CN114324647B

CN114324647B - 一种同时测定奶粉中维生素k1和k2的方法与应用

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Publication number: CN114324647B
Application number: CN202111609063.3A
Authority: CN
Inventors: 蔡伟谊; 黄景初; 王宇; 陈悦铭; 陈嘉欣; 苏燕瑜; 刘佳; 钱振杰; 何淑明
Original assignee: Guangzhou Food Inspection Center (guangzhou Liquor Testing Center)
Current assignee: Guangzhou Food Inspection Center (guangzhou Liquor Testing Center)
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114324647A

Abstract

本发明提供一种同时测定奶粉中维生素K₁和K₂的方法与应用，包括：1)样品前处理：称取适量混合均匀的奶粉样品，加入水、脂肪酶恒温进行脂肪水解；加入异丙醇与KOH水溶液(或磷酸)进行定容；2)在线固相萃取‑液相色谱联用，分析酶解液中维生素K₁与K₂的含量。本发明简化了样品前处理操作步骤，溶剂消耗少，大幅缩短了前处理时间，节省了人力，实现了自动在线净化检测，提高了灵敏度，保证了测试结果的准确性和稳定性。本发明可用于食品、药品维生素的检测。

Description

一种同时测定奶粉中维生素K1和K2的方法与应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种同时测定奶粉中维生素K₁和K₂的方法与应用。

背景技术

维生素是参与调节人体代谢过程的重要化合物，其中维生素K除参与凝血及抗凝血外，还参与了骨代谢调节、细胞的生长和增殖氧化应激反应、炎症反应等生理病理过程。维生素 K有K₁、K₂、K₃、K₄等几种形式，其中K₁是从绿色植物中提取得到、K₂是由肠道细菌合成得到，K₁和K₂是天然脂溶性维生素，而K₃和K₄则是通过人工合成的水溶性的维生素。维生素K₁是血液凝固的关键因素，而维生素K₂具有参与骨骼的形成、抗骨质疏松和抗动脉钙化、抗风湿性关节炎、预防老年痴呆、预防肝硬化、预防癌症的生理功能。维生素K₂又分为不同的亚型，其中n烯甲萘醌(MK-n)，包括四烯甲萘醌(MK-4)、七烯甲萘醌(MK-7)、九烯甲萘醌(MK-9)是常见的类型。维生素K摄入量不足会引起凝血异常、骨形成不全、骨质疏松和影响细胞信号转导肾功能不全等。维生素K摄入过多，则会引起饱腹感、胃灼热、胃疼、腹痛、腹泻、恶心等。

维生素K₁得使用方式主要为作为添加剂添加到食物中，以补充维生素K的不足。但是，维生素K₁的生物利用率较低，因此必须将其转化为维生素K₂才能被人体利用。维生素K₁作为广泛应用的营养强化成分，其加入量有严格的要求。在2016年公布的中国卫计委发布的《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告(2016年第8号)》中将维生素K₂列入了食品营养强化剂新品种。因此，维生素K₂的加入量也就此受到严格的控制，但目前还没有针对维生素K₂的检测方法标准，也没有对婴幼儿食品中维生素K₂加入量的相应国家检测标准和限量做出规定。

如果婴幼儿配方奶粉中维生素K₂的添加量不受限制，且包装标识中也没有明确区分维生素K₁与维生素K₂的细分含量，则可能导致婴幼儿配方奶粉中实际营养功效与包装标识值存在较大差异，甚至还会带来潜在的产品质量安全风险。

由于奶粉中含有较多的脂肪与蛋白，前处理中往往需要进行酶解、液液萃取、吹干复溶等复杂前处理操作，人为操作引入误差较大，基质干扰严重，结果稳定性与准确度不够理想。目前关于同时测定维生素K₁与K₂的研究方法和有关文献相对较少。维生素K₁的检测技术比较成熟，大多数是用国家标准方法-高效液相色谱-荧光法，但是建立单一目标物的检测方法，检测筛查通量低；随着维生素K₂作为食品营养强化剂使用的安全性得到认定，因此需要建立能够同时测定维生素K₁与K₂的方法。目前，部分文献作者尝试使用高效液相色谱-荧光法检测维生素K₁与K₂，但仍存在不少的问题：(1)目前鲜有学者研究婴幼儿配方奶粉中维生素K₂的加入情况；(2)现有方法的前处理中，样品加入的固体脂肪酶溶解不充分，容易造成维生素K₁与K₂的测定值偏低，而加入乙醇与碳酸钾固体，则容易导致其溶解时出现放热现象，对维生素K₁的稳定性造成影响。(3)维生素K₁、维生素K₂(四烯甲萘醌(MK- 4)、七烯甲萘醌(MK-7)、九烯甲萘醌(MK-9))同时测定前处理耗时太长，其中包括酶解、萃取、浓缩、复溶等步骤，涉及多次的萃取和蒸发溶解，操作繁琐费时，容易造成待测组分的损失，导致测定结果偏低，大大影响样品的分析效率；(4)现有方法的前处理中，除杂不完全，容易干扰维生素K₂的测定。(5)样品在复溶时容易带入水分，水分容易破坏锌粉还原柱；(6)现阶段荧光法测定维生素K所用的流动相体系容易发生盐析反应，无法采用梯度洗脱进行维生素K的线上快速检测分析；(7)液相色谱-荧光法检测时，MK-9出峰时间较晚，液相检测耗时长。因此，为了更加合理评价奶粉营养功效，加强市场监管，为规范维生素 K₂的添加提供实用的检测手段和科学的检测依据，急需开发一种简便、快速、稳定的，能同时检测维生素K₁、K₂的方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一方面提出一种同时测定奶粉中维生素K₁和K₂的方法，能够简便、快速、稳定地同时检测奶粉中的维生素K₁、K₂，可以更加合理评价奶粉营养功效。

本发明第二方面提出一种上述测定维生素K₁和K₂的方法在食品、药品检测中的应用。

根据本发明的第一个方面，提供一种同时测定奶粉中维生素K₁和K₂的方法，包括如下步骤：

S1：采用酶解法处理待测奶粉，得到进样溶液；

S2：采用在线固相萃取法对S1中所述进样溶液中的维生素K₁和K₂进行提取，经液相色谱法检测，得到液相色谱数据；

S3：根据维生素K₁和K₂的液相色谱标准工作曲线，得到待测奶粉中维生素K₁和K₂的含量。

在本发明的一些实施方式中，上述S1包括：在奶粉样品中加入脂肪酶得到混合溶液，进行恒温酶解后加入蛋白质变性剂定容，取定容后的溶液过有机滤膜，得到进样溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酶的浓度为0.05g/mL～0.5g/mL。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述脂肪酶的浓度为0.10g/mL～0.20g/mL。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述脂肪酶的浓度为0.13g/mL～0.16g/mL。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述奶粉样品中若含有淀粉，则在加入脂肪酶的同时加入淀粉酶。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述恒温的温度为30℃～40℃，所述酶解的时间为2h～3h。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述蛋白质变性剂为异丙醇和强碱或异丙醇和强酸。

酶解液分子结构较小，支链短，其存在大量氨基酸等小分子物质，因此若只单纯加酸或加碱，难以实现其沉淀，影响最后的维生素K的测定，可添加有机溶剂和酸或有机溶剂和碱使其变性从而沉淀，而经测试证明，加入异丙醇时方法的回收率较高。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述强碱选自KOH、NaOH中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述强碱选自氢氧化钾KOH。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述进样溶液中强碱的浓度为0.2mol/L～0.3 mol/L。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述进样溶液中强碱的浓度为0.15mol/L～0.35 mol/L；

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述强酸为H₃PO₄。

磷酸与其他酸相比，强氧化性、还原性与挥发性较弱，是一种相对比较安全的酸。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述进样溶液中强酸溶液浓度为0.5mol/L～1.2 mol/L；

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述进样溶液中强酸溶液浓度为0.6mol/L～1.0 mol/L；

在本发明的一些更优选的实施方式中，S1包括：称取奶粉样品量为1g，加入10mL水、 3mL的0.13g/mL脂肪酶水溶液，涡旋混合3min，置于37±2℃恒温水浴震荡2h～3h进行酶解；向酶解后的混合溶液中加入10mL异丙醇、1mL5.0mol/L的氢氧化钾(或1.2mL14.65mol/L的磷酸)水溶液后，用体积分数为50％的异丙醇水溶液定容至25mL，取2 mL过0.45μm有机滤膜，得进样溶液，待上机分析。

采用酶解液直接定容后上机分析，可以避免现有方法前处理中，样品加入固体脂肪酶时脂肪酶溶解不充分，造成维生素K₁与K₂的值偏低的问题以及加入乙醇与碳酸钾固体导致其溶解时放热影响维生素K₁与K₂的稳定性的问题。同时可以简化样品前处理过程，提高样品的分析效率，确保测试结果的准确性和再现性。

用在线固相萃取法替代液液萃取，可以消除在萃取时脂肪酶等蛋白质的乳化现象。在线固相萃取-液相色谱联用，可以避免酶解液直接上样时水分对锌粉还原柱损坏的问题，改善维生素K通过在线固相萃取柱转移至分析柱时容易出现峰扩散与峰拖尾的问题。

在本发明的一些更优选的实施方式中，S2中所述在线固相萃取部分的运行条件如下：

色谱柱：PLRP-S柱；

流动相：甲醇、甲醇-水溶液、甲醇-乙腈混合溶液；

流动相比例与流速：0min～2min，V_甲醇:V_水＝2：8，υ＝1.2mL/min；

2.10min～6.00min，甲醇，υ＝1.5mL/min；

6.10min～14min，V_乙腈:V_甲醇＝1：1，υ＝1mL/min；

14.10min～35min，V_甲醇:V_水＝2：8，υ＝1mL/min；

进样体积：50μL；

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述PLRP-S柱的规格为4.6mm×125mm，孔径15μm～20μm。

PLRP-S柱可以耐受强酸与强碱，所以酶解液的pH值对其影响不大，上样前无需再调成中性，简化前处理，节约时间。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述在线固相萃取的运行时间为35min。

在本发明的一些更优选的实施方式中，S2中所述液相色谱的运行条件如下：

色谱柱：C₁₈柱，锌粉还原柱；

流动相：A，所述A为含有四氢呋喃的甲醇溶液；

流动相比例与流速：

0min～8min，体积分数为10％的A，υ＝0.6mL/min；

8.10min～13min，体积分数为10％的A，υ＝0.8mL/min；

13min～20min，(V_{体积分数为20％的A}：V_{体积分数为10％的A}＝80:20)，υ＝0.8mL/min；

21min～30min，(V_{体积分数为20％的A}：V_{体积分数为10％的A}＝85:15)，υ＝0.8mL/min；

31min～35min，体积分数为10％的A，υ＝0.6mL/min；

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述C₁₈柱的规格为4.6mm×150mm，粒径5 μm。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述锌粉还原柱的规格为4.6mm×50mm，平均粒径70μm。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述液相色谱的运行时间为35min。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述液相色谱采用荧光检测器检测，所述荧光检测器的激发波长为230nm～240nm，发射波长为425nm～435nm。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述荧光检测器的激发波长为234nm，发射波长为432nm。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述S2中，经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物维生素K₁与K₂。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述S2中，若确认样品中含有维生素K₁和K₂，则采用标准曲线外标法进行定量，再根据进样溶液中维生素K₁与K₂的含量计算整个奶粉样品中维生素K₁与K₂的含量。

根据本发明的第二个方面，提出一种上述测定维生素K₁和K₂的方法在食品、药品检测中的应用。

本发明的有益效果为：

1.本发明建立了一种同时检测奶粉中维生素K₁和K₂的方法，简化了操作步骤，消耗溶剂少，大大缩短了前处理的时间，节省了人力，实现了自动在线净化检测，提高了灵敏度，保证了测试结果的准确性和再现性，从而指导食品企业生产调节，从源头防止维生素强化剂量不准给消费者健康带来的不利影响。

2.本发明解决了酶解液直接上样时，水分对锌粉还原柱损坏的问题，改善了维生素K通过在线固相萃取柱转移至分析柱时，容易出现峰扩散与峰拖尾的问题。

3.本发明采用特殊的填料和规格的色谱柱，建立了直接分析强碱(强酸)性样品溶液的高效液相色谱方法。

4.本发明在目标物富集在净化柱后，采用反向洗脱的方式，将目标物转移至分析柱中，获得的色谱峰，峰宽适中，对称性好。

5.本发明的方法检测灵敏，其中维生素K₁检出限为0.12μg/100g；MK-4检出限为0.14 μg/100g；MK-7检出限0.19μg/100g；MK-9的检出限0.25μg/100g。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为脂肪酶加入浓度对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响图。

图2为酶解时间对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响图。

图3为选择定容提取溶剂对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响图。

图4为氢氧化钾的浓度对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响图。

图5为酶解液加入KOH后维生素K₁和维生素K₂的回收率与时间关系图。

图6为磷酸的浓度对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响图。

图7为酶解液加入磷酸后维生素K₁和维生素K₂的回收率与时间关系图。

图8为维生素K₁和维生素K₂的紫外吸收光谱图。

图9为双梯度高效液相色谱体系中维生素K₁和维生素K₂的标准色谱图。

图10为梯度(a)与等度(b)高效液相色谱体系中维生素K₁和维生素K₂的色谱图。

图11为现有方法流程与本发明酶解液直接分析方法流程的对比图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

维生素K₁、维生素K₂标准储备溶液(0.50mg/mL)的配制：

分别准确称取维生素K₁标准品和维生素K₂标准品各5.0mg于10mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度线，充分摇匀，此溶液保存在棕色试剂瓶中于-18℃冰箱中储存。

维生素K₁和维生素K₂混合标准溶液的配制：

分别吸取一定量的维生素K₁和维生素K₂标准储备液，氮气吹干后，用异丙醇稀释，混匀，用异丙醇配制成质量浓度为10μg/mL的混合标准溶液。再用50wt.％异丙醇配制成质量浓度为5μg/mL的混合标准溶液，用异丙醇：水：KOH(或磷酸)体积比为12:12:1混合溶液配成0.5μg/mL的中间液，将上述混合标准溶液用50wt.％异丙醇水溶液逐级稀释成 0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.10μg/mL的混合标准工作溶液，现配现用。

待测样品溶液的制备：

称取奶粉样品量为1g，①酶解：加入10mL水、一定量脂肪酶水溶液，涡旋2～3min，置于37±2℃恒温水浴震荡2～3小时；

②定容：样品酶解液中加入10mL无水异丙醇、1mL5mol/L的KOH水溶液(或1.2mL14.65mol/L的磷酸)，用50wt.％异丙醇水溶液定容至25mL，取2mL过0.45μm滤膜，待上机分析。

以下实施例1～7如无特殊说明，均为控制单一变量，其他实施条件保持相同。

实施例1

本实施例测定了脂肪酶加入浓度对维生素K₁与K₂提取回收率的影响，具体过程为：分别配制0～0.40g/mL不同浓度的脂肪酶水溶液，脂肪酶在30℃超声15min溶解，待底部无颗粒，分别取3mL加入待测样品中，酶解过夜，并对经过过夜酶解的样品溶液中的维生素 K₁和维生素K₂含量进行检测。

图1是脂肪酶加入的浓度对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响图，如图所示，酶解条件下，脂肪酶加入的浓度为0.13g/mL～0.16g/mL时，维生素K₁和维生素K₂的回收率最高；脂肪酶加入的浓度低于0.13g/mL时，奶粉的脂肪因酶解不完全，影响维生素K的释出；当脂肪酶加入的浓度超出0.16g/mL后，维生素K₁和维生素K₂的回收率逐渐下降，可能是酶解液溶度过高，降低了4种维生素K的在异丙醇水溶液中溶解度。

实施例2

本实施例测定了脂肪酶酶解时间对维生素K₁与K₂提取回收率的影响，具体过程为：在样品溶液中加入3mL0.13g/mL的脂肪酶液，观察奶粉酶解时间对4种维生素K的回收率的影响。选择1h～8h范围对维生素K的回收率情况进行测量。

如图2所示，酶解0h～2h，维生素K的回收率逐渐上涨；酶解2h～3h，维生素K的回收率为最高值；酶解超过3h后，4种维生素K回收率都呈现不同程度的下降和不稳定。实验表明，脂肪酶酶解时间过短，酶解不完全，影响后续维生素K₁和维生素K₂测定，酶解时间2h以上，提取效率趋于稳定。酶解时间超过3h，可能由于微生物的增长，会影响维生素K的存在状态，故可选择酶解2h～3h的酶解条件。

实施例3

本实施例测定了选择定容提取溶剂对维生素K₁与K₂提取回收率的影响，具体过程为：在加入3mL0.13g/mL的脂肪酶液，酶解2h～3h得到的酶解液条件下，加入5mL定容试剂进行观察，计算维生素K₁和维生素K₂提取回收率。其中，定容试剂选择实验室常用试剂：甲醇、乙醇和异丙醇。

如图3所示，甲醇和乙醇作为定容溶剂，对维生素K₁和维生素K₂提取的结果均低于65％，但是异丙醇作为定容溶剂，对维生素K₁和维生素K₂的提取均达到70％以上，可能是由于维生素K₁和维生素K₂是弱极性脂溶性化合物，而异丙醇的极性指数(3.9P⁰)小于甲醇(5.1P⁰)与乙醇(-)，因此提取效果更佳，基于该结果，选择异丙醇作为定容提取溶剂。

实施例4

本实施例测定了氢氧化钾的浓度对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响。因为酶解液中含有大量的蛋白质，这些蛋白质会干扰维生素K在PLRP-S柱富集，所以酶解液上机检测前需要进行蛋白质沉淀前处理。采用加入强碱的方式使酶解液中的蛋白沉淀，具体过程为：配制10mol/L的氢氧化钾溶液，取同样体积酶解液(加入3mL0.13g/mL的脂肪酶液，酶解2 h～3h)后各加入一定量的氢氧化钾溶液，使氢氧化钾溶液在酶解液中的浓度为0.05mol/L～0.6 mol/L，观察并测量不同浓度的氢氧化钾对维生素K₁和维生素K₂提取回收率。

如图4所示，当酶解液中氢氧化钾溶液浓度为0.05mol/L～0.15mol/L时：维生素K₁和维生素K₂提取回收率随着氢氧化钾的浓度增加而升高，最高回收率是MK-4，为84％，其余3种维生素K的回收率仍然较低，此时酶解液均为不同程度的浑浊状态，造成维生素K回收率不高可能是因为酶解液中蛋白沉淀不完全，而残存的蛋白质干扰了维生素K在固相萃取柱中的富集，影响了维生素K的洗脱与最终回收；当氢氧化钾的浓度为0.2mol/L～0.3mol/L时，4种维生素K的回收率均达到最高，MK-7的回收率高达95％，此时酶解液为澄清的状态；当氢氧化钾的浓度高于0.3mol/L时，维生素K的回收率开始逐渐下降，可能原因是维生素K在浓度高于0.3mol/L强碱条件下不稳定。从成本角度出发，将定容时样品酶解液中氢氧化钾的浓度定为0.2mol/L。

实施例5

本实施例测定了当实施例4酶解液中KOH浓度为0.2mol/L时，维生素K₁和维生素K₂提取回收率与时间的关系，以考察含有终浓度为0.2mol/L KOH的酶解液的稳定性。具体过程为：在酶解液(加入3mL0.13g/mL的脂肪酶液，酶解2h～3h)中加入10mL无水异丙醇、1mL5mol/L KOH溶液，以50wt.％异丙醇定容，观察时间为0.5h～96h，测定4种维生素K 的回收率。

如图5所示，0.5h～48h内维生素K的回收率为90％～99％，超过48h后，维生素K的回收率逐渐下降。上述结果表明，当酶解液中KOH浓度为0.2mol/L时，维生素K₁和维生素K₂的提取回收率可以持续稳定48h。

实施例6

本实施例测定了磷酸的浓度对维生素K₁和维生素K₂提取回收率的影响，具体过程为：在加入3mL0.13g/mL的脂肪酶液，酶解2h～3h得到的酶解液条件下，在酶解液内加入0.2mL～2.0mL14.65 moL/L的磷酸，观察并测定其对4种维生素K提取率。

如图6所示，当酶解液中加入0.2mL～1.1mL磷酸时，维生素K回收率的随着磷酸的增加而上升。当加入1.2mL磷酸时，酶解液中的4种维生素K的回收率达到最高值，高达95％；当加入超过1.2mL磷酸后，4种维生素K的回收率逐渐下降，加入超过1.8mL磷酸后，维生素K的回收率下降明显，且重现性差，可能是因为磷酸的加入量太高，影响了维生素K在溶液中的溶解度。基于上述结果，将定容时样品酶解液中加入磷酸的量定为1.2 mL。

实施例7

本实施例测定了酶解液加入磷酸后维生素K₁和维生素K₂提取回收率与时间的关系，具体过程为：在酶解液(加入3mL0.13 g/mL的脂肪酶液，酶解2h～3h)中加入1.2mL磷酸后，在0h～72h范围内观察，测定其回收率。

如图7所示，0h～12h内4种维生素的回收率基本没有变化，酶解液澄清，18h～36h内 4种维生素K的回收率逐渐降低，酶解液略浑浊，36h后酶解液中维生素K的回收率下降明显，酶解液明显浑浊，原因可能是细菌滋生，从而影响维生素K的测定。结果可看出，酶解液中含有磷酸，可稳定12h。

实施例8

本实施例进行4种维生素K的全波长扫描。因为脂溶性维生素的溶液浓度不稳定，所有的脂溶性维生素溶液配制后都需通过确定百分吸光系数对其浓度进行校正，其具体过程为：利用SPECORD 250 PLUS紫外可见光分光光度计的全波长扫描。

如图8所示，从上到下的曲线依次对应维生素K₁、MK-4、MK-7、MK-9。结果表明，在波长200nm～300nm范围内，4种维生素K均有2个较高吸收峰，分别在248nm和270 nm，并且4种维生素K吸收光谱图(吸收轨迹)一致，最高吸收峰均在248nm处。证明4 种维生素K₂与K₁有共同的百分吸光系数ελ(1％,1cm)＝419，以此进行溶液校正。

实施例9

本实施例测定了待测样品溶液中4种维生素K的液相色谱数据，具体过程为：采用Eclipse Plus C₁₈柱，规格为4.6mm×150mm，粒径5μm；锌粉还原柱，规格为4.6mm×50 mm，平均粒径70μm；进样体积50μL；柱温25℃。

用体积分数为10％～15％的甲醇(含四氢呋喃)作为液相色谱流动相，运行时间为35 min，观察和收集色谱信息：

0min～8min为体积分数为10％的甲醇(含四氢呋喃)，流速0.6mL/min；

8.10min～13min为体积分数为10％的甲醇(含四氢呋喃)，流速0.8mL/min；

13min～20min为体积分数为20％的甲醇(含四氢呋喃)和体积分数为10％的甲醇(含四氢呋喃)体积比＝80:20，流速0.8mL/min；

21min～30min为体积分数为20％的甲醇(含四氢呋喃)和体积分数为10％的甲醇(含四氢呋喃)体积比＝80:15，流速0.8mL/min；

31min～35min为体积分数为10％的甲醇(含四氢呋喃)，流速0.6mL/min；

如图9所示，维生素K₁和维生素K₂的峰高、峰形较理想，出峰时间最快，缩短了分析检测时间。

实施例10

本实施例测定了流动相不同梯度模式下待测样品中4种维生素K在色谱柱中的保留行为，具体过程为：分别设定液相色谱仪等度与梯度等洗脱程序；

如图10中为梯度(a)与等度(b)高效液相色谱体系中维生素K₁和维生素K₂的色谱图，在a图中样品4种维生素均可出峰，且峰形较好，峰形无拓宽，反之，在b图，当流动相只有体积分数为10％甲醇(含四氢呋喃)溶液时，出现MK-7峰形拓宽，分析时间延迟，且MK-9无法出峰的情况。因此，我们选择流动相为：浓度在体积分数为10％甲醇(含四氢呋喃)～体积分数为20％甲醇(含四氢呋喃)范围内变化的梯度洗脱模式。

实施例11

本实施例测定了同时测定维生素K₁和K₂的方法的线性回归方程、线性范围及检出限，具体过程为：

分别取适量经过浓度校准的维生素K₁和维生素K₂标准储备液，稀释定容，配制成系列浓度的混合标准溶液，用液相色谱仪分析测试，其中每种浓度分别进样50μL，以液相色谱峰面积对混标进样浓度作图绘制标准曲线，以3倍信噪比(S/N)计算检出限(LOD)，结果见表1。

表1 方法的线性回归方程、线性范围及检出限

待测物	线性方程	相关系数(R²)	线性范围(μg/mL)	检出限(μg/100g)
					MK-4	y＝665.6826x-0.5484	0.9991	0.002～0.1	0.14
VK1	y＝669.4071x-0.4549	0.9994	0.002～0.1	0.12
					MK-7	y＝745.4810x+0.5201	0.9990	0.002～0.1	0.19
MK-9	y＝730.6144x-1.5619	0.9987	0.002～0.1	0.25

结果分析：

由表1可知，维生素各组分在线性范围内峰面积与浓度呈现良好的线性关系，相关系数不低于0.998。本发明的方法检测灵敏，其中维生素K₁(VK1)检出限为0.12μg/100g；MK-4 检出限为0.14μg/100g；MK-7检出限0.19μg/100g；MK-9的检出限0.25μg/100g。

分别以维生素K₁和K₂混合浓度为低(0.5μg/100g)、中(1.0μg/100g)、高(2.0μg/100g)的三水平浓度，向空白样品中进行标准添加试验，每个浓度水平平行测定6次，考察本发明检测方法的回收率与精密度，结果见表2。

表2 方法的回收率和精密度(n＝6)

结果分析：由表2可知，本发明检测方法的平均回收率在82.1％～95.8％之间，RSD％值在0.99％～4.69％之间，表明方法的精密度和准确度良好。

实施例12

本实施例进行了奶粉中维生素K₁与K₂的测定，具体过程为：

1.样品的制备：

称取奶粉样品1g，将奶粉样品混匀，称取适量，加入10mL水、3mL 0.13mg/mL脂肪酶水溶液，加盖，涡旋2min～3min，混匀后，置于37±2℃恒温水浴震荡2h～3h，得到酶解液；

向样品酶解液中加入10mL无水异丙醇、1mL 5mol/L的KOH水溶液，用50wt.％异丙醇水溶液定容至25mL，取2mL过0.45μm有机滤膜，待上机分析。

2.仪器参数与运行条件设置：

在线固相萃取部分的运行条件：

(1)维生素K₁与K₂富集净化柱采用PLRP-S柱，规格为4.6mm×12.5mm，孔径15 μm～20μm；

(2)流动相为甲醇、乙腈、水，运行时间为35min；流动相比例与流速：0min～2min，V_甲醇:V_水＝2：8，υ＝1.2mL/min；2.10min～6.00min，甲醇，υ＝1.5mL/min；6.10min～14min，V_乙腈:V_甲醇＝1：1，υ＝1mL/min；14.10min～35min，V_甲醇:V_水＝2：8，υ＝1mL/min；进样体积： 50μL；柱温：25℃；

液相色谱部分的运行条件：

(1)液相色谱柱采用Eclipse Plus C₁₈柱，规格为4.6mm×150mm，粒径5μm；锌粉还原柱，规格为4.6mm×50mm，平均粒径70μm。

(2)流动相：含有四氢呋喃的甲醇溶液记为A，体积分数为10％～20％的A，运行时间为35min；

各时间段流动相比例与流速：0min～8min，体积分数为10％的A，υ＝0.6mL/min；8.10min～13min，体积分数为10％的A，υ＝0.8mL/min；13min～20min，(V_{体积分数为20％的A}：V_{体积分数为10％的A}＝80:20)，υ＝0.8mL/min；21min～30min，(V_{体积分数为20％的A}：V_{体积分数为10％的A}＝85:15)，υ＝0.8mL/min；31min～35min，体积分数为10％的A，υ＝0.6mL/min。

(3)采用荧光检测器，激发波长设置为234nm，发射波长设置为432nm。

3.上样分析，得到色谱数据，通过标准曲线求得维生素K₁和K₂的含量。

图11为现有方法流程与本发明酶解液直接分析方法流程的对比图。从图中可知，现阶段的前处理包括酶解-皂化-萃取-水洗-浓缩-定容，而本发明只需酶解-定容即可，方便简单。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种同时测定奶粉中维生素K1和K2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：采用酶解法处理待测奶粉，得到进样溶液；

S2：采用在线固相萃取-液相色谱联用对S1中所述进样溶液中的维生素K1和K2进行提取检测，得到液相色谱数据；

S3：根据维生素K1和K2的液相色谱标准工作曲线，得到待测奶粉中维生素K1和K2的含量；

所述S1包括：采用脂肪酶酶解奶粉样品得到混合溶液，加入蛋白质变性剂定容，取定容后的溶液过滤，得到进样溶液；所述脂肪酶的浓度为0.05g/mL～0.5g/mL；所述蛋白质变性剂为异丙醇和强碱或异丙醇和强酸；

S2中所述在线固相萃取的运行条件如下：

色谱柱：PLRP-S柱；

流动相：甲醇、甲醇-水溶液、甲醇-乙腈混合溶液；

流动相比例与流速：0min～2min，V甲醇:V水＝2:8，υ＝1.2mL/min；

2.10min～6.00min，甲醇，υ＝1.5mL/min；

6.10min～14min，V_乙腈:V_甲醇＝1:1，υ＝1mL/min；

14.10min～35min，V_甲醇:V_水＝2:8，υ＝1mL/min；

进样体积：50μL；

S2中所述液相色谱的运行条件如下：

色谱柱：C18柱，锌粉还原柱；

流动相：A，所述A为含有四氢呋喃的甲醇溶液；

流动相比例与流速：

0min～8min，体积分数为10％的A，υ＝0.6mL/min；

8.10min～13min，体积分数为10％的A，υ＝0.8mL/min；

21min～30min，(V_{体积分数为20％的A}：V_{体积分数为10％的A}＝85:15)，υ＝0.8mL/min；31min～35min，体积分数为10％的A，υ＝0.6mL/min。

2.根据权利要求1所述的同时测定奶粉中维生素K1和K2的方法，其特征在于，所述酶解为恒温酶解，所述恒温酶解的温度为30℃～40℃,时间为2h～3h。

3.根据权利要求2所述的同时测定奶粉中维生素K1和K2的方法，其特征在于，所述强碱在所述进样溶液中的浓度为0.15mol/L～0.35mol/L；所述强酸在所述进样溶液中的浓度为0.5mol/L～1.2mol/L。

4.根据权利要求1所述的同时测定奶粉中维生素K1和K2的方法，其特征在于，所述检测为荧光检测，所述荧光检测的激发波长为230nm～240nm，发射波长为425nm～435nm。

5.一种如权利要求1～4任一项所述的方法在食品、药品检测中的应用。