CN105510583A - 检测生物素酶酶活性的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测生物素酶酶活性的试剂盒。所述试剂盒包括独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4；所述试剂1为由缓冲液1、酶活稳定剂和生物胞素组成的缓冲体系，所述试剂1的pH值为3～11；所述试剂2为终止液；所述试剂3为中和液；所述试剂4为由缓冲液2和衍生底物组成的体系，所述衍生底物为1,2-二乙酰苯、茚三酮、荧光胺和邻苯二醛中任一种。利用本发明试剂盒进行检测时，可以干血片为检测样本，这使得本方法可应用于新生儿筛查，满足生物素酶缺乏症需及时诊治的要求，易于推广使用。

Description

检测生物素酶酶活性的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测酶活性的试剂盒，具体涉及一种检测生物素酶酶活性的试剂盒，属于生物医药检测领域。

背景技术

生物素(Biotin)又称为维生素B₇、维生素H、辅酶R，是一种水溶性的含硫维生素。生物素是体内4种羧化酶的辅酶，包括糖代谢中的关键酶丙酮酸羧化酶、催化脂肪酸合成第一步反应的乙酰辅酶A羧化酶、在蛋白质代谢中起重要作用的丙酰辅酶A羧化酶和β-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶。生物素的缺乏将导致上述酶活性缺失，引起体内糖、脂及蛋白质三大营养物质代谢异常，出现线粒体能量合成障碍，引起代谢性酸中毒、有机酸尿症及一系列神经与皮肤系统损害，严重时致死。另外，生物素还是组蛋白的重要修饰成分，参与基因表达与DNA修复等过程。

生物素酶是一种糖蛋白，广泛存在于血清、白细胞、成纤维细胞及肝脏等组织中。生物素酶的主要功能是水解食物中及机体代谢产生的生物胞素和生物素-肽，产生游离的生物素。虽然生物素在食物中广泛存在，但绝大部分是以蛋白结合态存在，因此，生物素酶缺陷将导致机体既无法从食物中摄取生物素又无法再生机体代谢产生的生物素，最终使机体缺乏生物素，引起体内糖、脂及蛋白质代谢异常，即出现生物素酶缺乏症(Biotinidasedeficiency，BD)，也称迟发型多羧化酶缺乏症。

生物素酶缺乏症是一种常染色体隐性遗传疾病，发病年龄一般在1周至10岁，平均年龄3.5个月，但也有几年后仍无明显症状的。生物素酶缺乏症临床表现复杂，涉及神经系统、呼吸系统、皮肤系统，出现发育滞后、视力及听力下降等，患者间症状差异较大；生化异常包括代谢性酸中毒、有机酸尿症及高氨血症等，严重时出现昏迷甚至死亡。根据血浆残余生物素酶活性大小，可将生物素酶缺乏症分成两种类型，即严重缺乏型(酶活性<10％正常人平均值)和部分缺乏型(酶活性处于正常人平均值的10％～30％)。据1991年的统计，生物素酶缺乏症的全球发病率约为1/60,000，但不同地区间发病率差异很大，例如希腊高达1/4,508、土耳其为1/11,000、欧洲10个国家的整体发病率为1/47,486。在我国尚无发病率统计，仅有约20例临床病例报道，根据病例分布推测，本病在我国的发病率可能存在南北差异。口服游离生物素可以改善或阻止生物素酶缺乏症的临床症状，疗效显著且无毒副作用。若能及时确诊患者，并终生补充生物素进行预防治疗，患者将正常生长发育而不受任何影响，但若诊断较晚，出现发育滞后、视力及听力等器质性损伤时，这些症状将无法恢复。因此，早期确诊并进行预防治疗，是防治生物素酶缺乏症的关键。

由于生物素酶缺乏症临床表现复杂多样，且与许多其它疾病在临床表现上有很多相似之处(如皮疹等)，容易被误诊；另外，部分缺乏型患者往往只在受压(如感染等)情况下才表现出症状，因此不易发现，但他们始终存在发病风险。若未得到正确及时的诊治，致病及致死率均较高。因此，建立生物素酶缺乏症的诊断方法，对患者做出早期诊断，对改善生物素酶缺乏症患者生存质量、提高我国人口出生素质具有重要意义。

生物素酶缺乏症可从3个方面进行分析诊断，即生物素酶酶活性分析、体内代谢物水平分析及基因分析，但后两者只能作为生物素酶缺乏症诊断的辅助或确证手段。因为基于代谢物水平很难将生物素酶缺乏症与其它疾病进行区分(如全羧化酶合成酶缺乏症等)，而且代谢物水平常受到发病状态、饮食及用药等影响，因此基于代谢物水平分析的串联质谱技术等方法只能作为生物素酶缺乏症辅助诊断措施。对于基因水平的分析，由于存在单核苷酸多态性等原因，常常给基因分析带来不确定性；另一方面，基因的表达翻译及功能的实现往往需要一些其它分子或蛋白的参与或修饰，有很多这类机制目前还未完全被揭示，因此基因分析也不能作为诊断的可靠依据，只适用于对生物素酶缺乏症的确证及分型。而酶活性水平分析则基本不存在上述问题，不仅特异性高，而且不受发病状态等影响，因此，对生物素酶缺乏症的诊断主要是基于生物素酶的酶活性分析，是生物素酶缺乏症诊断的金标准。

目前，国际上采用的生物素酶活性分析方法多以人工底物类似物N-生物素-p-氨基苯甲酸为反应底物，通过检测其酶促水解产物p-氨基苯甲酸的衍生物的吸光值来检测酶活性，此方法较经济，但磺胺类药物会使检测结果出现假阴性。另外一种可用于生物素酶活性筛查的反应底物为生物素-6-氨基喹啉，同样是一种人工底物类似物，通过检测其酶促水解产物氨基喹啉的荧光值来检测酶活性，该方法成本较高，且可因较高的白蛋白浓度及使用某些抗生素而出现假阳性，另外，高甘油三酯浓度会使结果出现假阴性。其它方法还有以荧光及放射性标记的生物素衍生物等为底物的，但均存在费用较高、操作更复杂、更费时等问题。值得注意的是，上述方法中均是以人工底物类似物作为反应底物，Ebrahim等研究发现，以天然底物生物胞素为反应底物时，酶活性较人工底物高30±5％。因此，以生物胞素为底物时，检测方法具有更高的检测灵敏度及更宽的检测限，且更能反映样本中生物素酶活性的真实水平。

但是，Ebrahim等建立的方法只能用于血清样本的检测，样本用量大，酶活性稳定时间短，且检测前还必须对样本进行透析处理，操作复杂。以上的不足导致该方法无法应用于新生儿筛查，但如前所述，生物素酶缺乏症必需得到及时的诊治，否则将出现不可逆的损伤。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测生物素酶(Biotinidase，EC3.5.1.12)酶活性的试剂盒，本发明试剂盒进行检测时，是以生物胞素为底物，因此具有较高的检测灵敏度及更宽的检测限；并且不需要对样本进行任何形式的前期处理，可直接用于酶活性检测，方便快捷；可在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用本发明，比较方便。

本发明提供的一种检测生物素酶酶活性的试剂盒，它包括独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4；

所述试剂1为由缓冲液1、酶活稳定剂和生物胞素组成的缓冲体系，所述试剂1的pH值为3～11；

所述试剂2为终止液；

所述试剂3为中和液；

所述试剂4为由缓冲液2和衍生底物组成的体系，所述衍生底物为1,2-二乙酰苯、茚三酮、荧光胺和邻苯二醛中任一种。

上述的试剂盒中，所述试剂1中，所述缓冲液1的摩尔浓度可为50～500mmol/L，所述酶活稳定剂的摩尔浓度可为1～50mmol/L，所述生物胞素的摩尔浓度可为0.05～2mmol/L；

所述试剂2中，所述终止液的质量百分含量可为30％～70％；

所述试剂3中，所述中和液的摩尔浓度可为0.2～2mol/L；

所述试剂4中，所述缓冲液2的摩尔浓度可为50～500mmol/L，所述衍生底物的质量百分含量可为0.05％～5％。

本发明提供的试剂盒的具体组成可为：包括独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4；

所述试剂1为由缓冲液1、酶活稳定剂和生物胞素组成的缓冲体系，所述试剂1的pH值为5.5；所述缓冲液1的摩尔浓度可为200mmol/L，所述酶活稳定剂的摩尔浓度可为10mmol/L，所述生物胞素的摩尔浓度可为2mmol/L；

所述试剂2为终止液，所述终止液的质量百分含量可为60％；

所述试剂3为中和液，所述中和液的摩尔浓度可为1mol/L；

所述试剂4为由缓冲液2和衍生底物组成的体系，所述衍生底物为1,2-二乙酰苯、茚三酮、荧光胺和邻苯二醛中任一种，所述缓冲液2的摩尔浓度可为250mmol/L，所述衍生底物的质量百分含量可为1％。

上述的检测试剂盒中，所述缓冲液1和所述缓冲液2均选自下述缓冲试剂中至少一种：

a)乙酸钠-乙酸缓冲液，pH为2.6-5.8、b)甲酸钠-甲酸缓冲液，pH为2.0-5.0、c)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为3.0-6.6、d)磷酸氢盐-柠檬酸缓冲液，pH为2.2-8.0、e)磷酸氢盐-柠檬酸盐缓冲液，pH为2.2-8.0、f)磷酸盐缓冲液，pH为4.9-8.2、g)柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，pH为2.2-6.5、h)Tris-盐酸缓冲液，pH为7.1-8.9、i)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH为8.6-10.6和j)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH为9.16-10.83。

上述的检测试剂盒中，所述酶活稳定剂可为MgSO₄、MgCl₂、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白、甘油和二甲基亚砜中至少一种。

上述的检测试剂盒中，所述终止液可为高氯酸、盐酸、硫酸、硝酸和三氯乙酸中至少一种的水溶液。

上述的检测试剂盒中，所述中和液可为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙中至少一种的水溶液。

利用本发明提供的试剂盒检测生物素酶酶活性时，可按照下述方法进行：

1)将样本加入至所述试剂1中进行反应；反应结束后加入所述试剂2进行终止反应；将所述反应后的体系进行离心分离，向得到的上清液中加入所述试剂3进行中和至pH值为7～11；向所述中和后的体系中加入所述试剂4进行衍生反应；检测所述衍生反应后的体系在激发波长300～500nm和发射波长400～600nm下的荧光值；

2)将经灭活处理后的样本加入至所述试剂1中进行反应；反应结束后加入所述试剂2进行终止反应；将所述反应后的体系进行离心分离，向得到的上清液中加入所述试剂3进行中和至pH值为7～11；向所述中和后的体系中加入所述试剂4进行衍生反应；检测所述衍生反应后的体系在激发波长300～500nm和发射波长400～600nm下的荧光值，作为空白对照的荧光值；

所述反应与步骤1)中所述反应的条件相同；

所述终止反应与步骤1)中所述终止反应的条件相同；

所述衍生反应与步骤1)中所述衍生反应的条件相同；

3)将至少8种不同浓度的赖氨酸标准品分别与所述试剂4进行所述衍生反应，并检测所述衍生反应后的体系在激发波长300～500nm和发射波长400～600nm下的荧光值；以赖氨酸的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线；

所述衍生反应与步骤1)中所述衍生反应的条件相同；

4)根据步骤1)中所检测的荧光值与步骤2)中作为空白对照的荧光值的差值和所述标准曲线，即得到步骤1)中进行所述衍生反应的赖氨酸的浓度，进而得到所述样本中生物素酶的酶活性；

所述酶活性的单位定义为：以每L样本每小时水解所述生物胞素生成的赖氨酸的微摩尔数，表示为μmol/L/h。

上述的检测方法中，步骤1)和步骤2)中，所述反应的温度可为4～60℃，时间可为0.5～48小时，如在37℃的条件下反应24小时。

上述的检测方法中，步骤1)和步骤2)中，所述终止反应步骤中，所述试剂2与所述试剂1体积比为1：20；

所述中和步骤中，所述上清液与所述试剂3的体积比可为0.5～3：1，具体可为2：1；

所述衍生反应步骤中，所述上清液与所述试剂4的体积比可为0.5～2：1，具体可为1：1；所述衍生反应的温度可为4～60℃，时间可为0.2～2小时，如在30℃的条件下反应0.5小时。

上述的检测方法中，步骤2)中，所述灭活处理的方法为煮沸灭活或高温灭活；所述高温灭活的温度不低于80℃。

步骤3)中，所述赖氨酸标准品浓度可为0～150μmol/L，如0、7.5、15、30、60、90、120和150μmol/L。

本发明提供的试剂盒可用于辅助诊断生物素酶缺乏症。

本发明提供的试剂盒可直接用于检测干血片样本，可通过将血液滴在吸附材料上，并经过干燥后获得。所用的吸附材料包括但不限于滤纸等吸水性材料(常用的如903#滤纸)；干燥可在室温干燥4～16h，也可通过其它干燥设备干燥一段时间实现。

利用本发明试剂盒进行检测时，所使用的干血片样本中生物素酶酶活性在室温条件下可以稳定数月时间，在低温条件下(如-20℃)可以稳定数年时间，因此有利于样本的保存、运输及生物素酶缺乏症的筛查。

本发明提供的试剂盒还可以用于分析和检测源自人体或动物的各类标本(包括各种体液、细胞或组织及其所制成的干片)中的生物素酶酶活力，如可用于血浆、血清、白细胞、培养细胞及其制备的干片等，适用标本范围广。

本发明提供的试剂盒中的底物为生物胞素(Biocytin，N-d-生物素基-L-赖氨酸)，其通用结构式如式Ⅰ：

它是生物素酶的天然底物，与其它底物相比，该底物具有更小的Km值，以天然底物生物胞素为反应底物时，酶活性较人工底物高30±5％，因此具有较高的检测灵敏度及更宽的检测限。

利用本发明试剂盒进行生物素酶酶活性检测的检测原理如下述反应方程式所示：

赖氨酸+衍生试剂→赖氨酸衍生物

样本中的生物素酶在适当的缓冲体系中能够水解生物胞素，生成赖氨酸，在合适的温度(4～60℃)下反应一段时间(0.5～48h)后，反应体系中加入终止液使反应终止，离心后取上清液，反应过程中生成的赖氨酸再与衍生化试剂反应生成荧光产物即赖氨酸衍生物，在特定的激发和发射波长下可检测到赖氨酸衍生物特异的荧光。由于生成的赖氨酸量与生成的荧光产物的荧光强度成正比，因此检测在特定激发波长和发射波长下的赖氨酸衍生物荧光值，扣除空白对照值后，通过以赖氨酸标准品与衍生试剂反应制备的标准曲线，就可以计算出反应中赖氨酸的生成量。

使用本发明提供的检测试剂盒进行检测时，无需对样本进行任何形式的前期处理，例如可直接用打孔器在干血片上取下直径3mm的小片加入反应体系中即可检测生物素酶活性，无需提取出生物素酶。而采用如血浆等其它标本时，也无需对标本进行透析、超滤、层析等纯化处理，可直接用于酶活力检测，方便快捷。

使用本发明提供的检测试剂盒进行检测时，可以获得干血片中生物素酶活性的定量结果，因此可以用于分析、检测和诊断生物素酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由生物素酶的酶活力异常或临床症状类似的各种遗传和代谢疾病，如生物素酶缺乏症，鉴别生物素缺乏症、羧化全酶合成酶缺乏症等。

总之，使用本发明提供的检测试剂盒进行检测，与Ebrahim等建立的方法(Ebrahim法)相比，具有如下优势：首先，利用本发明试剂盒进行检测时，可以干血片为检测样本，这使得本方法可应用于新生儿筛查，满足生物素酶缺乏症需及时诊治的要求，易于推广使用。其次，利用本发明试剂盒进行检测时对样本无需进行纯化提取等前处理，不仅扩大了检测样本范围，还降低了操作复杂性，Ebrahim法只能用于血清标本检测，且检测前必须进行透析处理；第三，酶活稳定性更好，本发明提供的反应体系中，生物素酶活性稳定时间超过24小时，而Ebrahim法为3小时；第四，减少了标本及试剂用量，降低了检测成本。

附图说明

图1为实施例1中制作的赖氨酸浓度与赖氨酸衍生物的荧光值之间的标准曲线。

图2为实施例3中干血片中生物素酶催化底物生物胞素水解生成赖氨酸量与反应时间的线性关系曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、生物素酶酶活性的检测试剂盒及应用

(1)检测生物素酶酶活性的试剂盒，包括如下组分：

试剂1：

(2)生物素酶酶活性的检测

1)样本的制备

样本为健康成人的血浆，用量为10μL。

2)样本的检测

向试剂1中加入血浆样本，血浆样本与试剂1的体积比1：19，加入样本和试剂后混合使之发生反应，于37℃反应24小时，反应结束后加入试剂2终止反应，试剂2与试剂1体积比为1：20。终止后样品管10000g离心10min，取上清液，加入试剂3，其中上清液与试剂3的比例为2：1，中和后(pH为9)再加入试剂4，其中上清液与试剂4的比例为1：1，衍生反应条件为30℃下反应30min。

衍生反应结束后用荧光检测设备检测体系在激发波长360nm(Ex＝360nm)以及发射波长460nm(Em＝460nm)下的荧光值。

上述测定设置3个重复，经计算健康成人干血滤纸片样品的荧光读值平均为2756。

3)空白对照荧光值的测定

对血浆样本进行灭活处理：将血浆样本放入沸水浴中煮沸5分钟。将试剂1中加入至灭活后的血浆样本中，血浆样本与试剂1的体积比1：18，样本和试剂后混合后，于37℃反应24小时，反应结束后加入向反应体系中加入试剂2终止反应，试剂2与反应体系的体积比为1：20。终止后样品管10000g离心10min，取上清液，加入试剂3，其中上清液与试剂3的比例为2：1，中和后(pH为9)再加入试剂4，其中上清液与试剂4的比例为1：1；检测该体系在激发波长360nm(Ex＝360nm)以及发射波长460nm(Em＝460nm)下的荧光值作为空白对照的荧光值。

上述测定设置3个重复，经计算空白对照的荧光读值平均为466。

4)标准曲线的绘制

取不同浓度赖氨酸标准品，其浓度分别为0、7.5、15、30、60、90、120、150μmol/L，分别与试剂4进行衍生反应，其中衍生反应的条件与步骤2)中相同；检测并记录衍生反应后的体系在激发波长360nm和发射波长460nm下的荧光值；以赖氨酸的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线，如图1所示。

根据所制作的标准曲线以及血浆样品的平均荧光值与空白对照的平均荧光值的差值，计算得出健康成人血液中生物素酶酶活性，为136.21±5.02(n＝3)，其中，酶活性的单位定义为：以每L样本每小时水解所述生物胞素生成的赖氨酸的微摩尔数，表示为μmol/L/h。

结果显示，样本的酶活力测定实验结果稳定(CV值小于5％，通过平行样间的差异比较得知)，说明本发明的检测生物素酶活力的方法可以有效检测出血浆样本中的生物素酶酶活力，方法简便，结果稳定可靠。

实施例2、生物素酶酶活性的检测

以经临床诊断和基因分析已确诊的生物素酶缺乏症的志愿者为分析对象，以健康志愿者为对照。

样本为干血滤纸片，与实施例1中相同。

检测方法与实施例1中相同，每个样本分别进行3次独立的酶活性测定实验，检测结果见表1所示。

表1健康成人与生物素酶缺乏症患者的酶活均值

由表1中的数据可知，健康成人样本酶活性为：102.65±9.17(n＝10)；生物素酶缺乏症患者的酶活力只有健康成人对照组的0.89％，这一结果与基因分析的结论相吻合。验证了本发明提供的试剂盒进行生物素酶酶活性的检测时，具有稳定性、特异性、可靠性，可应用于临床检测与生物素酶酶活力异常相关的疾病。

实施例3、生物素酶酶活性的检测

样本为干血滤纸片，与实施例1中相同。

检测方法与实施例1中相同，共设置6组反应，每组含2个样本和2个空白对照，并分别于4h、7h、16h、20h、24h和30h终止一组反应，然后进行衍生反应，并检测荧光值，考察反应过程中干血片中生物素酶的稳定性(如图2所示，线性方程为：y＝73.97x+66.64，R²＝0.998)。从图2中可以看出，在30h内，干血片中的生物素酶酶活性稳定，检测结果可靠。

由上述实施例可知，完全可以采用常规的荧光检测设备利用本发明的试剂盒进行生物素酶酶活性的检测，并且灵敏度高，特异性好，操作简便，便于推广应用于临床检测与生物素酶酶活力异常相关的疾病。

Claims (7)

1.一种检测生物素酶酶活性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4；

所述试剂1为由缓冲液1、酶活稳定剂和生物胞素组成的缓冲体系，所述试剂1的pH值为3～11；

所述试剂2为终止液；

所述试剂3为中和液；

所述试剂4为由缓冲液2和衍生底物组成的体系，所述衍生底物为1,2-二乙酰苯、茚三酮、荧光胺和邻苯二醛中任一种。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂1中，所述缓冲液1的摩尔浓度为50～500mmol/L，所述酶活稳定剂的摩尔浓度为1～50mmol/L，所述生物胞素的摩尔浓度为0.05～2mmol/L；

所述试剂2中，所述终止液的质量百分含量为30％～70％；

所述试剂3中，所述中和液的摩尔浓度为0.2～2mol/L；

所述试剂4中，所述缓冲液2的摩尔浓度为50～500mmol/L，所述衍生底物的质量百分含量为0.05％～5％。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液1和所述缓冲液2均选自下述缓冲试剂中至少一种：

a)乙酸钠-乙酸缓冲液，pH为2.6-5.8、b)甲酸钠-甲酸缓冲液，pH为2.0-5.0、c)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为3.0-6.6、d)磷酸氢盐-柠檬酸缓冲液，pH为2.2-8.0、e)磷酸氢盐-柠檬酸盐缓冲液，pH为2.2-8.0、f)磷酸盐缓冲液，pH为4.9-8.2、g)柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，pH为2.2-6.5、h)Tris-盐酸缓冲液，pH为7.1-8.9、i)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH为8.6-10.6和j)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH为9.16-10.83。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述酶活稳定剂为MgSO₄、MgCl₂、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白、甘油和二甲基亚砜中至少一种。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述终止液为高氯酸、盐酸、硫酸、硝酸和三氯乙酸中至少一种的水溶液；

所述中和液为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙中至少一种的水溶液。

6.权利要求1-5中任一项所述试剂盒在辅助诊断生物素酶缺乏症中的应用。

7.生物胞素在制备辅助诊断生物素酶缺乏症的检测试剂盒或检测生物素酶酶活性中的应用。