CN107817233A - 一种检测生物素酶酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，上述方法所采用的试剂1包括缓冲液及酶活稳定剂组成的体系，pH值为4至8，上述方法所采用的试剂2包括底物溶液，上述底物溶液的成分为N‑D‑生物素‑7‑氨基‑4‑甲基香豆素，浓度为0.05mmol/L至5mmol/L，上述方法所采用的试剂3为终止液，及上述方法所采用的试剂4为标准品。本发明提供的一种检测生物素酶酶活性的方法，是以N‑D‑生物素酰‑7‑氨基‑4甲基香豆素为底物，反应终止后无需进行衍生化反应可直接进行检测，操作简单，并且具有较高的检测灵敏度及更宽的检测线性，不需要对样本进行任何形式的前期处理，可直接用于酶活性检测，方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种检测生物素酶酶活性的方法。
背景技术
生物素酶是一种糖蛋白，广泛存在于血清、白细胞、成纤维细胞及肝脏等组织中，其主要功能是水解食物中及机体代谢产生的生物胞素和生物素-肽，产生游离的生物素提供体内4种羧化酶的辅酶来源等。食物中的生物素绝大部分是以蛋白结合态存在，生物素酶功能缺乏将导致机体内生物素缺乏，引起体内糖、脂及蛋白质代谢异常，即出现生物素酶缺乏症(Biotinidase deficiency，BD)，也称迟发型多羧化酶缺乏症，该病可引起线粒体能量合成障碍，引起代谢性酸中毒、有机酸尿症及一系列神经与皮肤系统损害，严重时致死。
生物素酶缺乏症是一种常染色体隐性遗传疾病，发病年龄一般在1周龄至10岁，平均年龄3.5个月。生物素酶缺乏症临床表现复杂，涉及神经系统、呼吸系统、皮肤系统等多系统，出现发育滞后、视力及听力下降等，患者间症状差异较大；生化异常包括代谢性酸中毒、有机酸尿症及高氨血症等，严重时出现昏迷甚至死亡。根据血浆残余生物素酶活性大小，可将生物素酶缺乏症分成两种类型，即严重缺乏型(酶活性＜10％正常人平均值)和部分缺乏型(酶活性处于正常人平均值的10％～30％)。据1991年的统计，生物素酶缺乏症的全球发病率约为1/60,000，但不同地区间发病率差异很大，例如希腊高达1/4,508、土耳其为1/11,000、欧洲10个国家的整体发病率为1/47,486。在我国尚无发病率统计，仅有约20例临床病例报道，根据病例分布推测，本病在我国的发病率可能存在南北差异。口服游离生物素可以改善或阻止生物素酶缺乏症的临床症状，疗效显著且无毒副作用。若能及时确诊患者，并终生补充生物素进行预防治疗，患者将正常生长发育而不受任何影响，但若诊断较晚，出现发育滞后、视力及听力等器质性损伤时，这些症状将无法恢复。因此，早期确诊并进行预防治疗，是防治生物素酶缺乏症的关键。
生物素酶缺乏症可从3个方面进行分析诊断，即生物素酶酶活性分析、体内代谢物水平分析及基因分析。其中代谢物水平常受到发病状态、饮食及用药等影响，并且很难将生物素酶缺乏症与其它疾病进行区分(如全羧化酶合成酶缺乏症等)。由于单核苷酸多态性等原因，基因分析也存在不确定性；同时基因的表达翻译及功能的实现往往需要一些其它分子或蛋白的参与或修饰，有很多这类机制目前还未完全被揭示，因此代谢物水平和基因分析都不能作为诊断的可靠依据。而酶活性水平分析则基本不存在上述问题，不仅特异性高，而且不受发病状态等影响，因此，对生物素酶缺乏症的诊断主要是基于生物素酶的酶活性分析，是生物素酶缺乏症诊断的金标准。
目前，国际上采用的生物素酶活性分析方法多以人工底物类似物N-生物素-p-氨基苯甲酸为反应底物，通过检测其酶促水解产物p-氨基苯甲酸的衍生物的吸光值来检测酶活性，此方法是经典的光吸收检测法，从成本角度看较为经济，因此也是多年来大多数机构在使用的方法。但该方法操作复杂，一些药物如磺胺类药物会使检测结果出现假阴性，且近些年的研究显示该方法也有大量的假阳性结果出现。
此外以人工底物类似物-生物素-6-氨基喹啉作为底物，通过检测其酶促水解产物氨基喹啉的荧光值来检测生物素酶酶活性也是一种在使用的方法，但该方法成本较高，且可因较高的白蛋白浓度及使用某些抗生素而出现假阳性，另外，高甘油三酯浓度会使结果出现假阴性。
其它方法还有以荧光及放射性标记的生物素衍生物等为底物的，但均存在费用较高、操作更复杂、更费时等问题。以天然底物生物胞素为反应底物检测生物素酶活性存在成本高，操作复杂等缺点。因此需要找到一种灵敏、稳定、经济、操作简便的检测生物素酶酶活性的方法，更好的应用于新生儿生物素酶缺乏症的筛查，以能更早干预提高人口素质。
发明内容
本发明提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，以至少解决现有技术中检测生物素酶酶活性的方法不稳定、成本高、操作复杂的技术问题。
本发明提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，上述方法包括如下步骤：
1)取试剂1、试剂2、试剂3及试剂4，备用；上述试剂1包括缓冲液及酶活稳定剂组成的体系，pH值为4至8，上述试剂2包括底物溶液，上述底物溶液的成分为N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为0.05mmol/L至5mmol/L，上述试剂3为终止液，及上述试剂4为标准品；
2)样本检测：
2.1)将上述样本加入上述试剂1，混匀后得样本混合体系，将上述试剂2加入到上述样本混合体系中，30℃至39℃温育，反应结束后向上述样本混合体系中加入上述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
2.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
3)空白对照：
3.1)将经煮沸灭活处理后的上述样本加入上述试剂1，混匀后得空白混合体系，将上述试剂2加入到上述空白混合体系中，30℃至39℃温育，反应结束后向上述空白混合体系中加入上述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
3.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
4)使用上述试剂4制备标准曲线；
5)根据上述标准曲线计算出样本浓度，从而计算出酶的活力。
可选的，上述缓冲液及酶活稳定剂组成的体系的pH值为5至7.5，上述底物溶液的成分N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素的浓度为0.1mmol/L至3mmol/L；上述样本检测步骤中，将上述试剂2加入到上述样本混合体系中，35℃至39℃温育；上述空白对照步骤中，将上述试剂2加入到上述空白混合体系中，35℃至39℃温育。
可选的，上述缓冲液及酶活稳定剂组成的体系的pH值为5.5至6.5，上述底物溶液的成分N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素的浓度为0.5mmol/L至2mmol/L；上述样本检测步骤中，将上述试剂2加入到上述样本混合体系中，36℃至38℃温育；上述空白对照步骤中，将上述试剂2加入到上述空白混合体系中，36℃至38℃温育。
可选的，上述缓冲液为磷酸缓冲液，pH值为4至8，或上述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为4至6.6，或上述缓冲液为磷酸氢盐-柠檬酸缓冲液，pH值为4至8，或上述缓冲液为磷酸氢盐-柠檬酸盐缓冲液，pH值为4至8，上述缓冲液的浓度为20mmol/L至200mmol/L；上述酶活性稳定剂为乙二胺四乙酸，或乙二胺四乙酸盐中的一种，或乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐其中之一与牛血清白蛋白两种合用作为上述酶活性稳定剂，上述乙二胺四乙酸浓度为0.1mmol/L至8mmol/L，上述牛血清白蛋白浓度为0.05mg/ml至1mg/ml；
上述终止液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH值为9.16至10.83，或上述终止液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH值为8.6至10.6；
上述标准品为7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
可选的，上述缓冲液的浓度为40mmol/L至100mmol/L，上述乙二胺四乙酸浓度为2mmol/L至5mmol/L，上述牛血清白蛋白浓度为0.25mg/ml至0.5mg/ml。
可选的，上述试剂1包括：pH值为5.2的磷酸钾缓冲液，浓度为200mmol/L，包括乙二胺四乙酸，浓度为8mmol/L；
上述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为0.1mmol/L；
上述试剂3包括：pH值为9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，浓度为0.5mol/L；
上述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
可选的，上述试剂1包括：pH值为8.0的磷酸钾缓冲液，浓度为20mmol/L，包括乙二胺四乙酸二钠，浓度为1mmol/L；
上述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为0.5mmol/L；
上述试剂3包括：pH值为10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，浓度为0.2mol/L；
上述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
可选的，上述试剂1包括：pH值为6.5的磷酸钾缓冲液，浓度为80mmol/L，包括乙二胺四乙酸二钠，浓度为0.2mmol/L，还包括牛血清白蛋白，浓度为0.5mg/ml；
上述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为2mmol/L；
上述试剂3包括：pH值为10.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，浓度为0.5mol/L；
上述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
可选的，上述试剂1包括：pH值为6.0的磷酸钾缓冲液，浓度为50mmol/L，包括乙二胺四乙酸，浓度为4mmol/L，还包括牛血清白蛋白，浓度为0.4mg/ml；
上述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为1mmol/L；
上述试剂3包括：pH值为10.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，浓度为0.5mol/L；
上述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
可选的，上述方法包括如下步骤：
1)取上述试剂1、上述试剂2、上述试剂3及上述试剂4，备用；
2)生物素酶酶活性的检测：
阴性对照样本来自于健康成年人的外周静脉乙二胺四乙酸抗凝血，离心后获取血浆待用，阳性样本来自于临床上确诊为生物素酶缺乏症患者的外周静脉乙二胺四乙酸抗凝血，离心后获取血浆待用；
3)样本检测：
3.1)样本反应体系为200ul，上述试剂1取180ul，加入上述血浆样本10ul，混匀后得样本混合体系，取10ul上述试剂2加入到上述样本混合体系中，37℃温育1小时，反应结束后向上述样本混合体系中加入1.8ml上述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
3.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
4)空白对照：
4.1)空白反应体系为200ul，上述试剂1取180ul，加入经煮沸灭活处理后的上述血浆样本10ul，混匀后得空白混合体系，取10ul上述试剂2加入到上述空白混合体系中，37℃温育1小时，反应结束后向上述空白混合体系中加入1.8ml上述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
4.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
5)使用上述试剂4制备标准曲线；
6)根据上述标准曲线计算出样本浓度，从而计算出酶的活力。
本发明所述的乙二胺四乙酸，本领域普通技术人员通常简称为EDTA，本发明所述的牛血清白蛋白，本领域普通技术人员通常简称为BSA，″2h″表示″2小时″。
本发明提供的一种检测生物素酶酶活性的方法，包括独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4，本发明方法进行检测时，是以N-D-生物素酰-7-氨基-4甲基香豆素为底物，反应终止后无需进行衍生化反应可直接进行检测，因此操作简单，并且具有较高的检测灵敏度及更宽的检测线性，本发明方法不需要对样本进行任何形式的前期处理，可直接用于酶活性检测，方便快捷，可在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用本发明，比较方便。本发明方法可用于辅助诊断生物素酶缺乏症。
附图说明
图1为本发明实施例的一种可选的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的标准曲线示意图，其中曲线方程为y＝4.591+0.836，R2＝0.999。
下面具体实施方式用于进一步说明但不限于本发明，下面实施例仅为本发明一种优选地实施方式。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，包括如下步骤：
(1)取如下组分：
试剂1：
磷酸钾缓冲液(pH 5.2) 200mmol/L
乙二胺四乙酸 8mmol/L
试剂2：
N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液 0.1mmol/L
试剂3：
碳酸钠/碳酸氢钠水溶液(pH9.5) 0.5mol/L
试剂4：
7-氨基-4-甲基香豆素 10mmol/L
(2)生物素酶酶活性的检测
样本来自于健康成年人的外周静脉EDTA抗凝血，离心后获取血浆待用。
样本检测：
1)反应体系为200ul，试剂1取180ul，加入血浆样本10ul，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，36℃温育2h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
空白对照：
1)反应体系为200ul，试剂1取180ul，加入经煮沸灭活处理后的血浆样本10ul，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，36℃温育2h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
标准曲线制备：
取100ul试剂4加入900ul试剂1进行稀释，标记为标1，混匀后的标1取400ul，加入600ul试剂1进行稀释，标记为标2，混匀后的标2取400ul，加入400ul试剂1进行稀释，标记为标3，混匀后的标3取300ul，加入300ul试剂1进行稀释，标记为标4，混匀后的标4取300ul，加入300ul试剂1进行稀释，标记为标5，混匀后的标5取200ul加入200ul试剂1进行稀释，标记为标6。标1～标6即为待用的标准品，如表1所示：
表1
表1.标准品稀释方法(表中数字单位：ul)
分别取稀释后的标准品标1～标6各200ul，分别加入1.8ml试剂3，混匀后即可检测。
检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；以标准品(标1～标6)的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线，获得曲线方程(见图1)。将待测样本的荧光值带入曲线方程即可得出待测样本中含有的标准品浓度，通过计算即可得出待测样本中生物素酶酶活性的数值。
所述酶活性的单位定义为：每L样本每分钟水解N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素生成的7-氨基-4-甲基香豆素的微摩尔数，表示为μmol/L/min。
检测结果空白对照基本无荧光值，样本荧光值均值为271.5。结果见表2。
由表2可知，本实施例提供的检测生物素酶酶活性的试剂盒检测的结果稳定(CV＜5％)可靠，能够有效的检测出生物素酶酶活性，可以应用于临床检测及筛查领域。
实施例2
本实施例提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，包括如下步骤：
(1)取如下组分：
试剂1：
磷酸钾缓冲液(pH 8.0) 20mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 1mmol/L
试剂2：
N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液 0.5mmol/L
试剂3：
甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH10.0) 0.2mol/L
试剂4：
7-氨基-4-甲基香豆素 10mmol/L
(2)生物素酶酶活性的检测
样本来自于健康成年人的外周静脉EDTA抗凝血，离心后获取血浆待用。
样本检测：
1)反应体系为200ul，试剂1取180ul，加入血浆样本10ul，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，35℃温育2h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
空白对照：
1)反应体系为200ul，试剂1取180ul，加入经煮沸灭活处理后的血浆样本10ul，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，35℃温育2h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
标准曲线制备：
同实施例1中的标准曲线制备；
分别取稀释后的标准品标1～标6各200ul，分别加入1.8ml试剂3，混匀后即可检测。
检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；以标准品(标1～标6)的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线，获得曲线方程，将待测样本的荧光值带入曲线方程即可得出待测样本中含有的标准品浓度，通过计算即可得出待测样本中生物素酶酶活性的数值。
所述酶活性的单位定义为：每L样本每分钟水解N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素生成的7-氨基-4-甲基香豆素的微摩尔数，表示为μmol/L/min。
检测结果空白对照基本无荧光值，样本荧光值均值为52.8。结果见表2，由表2可知，本实施例提供的检测生物素酶酶活性的试剂盒检测的结果稳定(CV＜5％)可靠，能够有效的检测出生物素酶酶活性，可以应用于临床检测及筛查领域。
实施例3
本实施例提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，包括如下步骤：
(1)取如下组分：
试剂1：
磷酸钾缓冲液(pH 6.5) 80mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 0.2mmol/L
BSA 0.5mg/ml
试剂2：
N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液 2mmol/L
试剂3：
碳酸钠/碳酸氢钠水溶液(pH10.8) 0.5mol/L
试剂4：
7-氨基-4-甲基香豆素 10mmol/L
(2)生物素酶酶活性的检测
样本来自于健康成年人的外周静脉血，滴加在903#滤纸上制作成的干血滤纸片，室温干燥后待用。
样本检测：
1)反应体系为200ul，试剂1取190ul，加入一直径3mm的干血滤纸片样本，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，37℃温育24h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
空白对照：
1)反应体系为200ul，试剂1取190ul，加入经煮沸灭活处理后的一直径3mm的干血滤纸片样本，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，37℃温育24h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
标准曲线制备：
同实施例1中的标准曲线制备；
分别取稀释后的标准品标1～标6各200ul，分别加入1.8ml试剂3，混匀后即可检测。
检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；以标准品(标1～标6)的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线，获得曲线方程，将待测样本的荧光值带入曲线方程即可得出待测样本中含有的标准品浓度，通过计算即可得出待测样本中生物素酶酶活性的数值。
所述酶活性的单位定义为：每L样本每分钟水解N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素生成的7-氨基-4-甲基香豆素的微摩尔数，表示为μmol/L/min。
检测结果空白对照基本无荧光值，样本荧光值均值为75.4。结果见表2，由表2可知，本实施例提供的检测生物素酶酶活性的试剂盒检测的结果稳定(CV＜5％)可靠，能够有效的检测出生物素酶酶活性，可以应用于临床检测及筛查领域。
本发明实施例提供的试剂盒可直接用于检测干血片样本，可通过将血液滴在吸附材料上，并经过干燥后获得，所用的吸附材料包括但不限于滤纸等吸水性材料(常用的如903#滤纸)，干燥可在室温干燥4～16h，也可通过其它干燥设备干燥一段时间实现。
利用本发明试剂盒进行检测时，所使用的干血片样本中生物素酶酶活性在室温条件下可以稳定数月时间，在低温条件下(如-20℃)可以稳定数年时间，因此有利于样本的保存、运输及生物素酶缺乏症的筛查。
本发明提供的试剂盒还可以用于分析和检测源自人体或动物的各类标本(包括各种体液、细胞或组织及其所制成的干片)中的生物素酶酶活力，如可用于血浆、血清、白细胞、培养细胞及其制备的干片等，适用标本范围广。
实施例4
本实施例提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，包括如下步骤：
(1)取如下组分：
试剂1：
磷酸钾缓冲液(pH 6.0) 50mmol/L
乙二胺四乙酸 4mmol/L
BSA 0.4mg/ml
试剂2：
N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液 1mmol/L
试剂3：
碳酸钠/碳酸氢钠水溶液(pH10.8) 0.5mol/L
试剂4：
7-氨基-4-甲基香豆素 10mmol/L
(2)生物素酶酶活性的检测
阴性对照样本来自于健康成年人的外周静脉EDTA抗凝血，离心后获取血浆待用。阳性样本来自于临床上确诊为生物素酶缺乏症患者的外周静脉EDTA抗凝血，离心后获取血浆待用。
样本检测：
1)反应体系为200ul，试剂1取180ul，加入血浆样本10ul，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，37℃温育1h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
空白对照：
1)反应体系为200ul，试剂1取180ul，加入经煮沸灭活处理后的血浆样本10ul，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，37℃温育1h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值。
标准曲线制备：
同实施例1中的标准曲线制备；
分别取稀释后的标准品标1～标6各200ul，分别加入1.8ml试剂3，混匀后即可检测。
检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；以标准品(标1～标6)的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线，获得曲线方程，将待测样本的荧光值带入曲线方程即可得出待测样本中含有的标准品浓度，通过计算即可得出待测样本中生物素酶酶活性的数值。
所述酶活性的单位定义为：每L样本每分钟水解N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素生成的7-氨基-4-甲基香豆素的微摩尔数，表示为μmol/L/min。
检测结果空白对照基本无荧光值，样本荧光值均值为150.8。结果见下表(表2)：
表2
由此可见，本实施例提供的检测生物素酶酶活性的试剂盒检测的结果稳定(CV＜5％)可靠，能够有效的检测出生物素酶酶活性，可以应用于临床检测及筛查领域，尤其是实施例4的试剂盒，检测效果尤为显著。
实施例5
本发明申请提供的方法标记为方法1
本实施例提供了一种检测生物素酶酶活性的方法，包括如下步骤：
(1)取如下组分：
试剂1：
磷酸钾缓冲液(pH 6.0) 50mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 4mmol/L
BSA 0.4mg/ml
试剂2：
N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液 1mmol/L
试剂3：
碳酸钠/碳酸氢钠水溶液(pH10.8) 0.5mol/L
试剂4：
7-氨基-4-甲基香豆素 10mmol/L
(2)生物素酶酶活性的检测
阴性对照样本来自于健康成年人的外周静脉血，滴加在903#滤纸上制作成的干血滤纸片，室温干燥后待用。阳性样本来自于临床上确诊为生物素酶缺乏症患者的外周静脉血，滴加在903#滤纸上制作成的干血滤纸片，室温干燥后待用。
样本检测：
1)反应体系为200ul，试剂1取190ul，加入一直径3mm的干血滤纸片样本，混匀后，取10ul试剂2加入到混合体系中，37℃温育24h，反应结束后向体系中加入1.8ml试剂3终止反应，混匀后即可检测。。
2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
标准曲线制备：
同实施例1中的标准曲线制备；
分别取稀释后的标准品标1～标6各200ul，分别加入1.8ml试剂3，混匀后即可检测。
检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；以标准品(标1～标6)的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线，获得曲线方程，将待测样本的荧光值带入曲线方程即可得出待测样本中含有的标准品浓度，通过计算即可得出待测样本中生物素酶酶活性的数值。
所述酶活性的单位定义为：每L样本每小时水解N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素生成的7-氨基-4-甲基香豆素的微摩尔数，表示为μmol/L/h。
【光吸收法】(标记为方法2)参照文献方法进行：
50ul反应体系中，包含50mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0，5mmol/LEDTA，0.15mmol/L底物BPAB，1片3mm直径干血滤纸片，混匀后37℃反应24h，之后加入20ul 30％TCA，混匀后2000g离心10min，吸取150ul离心上清至一新的EP管中，然后加入20ul的0.1％亚硝酸钠，反应3min后加入20ul的0.5％氨基磺酸铵，反应3min后加入20ul的0.1％奈乙二胺二盐酸，反应10min后取200ul混合液于546nm检测吸光值。
标准曲线制备：取标准品PAB，用除BPAB之外的缓冲溶液稀释成5-15nmol/L的标准品稀释液，之后操作与样本检测步骤相同，最后于546nm检测吸光值，以吸光值为纵坐标，以PAB浓度为横坐标，制备标准曲线，获得曲线方程，将待测样本的吸光值带入曲线方程即可得出待测样本中含有的标准品浓度，通过计算即可得出待测样本中生物素酶酶活性的数值。
所述酶活性的单位定义为：每L样本每小时水解BPAB生成的PAB的微摩尔数，表示为μmol/L/h。
【生物胞素为底物的荧光法】(标记为方法3)，参照专利文献提供的方法进行：
200ul反应体系中包含20mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液(pH5.5)，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，0.2mmol/L生物胞素，1片3mm直径干血滤纸片于37℃以200r/min的速度震荡24h，之后加入60％(wt)高氯酸20ul终止反应，终止后样品管10000g离心10min取上清液150ul，加入1mol/L的Na2CO3 100ul中和体系达到pH9.0，之后加入1％(wt)的1，2-二乙酰苯，混匀后在30℃下进行衍生反应30min。反应结束后在激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm的条件下读取荧光值。
标准曲线制备：取赖氨酸标准品，用除生物胞素之外的缓冲液稀释至浓度分别为0、7.5、15、30、60、90、120、150μmol/L，分别取稀释后的标准品各200ul，加入如上反应体系的终止液及衍生反应液，其中衍生反应的条件与样本检测步骤相同；反应结束后在激发波长360nm以及发射波长460nm读取荧光值；以赖氨酸的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线，获得曲线方程，将待测样本的荧光值带入曲线方程即可得出待测样本中含有的标准品浓度，通过计算即可得出待测样本中生物素酶酶活性的数值。
所述酶活性的单位定义为：每L样本每小时水解生物胞素生成的赖氨酸的微摩尔数，表示为μmol/L/h。方法1、方法2、方法3检测生物素酶酶活性的结果如表3所示：
表3
由表3可见，三种方法均能检测出健康样本中的生物素酶酶活性，均能检测出阴性对照与阳性样本的差异，并且CV均小于10％，说明方法稳定性较好，因此三种方法均可用于生物素酶活性检测。但方法2与方法3与本发明提供的方法1相比，操作步骤繁多，大大增加了操作的难度和出现误操作的几率，因此本发明申请提供的检测生物素酶酶活性的试剂盒从操作难易程度上具有明显优势，同时从表3的结果中可知本发明提供的生物素酶酶活性试剂盒比方法2和方法3更易于展现出酶活性的优势，增加对比度，因此能够有效的检测出生物素酶酶活性的强弱，因此本发明申请提供的试剂盒具有明显优势，可以应用于临床检测及筛查领域。
Claims (10)
1.一种检测生物素酶酶活性的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)取试剂1、试剂2、试剂3及试剂4，备用；所述试剂1包括缓冲液及酶活稳定剂组成的体系，pH值为4至8，所述试剂2包括底物溶液，所述底物溶液的成分为N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为0.05mmol/L至5mmol/L，所述试剂3为终止液，及所述试剂4为标准品；
2)样本检测：
2.1)将所述样本加入所述试剂1，混匀后得样本混合体系，将所述试剂2加入到所述样本混合体系中，30℃至39℃温育，反应结束后向所述样本混合体系中加入所述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
2.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
3)空白对照：
3.1)将经煮沸灭活处理后的所述样本加入所述试剂1，混匀后得空白混合体系，将所述试剂2加入到所述空白混合体系中，30℃至39℃温育，反应结束后向所述空白混合体系中加入所述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
3.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
4)使用所述试剂4制备标准曲线；
5)根据所述标准曲线计算出样本浓度，从而计算出酶的活力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液及酶活稳定剂组成的体系的pH值为5至7.5，所述底物溶液的成分N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素的浓度为0.1mmol/L至3mmol/L；所述样本检测步骤中，将所述试剂2加入到所述样本混合体系中，35℃至39℃温育；所述空白对照步骤中，将所述试剂2加入到所述空白混合体系中，35℃至39℃温育。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述缓冲液及酶活稳定剂组成的体系的pH值为5.5至6.5，所述底物溶液的成分N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素的浓度为0.5mmol/L至2mmol/L；所述样本检测步骤中，将所述试剂2加入到所述样本混合体系中，36℃至38℃温育；所述空白对照步骤中，将所述试剂2加入到所述空白混合体系中，36℃至38℃温育。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH值为4至8，或所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为4至6.6，或所述缓冲液为磷酸氢盐-柠檬酸缓冲液，pH值为4至8，或所述缓冲液为磷酸氢盐-柠檬酸盐缓冲液，pH值为4至8，所述缓冲液的浓度为20mmol/L至200mmol/L；所述酶活性稳定剂为乙二胺四乙酸，或乙二胺四乙酸盐中的一种，或乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐其中之一与牛血清白蛋白两种合用作为所述酶活性稳定剂，所述乙二胺四乙酸浓度为0.1mmol/L至8mmol/L，所述牛血清白蛋白浓度为0.05mg/ml至1mg/ml；
所述终止液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH值为9.16至10.83，或所述终止液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH值为8.6至10.6；
所述标准品为7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述缓冲液的浓度为40mmol/L至100mmol/L，所述乙二胺四乙酸浓度为2mmol/L至5mmol/L，所述牛血清白蛋白浓度为0.25mg/ml至0.5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述试剂1包括：pH值为5.2的磷酸钾缓冲液，浓度为200mmol/L，包括乙二胺四乙酸，浓度为8mmol/L；
所述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为0.1mmol/L；
所述试剂3包括：pH值为9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，浓度为0.5mol/L；
所述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述试剂1包括：pH值为8.0的磷酸钾缓冲液，浓度为20mmol/L，包括乙二胺四乙酸二钠，浓度为1mmol/L；
所述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为0.5mmol/L；
所述试剂3包括：pH值为10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，浓度为0.2mol/L；
所述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述试剂1包括：pH值为6.5的磷酸钾缓冲液，浓度为80mmol/L，包括乙二胺四乙酸二钠，浓度为0.2mmol/L，还包括牛血清白蛋白，浓度为0.5mg/ml；
所述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为2mmol/L；
所述试剂3包括：pH值为10.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，浓度为0.5mol/L；
所述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述试剂1包括：pH值为6.0的磷酸钾缓冲液，浓度为50mmol/L，包括乙二胺四乙酸，浓度为4mmol/L，还包括牛血清白蛋白，浓度为0.4mg/ml；
所述试剂2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，浓度为1mmol/L；
所述试剂3包括：pH值为10.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，浓度为0.5mol/L；
所述试剂4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，浓度为10mmol/L。
10.根据权利要求1至9任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)取所述试剂1、所述试剂2、所述试剂3及所述试剂4，备用；
2)生物素酶酶活性的检测：
阴性对照样本来自于健康成年人的外周静脉乙二胺四乙酸抗凝血，离心后获取血浆待用，阳性样本来自于临床上确诊为生物素酶缺乏症患者的外周静脉乙二胺四乙酸抗凝血，离心后获取血浆待用；
3)样本检测：
3.1)样本反应体系为200ul，所述试剂1取180ul，加入所述血浆样本10ul，混匀后得样本混合体系，取10ul所述试剂2加入到所述样本混合体系中，37℃温育1小时，反应结束后向所述样本混合体系中加入1.8ml所述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
3.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
4)空白对照：
4.1)空白反应体系为200ul，所述试剂1取180ul，加入经煮沸灭活处理后的所述血浆样本10ul，混匀后得空白混合体系，取10ul所述试剂2加入到所述空白混合体系中，37℃温育1小时，反应结束后向所述空白混合体系中加入1.8ml所述试剂3终止反应，混匀后即可检测；
4.2)检测条件：激发波长为360±20nm，发射波长为460±20nm，读取荧光值；
5)使用所述试剂4制备标准曲线；
6)根据所述标准曲线计算出样本浓度，从而计算出酶的活力。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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