CN105445468A - 苯丙氨酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苯丙氨酸检测试剂盒，包括：琥珀酸溶液、茚三酮溶液、二肽溶液、铜试剂、校准品血片和质控品血片；其中，二肽溶液为L-亮氨酰-L-丙氨酸溶液。本发明的试剂盒能用于定量检测样本血片中苯丙氨酸的浓度，还具有准确、快速、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，特别是涉及一种苯丙氨酸检测试剂盒。
背景技术
苯丙氨酸是α-氨基酸的一种，具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)。苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一。L-苯丙氨酸在生物体内可被辅酶四氢生物喋呤不可逆地转化为L-酪氨酸(L-Tyrosine)，后继续分解，经转氨基生成少量苯丙酮酸，但先天性苯丙氨酸羟化酶缺陷患者，苯丙氨酸不能羟化生成酪氨酸，苯丙酮酸生成就增多，在血和尿中出现苯丙酮酸，导致智力发育障碍，称为苯丙酮尿症(PKU)。
从1961年美国Guthrie创立细菌抑制法测定干燥滤纸血片中苯丙氨酸浓度筛查苯丙酮尿症以来，有许多方法应用于检测血斑苯丙氨酸，据卫生部临床检验中心的统计，主要有细菌抑制法(BIA)、荧光法、酶/比色法、高效液相色谱法、串联质谱法、高效毛细管电泳、酶电极分析法等。目前，比较常用的是前两种方法，但细菌抑制法耗时长，仅能半定量。目前国内所采用荧光显色检测新生儿检测试剂盒全部靠国外进口产品，往往与特定检测仪器配套使用，而不能用于其它检测仪器，而且该试剂盒和所配套仪器设备价格昂贵，不利于新生儿筛查的普及，非一般的新生儿疾病筛查中心所能承担，同时，该进口试剂盒在液体配制中加有叠氮钠作为防腐剂，在实际操作中对人具有一定危险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种苯丙氨酸检测试剂盒。该试剂盒可应用于苯丙氨酸浓度的定量检测，包括新生儿血斑样本中的苯丙氨酸浓度的定量检测。
为解决上述技术问题，本发明的苯丙氨酸检测试剂盒，包括：琥珀酸溶液、茚三酮溶液、二肽溶液(L-亮氨酰-L-丙氨酸溶液)、铜试剂、校准品血片和质控品血片。
所述琥珀酸溶液是含有Proclin300的琥珀酸溶液，其中，Proclin300在琥珀酸溶液中的体积浓度优选为0.4％～0.6％，琥珀酸在琥珀酸溶液中的浓度优选为141g/L～142g/L(更优选1.2M)，琥珀酸溶液的pH优选为5.7～5.9。
所述琥珀酸溶液中，1L琥珀酸溶液的制备方法如下：
取琥珀酸141～142g，用配制总体积70％～80％的水溶解后，使用氢氧化钠(85～88g)调pH值至5.8±0.1，加入Proclin300，搅拌均匀后，用水定容至1L，获得琥珀酸溶液，其中，Proclin300的终体积浓度为0.4％～0.6％。
所述茚三酮溶液是含醋酸锂和二甲基亚砜的茚三酮溶液。其中，醋酸锂的浓度优选为81g/L～82g/L,二甲基亚砜的体积浓度优选为19.8％～20.2％，茚三酮的浓度优选为117mM～124mM(更优选为120mM)，茚三酮溶液的pH优选为5.7～5.9。
所述茚三酮溶液中，1L茚三酮溶液的制备方法如下：
1)取醋酸锂81～82g，用配制总体积50％～60％的水溶解后，用浓盐酸(2.4～2.5mL)调pH值至5.8±0.1，得醋酸锂溶液；
2)取水合茚三酮，用198～202mL二甲基亚砜溶解后，倒入上述1)制备的醋酸锂溶液中，混匀，用水定容至1L，得茚三酮溶液，其中，茚三酮的终浓度为117mM～124mM。
所述二肽溶液是L-亮氨酰-L-丙氨酸的琥珀酸溶液，其中，L-亮氨酰-L-丙氨酸的浓度优选为4g/L～4.1g/L(更优选为24mM)，具体制备方法如下：取L-亮氨酰-L-丙氨酸4～4.1g，用上述琥珀酸溶液溶解并定容至1L，得二肽溶液。
所述铜试剂是含有碳酸钠、酒石酸钾钠和硫酸铜的溶液，其中，碳酸钠的浓度为7.5g/L～8.5g/L，酒石酸钾钠的浓度为0.37g/L～0.41g/L，硫酸铜的浓度为0.28g/L～0.32g/L。
所述校准品血片和质控品血片的制备方法如下：
将小牛全血3000～4000转/min离心15～20分钟，去除部分血浆，调整血细胞压积至50％～55％，将处理后小牛全血分成8份，分别加入苯丙氨酸至终浓度为0、1.5、3、6、12、18、4和8mg/dL(浓度偏差控制在0.95～1.05范围内)【即0mg/dL、1.425～1.575mg/dL、2.85～3.15mg/dL、5.7～6.3mg/dL、11.4～12.6mg/dL、17.1～18.9mg/dL、3.8～4.2mg/dL和7.6～8.4mg/dL】，分别制备成校准品A、B、C、D、E、F和质控品C1、C2原液，按照50μL/斑，滴到滤纸片上，其中，A-F点于一张滤纸片上，每个浓度一个斑；C1和C2点于一张滤纸片上，每个浓度三个斑，点斑后滤纸片置于血斑干燥架上晾干过夜(16～24h)，放入装有干燥剂的铝箔自封袋里2～8℃贮存备用。所述滤纸片优选为Whatman公司生产的S&S903#滤纸片。
另外，所述苯丙氨酸检测试剂盒，还包括：96孔白色微孔板、96孔透明微孔板和封片纸。
再者，本发明还公开了利用上述试剂盒进行苯丙氨酸检测的方法，包括步骤：
(1)用打孔器在样本血片、上述校准品血片和质控品血片的血斑半径1/2处进行打孔，打下样本血斑片、校准品血斑片和质控品血斑片，依次放入96孔透明微孔板；
样本血片可为各种血片，如包括：临床新生儿血片样品或除了临床新生儿血片样品以外的血片(如各种血片参考物质)。
其中，临床新生儿血片样品应遵循卫生部新生儿疾病筛查血片采集技术规范采集并保存。
打孔器可采用商业化产品；另外，打孔中，孔的直径可为0.28～0.32mm(如约3mm)；
校准品和质控品血斑片采用复片；
(2)每孔加入体积浓度为75～85％的乙醇75～85μL，贴上封片纸，振荡20～30分钟；
(3)每孔中取出47～53μL(50±3μL)液体(乙醇洗脱液)转移到96孔白色微孔板中，再在转移后的液体中各加入47～53μL(50±3μL)反应混合液，贴上封片纸，振荡30～60s；
其中，反应混合液是将上述琥珀酸溶液、茚三酮溶液、二肽溶液以体积比为5：2：1的比例进行混合而得到的液体；
(4)在55～65℃(60±5℃)静置反应55～65(60±5)分钟或35～39(37±2)℃静置反应110～130(120±10)分钟；
(5)每孔中加入190～210μL(200±10μL)2～8℃的铜试剂，静置15～30分钟；
(6)用荧光分析仪进行测量，其中，荧光仪使用的激发波长390nm，发射波长486nm。
上述方法中，荧光分析仪检测的荧光值与校准品或样本中的苯丙氨酸浓度呈正相关，通过校准曲线即可得出样本中的苯丙氨酸浓度。其中，质控品检测浓度应在给定的靶值范围内，用以保证检测结果的有效性。若检测结果大于1.77mg/dL，为“可疑阳性”，原斑需复查，若复查结果仍高于1.77mg/dL，采集新的血斑，进行确认检验。
本发明的检测原理如下：
在琥珀酸溶液中，从干滤纸血片上提取的苯丙氨酸与茚三酮反应生成荧光产物，二肽(L-亮氨酰-L-丙氨酸)能增强此荧光反应，加入铜试剂稳定荧光复合物并终止反应，荧光仪检测的荧光值与校准品或样品中的苯丙氨酸浓度呈正相关，通过校准曲线，即可得出样品中的苯丙氨酸浓度。
本发明的检测中，校准品使用后，可将剩余的校准品血斑和干燥剂一同放回铝箔自封袋内2～8℃密封保存；另外，检测结束后，检查是否有黄色或紫色板孔，如有，则需对这些样本进行复测。
本发明的有益效果如下：
1、能用于定量检测样本血片中苯丙氨酸的浓度，特别是能用于定量检测采集于血样收集纸上的新生儿全血样品中苯丙氨酸的浓度，适用于新生儿苯丙酮尿症(PKU)的筛查，克服细菌抑制法半定量、不易自动化和易受抗生素干扰的缺点；
2、在保持琥珀酸溶液防腐这个环节中，使用无毒的ProClin300替换以往使用的叠氮钠(NaN3)防腐，能较长时间保存该琥珀酸溶液，避免造成人体、环境的危害，同时，避免了试剂在运输过程中的危险隐患。
3、该试剂盒还具有准确、快速、成本低等优点。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是整体试剂盒外观图；
图2是试剂盒俯视图；
图3是96孔透明微孔板；
图4是96孔白色微孔板；
图5是试剂溶液承载瓶；
图6是校准品血斑和质控品血斑；
图7是校准品苯丙氨酸浓度与相应的荧光值数据的标准曲线。
附图标记说明如下：
1为96孔透明微孔板，2为96孔白色微孔板，3为琥珀酸溶液，4为茚三酮溶液，5为二肽溶液，6为铜试剂，7为校准品血片，8为质控品血片，9为封片纸，10为外包装盒。
具体实施方式
以下实施例中涉及的试剂，如未特别说明，则为商业化产品。
实施例1试剂盒的制备
本发明的苯丙氨酸检测试剂盒，设有琥珀酸溶液3、茚三酮溶液4、二肽溶液(L-亮氨酰-L-丙氨酸溶液)5、铜试剂6、校准品血片7和质控品血片8。
其中，试剂盒中的各组分的配制方法如下：
一)琥珀酸溶液3的配制(1L)
用分析天平准确称取141g琥珀酸，放入适量的烧杯中，加入配制总体积的70％的纯化水进行溶解，使用氢氧化钠粉末调pH值至5.7，加入Proclin300，搅拌均匀后，用纯化水定容至1L，获得琥珀酸溶液，其中，Proclin300的终体积浓度为0.6％。
将配制好的琥珀酸溶液3按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
二)茚三酮溶液4的配制(1L)
1)用分析天平准确称量醋酸锂81g，用配制总体积50％(500mL)的纯化水溶解后，用浓盐酸调pH值至5.7，得醋酸锂溶液；
2)用分析天平准确称量所需的水合茚三酮，用198mL二甲基亚砜溶解后，倒入上述1)制备的醋酸锂溶液中，混匀，用纯化水定容至1L，得茚三酮溶液，其中，茚三酮的终浓度为117mM。
将配制好的茚三溶液4按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
三)二肽溶液5的配制(1L)
取L-亮氨酰-L-丙氨酸4g，用上述琥珀酸溶液3溶解并定容至1L，得二肽溶液。
将配制好的二肽溶液5按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
四)铜试剂6的配制(1L)
(1)溶解碳酸钠
用分析天平称取7.5g碳酸钠，放入适量烧杯，加200mL纯化水，完全溶解，得到碳酸钠溶液；
(2)溶解酒石酸钾钠
用分析天平称取0.37g酒石酸钾钠，放入适量烧杯，加200mL纯化水，完全溶解，得到酒石酸钾钠溶液；
(3)溶解硫酸铜
用分析天平称取0.28g硫酸铜，放入适量烧杯，加200mL蒸馏水，完全溶解，得到硫酸铜溶液；
(4)铜试剂的配制
将配好的三个备用溶液按顺序即碳酸钠溶液、酒石酸钾钠溶液、硫酸铜溶液(或硫酸铜溶液、酒石酸钾钠溶液、碳酸钠溶液)分别加入容量瓶，混匀后，用纯化水定容至1L。
将配制好的铜试剂6按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放在2～8℃冰箱保存备用。
五)校准品血片7和质控品血片8的制备
将小牛全血3000转/min离心15分钟，去除部分血浆，调整血细胞压积至50％，将处理后小牛全血分成8份，分别加入苯丙氨酸至终浓度为至终浓度为0、1.425、2.85、5.7、11.4、17.1、3.8和7.6mg/dL，分别制备成校准品A、B、C、D、E、F和质控品C1、C2原液，按照50μL/斑，滴到Whatman公司生产的S&S903#滤纸片上，其中，A-F点于一张滤纸片上，每个浓度一个斑；C1和C2点于一张滤纸片上，每个浓度三个斑，点斑后滤纸片置于血斑干燥架上晾干过夜(16～24h)，放入装有干燥剂的铝箔自封袋里2～8℃贮存备用。
本实施例中的试剂盒可置于2～8℃保存，并可用于新生儿血斑样本中的苯丙氨酸浓度的定量检测。
实施例2试剂盒的制备
本发明的苯丙氨酸检测试剂盒，设有琥珀酸溶液3、茚三酮溶液4、二肽溶液(L-亮氨酰-L-丙氨酸溶液)5、铜试剂6、校准品血片7和质控品血片8。
其中，试剂盒中的各组分的配制方法如下：
一)琥珀酸溶液3的配制(1L)
用分析天平准确称取142g琥珀酸，放入适量的烧杯中，加入配制总体积的80％的纯化水进行溶解，使用氢氧化钠粉末调pH值至5.8，加入Proclin300，搅拌均匀后，用纯化水定容至1L，获得琥珀酸溶液，其中，Proclin300的终体积浓度为0.4％。
将配制好的琥珀酸溶液3按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
二)茚三酮溶液4的配制(1L)
1)用分析天平准确称量醋酸锂82g，用配制总体积60％(600mL)的纯化水溶解后，用浓盐酸调pH值至5.8，得醋酸锂溶液；
2)用分析天平准确称量所需的水合茚三酮，用202mL二甲基亚砜溶解后，倒入上述1)制备的醋酸锂溶液中，混匀，用纯化水定容至1L，得茚三酮溶液，其中，茚三酮的终浓度为124mM。
将配制好的茚三溶液4按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
三)二肽溶液5的配制(1L)
取L-亮氨酰-L-丙氨酸4.1g，用上述琥珀酸溶液3溶解并定容至1L，得二肽溶液。
将配制好的二肽溶液5按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
四)铜试剂6的配制(1L)
(1)溶解碳酸钠
用分析天平称取8.5g碳酸钠，放入适量烧杯，加250mL纯化水，完全溶解，得到碳酸钠溶液；
(2)溶解酒石酸钾钠
用分析天平称取0.41g酒石酸钾钠，放入适量烧杯，加250mL纯化水，完全溶解，得到酒石酸钾钠溶液；
(3)溶解硫酸铜
用分析天平称取0.32g硫酸铜，放入适量烧杯，加250mL蒸馏水，完全溶解，得到硫酸铜溶液；
(4)铜试剂的配制
将配好的三个备用溶液按顺序即碳酸钠溶液、酒石酸钾钠溶液、硫酸铜溶液(或硫酸铜溶液、酒石酸钾钠溶液、碳酸钠溶液)分别加入容量瓶，混匀后，用纯化水定容至1L。
将配制好的铜试剂6按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放在2～8℃冰箱保存备用。
五)校准品血片7和质控品血片8的制备
将小牛全血4000转/min离心20分钟，去除部分血浆，调整血细胞压积至55％，将处理后小牛全血分成8份，分别加入苯丙氨酸至终浓度为至终浓度为0、1.575、3.15、6.3、12.6、18.9、4.2和8.4mg/dL，分别制备成校准品A、B、C、D、E、F和质控品C1、C2原液，按照50μL/斑，滴到Whatman公司生产的S&S903#滤纸片上，其中，A-F点于一张滤纸片上，每个浓度一个斑；C1和C2点于一张滤纸片上，每个浓度三个斑，点斑后滤纸片置于血斑干燥架上晾干过夜(16～24h)，放入装有干燥剂的铝箔自封袋里2～8℃贮存备用。
另外，上述试剂盒，还可设有：96孔白色微孔板2、96孔透明微孔板1和封片纸9。
本实施例中的试剂盒可置于2～8℃保存，并可用于新生儿血斑样本中的苯丙氨酸浓度的定量检测。
实施例3试剂盒的制备
本发明的苯丙氨酸检测试剂盒，设有琥珀酸溶液3、茚三酮溶液4、二肽溶液(L-亮氨酰-L-丙氨酸溶液)5、铜试剂6、校准品血片7和质控品血片8。
其中，试剂盒中的各组分的配制方法如下：
一)琥珀酸溶液3的配制(1L)
用分析天平准确称取141.5g琥珀酸，放入适量的烧杯中，加入配制总体积的75％的纯化水进行溶解，使用氢氧化钠粉末调pH值至5.9，加入Proclin300，搅拌均匀后，用纯化水定容至1L，获得琥珀酸溶液，其中，Proclin300的终体积浓度为0.5％。
将配制好的琥珀酸溶液3按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
二)茚三酮溶液4的配制(1L)
1)用分析天平准确称量醋酸锂81.5g，用配制总体积55％(550mL)的纯化水溶解后，用浓盐酸调pH值至5.9，得醋酸锂溶液；
2)用分析天平准确称量所需的水合茚三酮，用200mL二甲基亚砜溶解后，倒入上述1)制备的醋酸锂溶液中，混匀，用纯化水定容至1L，得茚三酮溶液，其中，茚三酮的终浓度为120mM。
将配制好的茚三溶液4按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
三)二肽溶液5的配制(1L)
取L-亮氨酰-L-丙氨酸4.05g，用上述琥珀酸溶液3溶解并定容至1L，得二肽溶液。
将配制好的二肽溶液5按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放入2～8℃冰箱保存备用。
四)铜试剂6的配制(1L)
(1)溶解碳酸钠
用分析天平称取8g碳酸钠，放入适量烧杯，加220mL纯化水，完全溶解，得到碳酸钠溶液；
(2)溶解酒石酸钾钠
用分析天平称取0.40g酒石酸钾钠，放入适量烧杯，加230mL纯化水，完全溶解，得到酒石酸钾钠溶液；
(3)溶解硫酸铜
用分析天平称取0.30g硫酸铜，放入适量烧杯，加240mL蒸馏水，完全溶解，得到硫酸铜溶液；
(4)铜试剂的配制
将配好的三个备用溶液按顺序即碳酸钠溶液、酒石酸钾钠溶液、硫酸铜溶液(或硫酸铜溶液、酒石酸钾钠溶液、碳酸钠溶液)分别加入容量瓶，混匀后，用纯化水定容至1L。
将配制好的铜试剂6按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放在2～8℃冰箱保存备用。
五)校准品血片7和质控品血片8的制备
将小牛全血3500转/min离心17分钟，去除部分血浆，调整血细胞压积至55％，将处理后小牛全血分成8份，分别加入苯丙氨酸至终浓度为至终浓度为0、1.5、3、6、12、18、4和8mg/dL，制备成校准品A、B、C、D、E、F和质控品C1、C2原液，按照50μL/斑，滴到Whatman公司生产的S&S903#滤纸片上，其中，A-F点于一张滤纸片上，每个浓度一个斑；C1和C2点于一张滤纸片上，每个浓度三个斑，点斑后滤纸片置于血斑干燥架上晾干过夜(16～24h)，放入装有干燥剂的铝箔自封袋里2～8℃贮存备用。
另外，上述试剂盒，还可设有：96孔白色微孔板2、96孔透明微孔板1和封片纸9。
再者，上述试剂盒还可设有外包装盒10。
本实施例中的试剂盒可置于2～8℃保存，并可用于新生儿血斑样本中的苯丙氨酸浓度的定量检测。
实施例4采用试剂盒定量检测新生儿全血样品中的苯丙氨酸浓度
采用上述试剂盒(实施例3制备的试剂盒)进行定量检测采集于血样收集纸上的新生儿全血样品中苯丙氨酸的浓度的方法，其步骤如下：
1.试剂准备
(1)将琥珀酸溶液3、茚三酮溶液4、二肽溶液5、校准品血片7、质控品血片8、待测样本(样本血片)、96孔白色微孔板2和96孔透明微孔板1平衡至室温(20℃～25℃)；
待测样本为44份筛查中心使用WallacPKU试剂盒检测后的临床血片(采集于Whatman公司生产的S&S903#滤纸上的新生儿全血样品)。
临床血片样品遵循卫生部新生儿疾病筛查血片采集技术规范采集并保存。要点如下：
酒精棉签清洗局部皮肤后，风干。用消毒后的采血刀或足跟刺血装置刺入婴儿足跟部，入皮深度以1-2mm为宜。擦去流出的第一滴血，轻轻将滤纸贴附于随后流出的大滴血上，使得足量的血浸透浸满滤纸上预先已经印好的圆圈。将血标本水平放置于室温下至少3小时，使之风干。避免阳光直射。风干过程中不要加热或将标本堆积。
(2)铜试剂6放置在2-8℃冰箱内预冷；
(3)80％乙醇溶液配制：无水乙醇与纯化水按4：1(V/V)比例混合；
(4)反应混合液配制：将琥珀酸溶液3、茚三酮溶液4、二肽溶液5以体积比为5：2：1的比例混合，建议使用前1小时内配制并一次用完。
2.用商业化的打孔器在在样本血片、上述校准品血片和质控品血片的血斑半径1/2处进行打孔，打下直径约3mm的样本血斑片、校准品血斑片(复孔)和质控品血斑片，依次放入96孔透明微孔板。
3.每孔加入80％的酒精80μL，贴上封片纸9，室温(20℃～25℃)下慢档振荡30分钟。
4.每孔中取出50μL液体(乙醇洗脱液)转移到96孔白色微孔板2中，再在转移后的液体中各加入50μL上述配制好的反应混合液，贴上封片纸9，慢档振荡1分钟。
5.60℃静置反应60分钟或37℃静置反应120分钟。
6.每孔中加入200μL预冷(2-8℃)的铜试剂，静置15分钟。
7.用新波生物生产的AnytestII荧光分析仪测量。其中，荧光仪使用的激发波长390nm，发射波长486nm。
结果显示：
校准品苯丙氨酸浓度与相应的荧光值数据如表1所示，根据表1结果绘制标准曲线(如图7所示)，标准曲线方程为y＝1045.8x+1882.2，相关系数r＝0.9996；
表1校准品苯丙氨酸浓度与相应的荧光值数据
质控品C1和C2的检测结果及靶值范围如表2所示，由结果可见，本发明试剂盒质控品测量值在靶值范围内，实验结果在允许的误差范围内。
表2本发明试剂盒质控品的检测数据
| 质控品 | 靶值范围(mg/dL) | 测量值(mg/dL) | 偏倚(％) |
| C1 | 3.45～4.77 | 4.43 | 7.8 |
| C2 | 6.10～8.46 | 8.09 | 11.1 |
另外，比较本发明试剂盒与目前临床上应用较多的WallacPKU试剂盒的检测结果，其中，上述44份筛查中心使用WallacPKU试剂盒检测后的临床血片(采集于Whatman公司生产的S&S903#滤纸上的新生儿全血样品)的检测结果见表3。检测结果的阴、阳性符合率均为100％，相关系数为0.97，表明检测结果间具有良好的一致性。
表3本发明试剂盒检测临床样品结果与WallacPKU试剂盒检测结果对比
Claims (10)
1.一种苯丙氨酸检测试剂盒，其特征在于，包括：琥珀酸溶液、茚三酮溶液、二肽溶液、铜试剂、校准品血片和质控品血片；
其中，二肽溶液为L-亮氨酰-L-丙氨酸溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述琥珀酸溶液是含有Proclin300的琥珀酸溶液，其中，Proclin300在琥珀酸溶液中的体积浓度为0.4％～0.6％，琥珀酸在琥珀酸溶液中的浓度为141g/L～142g/L，琥珀酸溶液的pH为5.7～5.9；
所述琥珀酸溶液中，1L琥珀酸溶液的制备方法如下：
取琥珀酸141～142g，用配制总体积70％～80％的水溶解后，使用氢氧化钠调pH值至5.8±0.1，加入Proclin300，搅拌均匀后，用水定容至1L，获得琥珀酸溶液，其中，Proclin300的终体积浓度为0.4％～0.6％。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述茚三酮溶液是含醋酸锂和二甲基亚砜的茚三酮溶液；其中，醋酸锂的浓度为81g/L～82g/L，二甲基亚砜的体积浓度为19.8％～20.2％，茚三酮的浓度为117mM～124mM，茚三酮溶液的pH为5.7～5.9；
所述茚三酮溶液中，1L茚三酮溶液的制备方法如下：
1)取醋酸锂81～82g，用配制总体积50％～60％的水溶解后，用浓盐酸调pH值至5.8±0.1，得醋酸锂溶液；
2)取水合茚三酮，用198～202mL二甲基亚砜溶解后，倒入上述1)制备的醋酸锂溶液中，混匀，用水定容至1L，得茚三酮溶液，其中，茚三酮的终浓度为117mM～124mM。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述二肽溶液中，L-亮氨酰-L-丙氨酸的浓度为4g/L～4.1g/L；
其中，制备方法如下：
取L-亮氨酰-L-丙氨酸4～4.1g，用所述琥珀酸溶液溶解并定容至1L，得二肽溶液。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述铜试剂是含有碳酸钠、酒石酸钾钠和硫酸铜的溶液，其中，碳酸钠的浓度为7.5g/L～8.5g/L，酒石酸钾钠的浓度为0.37g/L～0.41g/L，硫酸铜的浓度为0.28g/L～0.32g/L。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品血片和质控品血片的制备方法如下：
将小牛全血3000～4000转/min离心15～20分钟，调整血细胞压积至50％～55％，将处理后小牛全血分成8份，分别加入苯丙氨酸至终浓度为0mg/dL、1.425～1.575mg/dL、2.85～3.15mg/dL、5.7～6.3mg/dL、11.4～12.6mg/dL、17.1～18.9mg/dL、3.8～4.2mg/dL和7.6～8.4mg/dL，分别制备成校准品A、B、C、D、E、F和质控品C1、C2原液，按照50μL/斑，滴到滤纸片上，其中，A-F点于一张滤纸片上，每个浓度一个斑；C1和C2点于一张滤纸片上，每个浓度三个斑，点斑后滤纸片置于血斑干燥架上晾干过夜，放入装有干燥剂的铝箔自封袋里2～8℃贮存备用。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述滤纸片为Whatman公司生产的S&S903#滤纸片。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述苯丙氨酸检测试剂盒还包括：96孔白色微孔板、96孔透明微孔板和封片纸。
9.一种利用权利要求1所述的试剂盒进行苯丙氨酸检测的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)用打孔器在样本血片、校准品血片和质控品血片的血斑半径1/2处进行打孔，打下样本血斑片、校准品血斑片和质控品血斑片，依次放入96孔透明微孔板；
(2)每孔加入体积浓度为75～85％的乙醇75～85μL，贴上封片纸，振荡20～30分钟；
(3)每孔中取出47～53μL液体转移到96孔白色微孔板中，再在转移后的液体中各加入47～53μL反应混合液，贴上封片纸，振荡30～60s；
其中，反应混合液是将琥珀酸溶液、茚三酮溶液、二肽溶液以体积比为5：2：1的比例进行混合而得到的液体；
(4)在55～65℃静置反应55～65分钟或在35～39℃静置反应110～130分钟；
(5)每孔中加入190～210μL2～8℃的铜试剂，静置15～30分钟；
(6)用荧光分析仪进行测量，其中，荧光仪使用的激发波长390nm，发射波长486nm。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，样本血片包括：临床新生儿血片样品或除了临床新生儿血片样品以外的血片；打孔中，孔的直径为0.28～0.32mm；校准品和质控品血斑片采用复片；
所述方法中，荧光分析仪检测的荧光值与校准品或样本中的苯丙氨酸浓度呈正相关，通过校准曲线即可得出样本中的苯丙氨酸浓度。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106841427A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-13 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测pku和cah的串联质谱试剂盒制备及其应用 |
| CN107014934A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-08-04 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 尿液有机酸滤纸片质控品及其制备方法 |
| CN109060972A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-12-21 | 苏州药明泽康生物科技有限公司 | 兔血在制备人疾病体外诊断试剂盒中的应用 |
| CN112213304A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-12 | 深圳市宸果材料科技有限公司 | 一种基于显色比对的尿筛癌症试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN2828803Y (zh) * | 2005-08-27 | 2006-10-18 | 张静 | 一种定量检测滤纸干血片中苯丙氨酸浓度的试剂盒 |
| CN101887060A (zh) * | 2009-05-13 | 2010-11-17 | 北京协和洛克生物技术研究开发中心 | 一种利用荧光显色定量检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的试剂盒 |
| EP2427773A1 (en) * | 2009-05-05 | 2012-03-14 | Matthias Keller | Method of diagnosing asphyxia |
-
2014
- 2014-08-19 CN CN201410407784.XA patent/CN105445468A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN2828803Y (zh) * | 2005-08-27 | 2006-10-18 | 张静 | 一种定量检测滤纸干血片中苯丙氨酸浓度的试剂盒 |
| EP2427773A1 (en) * | 2009-05-05 | 2012-03-14 | Matthias Keller | Method of diagnosing asphyxia |
| CN101887060A (zh) * | 2009-05-13 | 2010-11-17 | 北京协和洛克生物技术研究开发中心 | 一种利用荧光显色定量检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 生命科学仪器编辑部: "PROCLIN系列防腐剂", 《生命科学仪器》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106841427A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-13 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测pku和cah的串联质谱试剂盒制备及其应用 |
| CN106841427B (zh) * | 2016-12-30 | 2019-05-14 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测pku和cah的串联质谱试剂盒 |
| CN107014934A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-08-04 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 尿液有机酸滤纸片质控品及其制备方法 |
| CN107014934B (zh) * | 2017-04-14 | 2020-12-08 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 尿液有机酸滤纸片质控品及其制备方法 |
| CN109060972A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-12-21 | 苏州药明泽康生物科技有限公司 | 兔血在制备人疾病体外诊断试剂盒中的应用 |
| CN109060972B (zh) * | 2018-05-16 | 2021-09-24 | 苏州药明泽康生物科技有限公司 | 兔血在制备人疾病体外诊断试剂盒中的应用 |
| CN112213304A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-12 | 深圳市宸果材料科技有限公司 | 一种基于显色比对的尿筛癌症试剂盒 |
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