标志物之一。因此，开发有效的TYR活性检测方法对于更好地理解酪氨酸酶的生理功能，提升酪氨酸酶相关疾病的早期诊断能力具有至关重要的意义。
目前酪氨酸酶的检测方法主要有电化学法、比色法、荧光法、离子敏感场效应晶体管器件、放射法等，其中荧光光谱法以其成本低廉、操作简单、响应速度快、灵敏度高等优势，成为目前最理想、最有前景的检测手段。尽管已有一些基于碳点、有机小分子、半导体量子点和贵金属纳米簇测定酪氨酸酶活性的荧光分析法被报道。然而，它们各自也存在一些不可避免的缺陷，比如合成周期较长、光稳定性差、分离纯化过程复杂、材料重现性差等。因此，仍需要制备具有理想分析性能的新型荧光纳米材料来构建荧光传感器用于酪氨酸酶的检测。
发光共价有机聚合物材料主要由轻元素（C、O、N、B等）通过共价键结合而成，目前已经引起了科研工作者的广泛关注。据文献调研，目前对发光共价有机聚合物的研究主要集中在合成策略的探索、简单金属离子和有机小分子的检测等方面，还没有关于酪氨酸酶分析的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶活性的方法。
一、具有荧光性能的共价有机纳米球的制备
将三（4-氨基苯基）胺（TAPA）和三（4-氨基苯基）醛（TFPA）以等摩尔比超声分散N,N-二甲基甲酰胺中形成均相溶液；再加入甲醇做反应溶剂，乙酸做催化剂，在室温~70℃下反应0.5~5.0 h；反应结束后经离心、洗涤、干燥，即得共价有机纳米球。其中催化剂乙酸的用量为原料有机醛和有机胺总摩尔量的3.0~6.0倍。
图1为本发明得到的具有荧光性能的共价有机纳米球的XPS图。从图1中可以看出，该材料主要由C、N、O三种元素组成。
图2为具有荧光性能的共价有机纳米球的拉曼光谱图。从拉曼光谱图中可以看出，该材料在1590 cm-1（G 带）和1340 cm-1（D带）处的拉曼峰分别对应于石墨晶格的振动和材料的无序结构。
图3为具有荧光性能的共价有机纳米球的荧光发射光谱图。从图3可以看出，共价有机纳米球的最佳激发波长为432 nm，最佳发射波长为580 nm，具有很好的发光性能。
二、酪氨酸酶活性检测
将上述制备的具有荧光性能的共价有机纳米球与酪氨酸在缓冲溶液中涡旋混匀，加入一系列不同浓度的酪氨酸酶溶液，在室温~40℃下孵育0.5~1.5 h；在激发波长为432nm，发射波长为580 nm下进行荧光测量；根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭共价有机纳米球的荧光程度不同，构建体系在580 nm处的荧光强度与酪氨酸酶溶液之间的线性关系，即可定量检测酪氨酸酶活性。
所述缓冲溶液为磷酸钠-氯化钠缓冲溶液（SPSC缓冲液：0.75 mM NaCl和50 mMNa2HPO4），pH值范围为6.0~7.4。
图4为加入不同浓度的酪氨酸酶后体系的荧光发射光谱图。从图4中可以看出，随着酪氨酸酶浓度的增加（从a到n酪氨酸酶的浓度依次为0，0.005，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，8和15 μg/mL），体系在580 nm处的荧光强度逐渐降低。
图5为加入不同浓度的酪氨酸酶后体系的荧光强度与酪氨酸酶浓度的对数值之间的线性关系图。从图5中可以看出，体系在580 nm处的荧光强度与酪氨酸酶浓度的对数值（浓度区间为0.005~15 μg/mL）之间存在良好的线性关系，线性回归方程为：
Y=-130.46X+194.07
其中Y为体系的荧光强度，X为酪氨酸酶浓度的对数值。
以空白溶液10次测定结果的标准偏差的3倍为信噪比，得出该方法的检测限为0.0015 μg/mL，结果表明该方法具有较宽的线性范围和较低的检测限。
图6为体系在不同浓度的酪氨酸酶及干扰物或复杂基质中的荧光信号强度柱状图。其中I0 和I分别为不存在和存在酪氨酸酶及干扰物或复杂基质时，体系在580 nm处的荧光强度。图中数字1-20分别为：空白溶液、1 mg/mL的人血清白蛋白、1 mg/mL的牛血清白蛋白、1 mg/mL的辣根过氧化物酶、50 U/mL的葡萄糖氧化酶、10%的胎牛血清、50 U/mL的溶菌酶、50 U/mL的切刻内切酶Nt.BbvCI、50 U/mL的胰蛋白酶、1 mg/mL的L-赖氨酸、 1 mg/mL的L-精氨酸、1 mg/mL的L-组氨酸、1 mg/mL的L-半胱氨酸、1 mg/mL的尿酸、1 mg/mL的抗坏血酸、1 mg/mL的谷胱甘肽、A549细胞裂解液 (106 个细胞)、0.5 μg/mL的酪氨酸酶、5.0 μg/mL的酪氨酸酶、8.0 μg/mL的酪氨酸酶。从图6中可以看出干扰物或者复杂基质均不会干扰酪氨酸酶的检测，只有在酪氨酸酶存在的情况下，体系的荧光才会随着酪氨酸酶浓度的变化而变化。以上研究结果表明本发明检测酪氨酸酶具有良好的选择性。
检测酪氨酸酶的机理：酪氨酸酶与具有荧光性能的共价有机纳米球在缓冲溶液中涡旋混匀，加入酪氨酸酶并孵育一定时间，由于这个过程中酪氨酸酶可以催化氧化酪氨酸生成黑色素类寡聚体，组装在具有荧光性能的共价有机纳米球表面生成黑色素类聚合物，并且黑色素类聚合物的吸收光谱与共价有机纳米球的荧光发射光谱之间存在很好的光谱重叠（见图7），导致两者之间发生荧光共振能量转移，从而显著猝灭共价有机纳米球的荧光。通过对比反应前后体系荧光强度的变化，最终达到酪氨酸酶活性检测及抑制剂筛选的目的。
综上所述，本发明建立的荧光分析法，能快速、高灵敏、高选择性地实现酪氨酸酶活性检测，在酪氨酸酶相关疾病早期诊断与检测等领域具有重要的指导意义；本发明整个实验过程操作非常简单，无需任何修饰和标记，成本低，应用性强。
附图说明
图1为具有荧光性能的共价有机纳米球的XPS图。
图2为具有荧光性能的共价有机纳米球的拉曼光谱图。
图3为具有荧光性能的共价有机纳米球的荧光发射光谱图。
图4为加入不同浓度的酪氨酸酶后体系的荧光发射光谱图。
图5为加入不同浓度的酪氨酸酶后体系的荧光强度与酪氨酸酶浓度的对数值之间的线性关系图。
图6为体系在不同浓度的酪氨酸及干扰物或复杂基质中的荧光信号强度柱状图。
图7为黑色素类聚合物的吸收光谱（a）与具有荧光性能的共价有机纳米球的荧光发射光谱（b）图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明中的酪氨酸酶活性的荧光检测方法做进一步说明。
实施例1
（1）共价有机纳米球溶液的制备：将0.0581 g（0.2 mmol）三(4-氨基苯基)胺和0.0659 g（0.2 mmol）三(4-甲酰基苯基)胺溶于1.5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）超声分散成均相溶液，加入15 mL无水甲醇作为反应溶剂，在室温下磁力搅拌 10 min后加入0.6 mL3.0 mol/L乙酸，继续磁力搅拌反应1.0 h得黄色固体粗产物，随后经离心、洗涤、干燥，并将其分散于pH=7.4的磷酸钠-氯化钠缓冲溶液中，即得具有荧光性能的共价有机纳米球溶液；
（2）准样品溶液的检测：别取一系列相同体积的共价有机纳米球溶液（100 μL、50μg/mL），并向其中分别加入一定量的酪氨酸（100 μL、20.0 mM）涡旋混匀，混匀后再分别加入200 μL一系列不同浓度的酪氨酸酶（浓度依次为0，0.005，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，8 和 15 μg/mL）和一定量的缓冲溶液（600 μL），在37℃下孵育1.0 h，测量样品溶液在580 nm处的荧光强度，并绘制酪氨酸酶的标准曲线，其线性关系如图5所示。以空白溶液10次测定结果的标准偏差的3倍为信噪比，得出该方法的检测限为0.0015 μg/mL，结果表明该方法具有较宽的线性范围和较低的检测限。以8.0 μg/mL的酪氨酸酶标准溶液为例，平行测定9次，其相对标准差小于5.0%（n=9），表明该方法表明具有良好的重现性。
（2）复杂生物样品的检测
取相同体积的血清作为样品按照酪氨酸酶标准样品的检测过程进行分析，计算测定结果、加标回收率及相对标准偏差，结果如表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001

Claims (3)

1.一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法，包括以下步骤：
（1）具有荧光性能的共价有机纳米球的制备：将三（4-氨基苯基）胺（TAPA）和三（4-氨基苯基）醛（TFPA）以等摩尔比超声分散N,N-二甲基甲酰胺中形成均相溶液；再加入甲醇为反应溶剂，乙酸为催化剂，在室温~70℃下反应0.5~5.0 h；反应结束后经离心、洗涤、干燥，即得；
（2）酪氨酸酶的检测：将上述制备的具有荧光性能的共价有机纳米球与酪氨酸在缓冲溶液中涡旋混匀，加入一系列不同浓度的酪氨酸酶溶液，在室温~40℃下孵育0.5~1.5 h；在激发波长为432 nm，发射波长为580 nm下进行荧光测量；根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭共价有机纳米球的荧光程度不同，构建体系在580 nm处的荧光强度与酪氨酸酶溶液之间的线性关系，即可定量检测酪氨酸酶活性；
酪氨酸酶浓度区间在0.005~15 μg/mL内，体系在580 nm处的荧光强度与酪氨酸酶浓度的对数值之间存在以下线性关系：
Y=-130.46X+194.07
其中，Y为体系的荧光强度，X为酪氨酸酶浓度的对数值。
2.如权利要求1所述一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：步骤（1）中，催化剂乙酸的用量为原料有机醛和有机胺总摩尔量的3.0~6.0倍。
3.如权利要求1所述一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述缓冲溶液为磷酸钠-氯化钠缓冲溶液，pH值范围为6.0~7.4。
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CN111307968B (zh) * 2020-02-24 2022-07-19 山东省分析测试中心 一种花球状共价有机框架材料及其制备与应用
CN111208109B (zh) * 2020-03-17 2022-11-22 福建师范大学 一种基于AuPB@Au NPs荧光检测酪氨酸酶的方法
CN111208130B (zh) * 2020-03-17 2022-07-29 福建师范大学 一种快速检测血清中酪氨酸酶的试纸条及其制备方法与应用
CN113295658A (zh) * 2021-03-22 2021-08-24 闽江学院 一种检测酪氨酸酶活性的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017203999A1 (ja) * 2016-05-25 2017-11-30 国立大学法人名古屋大学 白斑毒性及び黒皮症毒性の試験方法
CN107084954B (zh) * 2017-05-02 2019-09-27 安徽师范大学 一种荧光传感器的制备方法、一种检测酪氨酸酶的方法
CN107817233A (zh) * 2017-10-24 2018-03-20 深圳中科唯新生物技术有限公司 一种检测生物素酶酶活性的方法
CN107937480B (zh) * 2017-11-09 2021-12-03 安徽师范大学 一种荧光生物传感器、制备方法及其检测有机磷农药的应用
CN109679407A (zh) * 2019-01-31 2019-04-26 江苏义倍医疗科技股份有限公司 一种放疗专用定位笔用墨水的制备方法

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