CN108709942B - 一种测定奶粉中维生素a,e的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定奶粉中维生素A,E的方法，包括以下步骤：1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；2)采用结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定步骤1)所得溶液中是否含有维生素A,E：若液相色谱结果显示样品疑似含有维生素A,E时，则比较样品与维生素A,E标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素A,E；3)若确认样品中含有维生素A,E，则通过公式计算样品中维生素A,E的含量；本发明简化了操作步骤，消耗溶剂少，大大缩短了前处理时间，节省了人力，实现了自动在线净化检测，提高了灵敏度，保证了测试结果的准确性和再现性。

Description

一种测定奶粉中维生素A,E的方法

[技术领域]

本发明属于分析化学技术领域，具体地说是一种测定奶粉中维生素A,E的方法。

[背景技术]

维生素广泛存在于各种生物体中，目前已发现的约有数十余类，其化学结构各异，有脂肪族、芳香族、脂环族、杂环和甾类化合物。在生理功能上，他们既也不是构成各种组织的主要原料，也不是体内能量的来源，但他们是参与调解物质代谢过程必不可少的小分子有机化合物。维生素A,E均为非极性疏水的异戊二烯衍生物，可溶于脂类和脂肪溶剂，而不溶于水，属于脂溶性维生素。摄入过多，摄入不均衡或缺乏都会引起相应的症状，影响身体的生长发育及我们的生活。

为了适应不同人的营养需求，预防营养不良等疾病，强化食品逐渐进入到我们的生活。维生素强化剂也是使用最早且应用最广泛的营养强化剂，被加入到多种食品中，为人体补充维生素。我国于1986年颁发“食品营养强化剂使用卫生标准(试行)”和食品营养强化剂卫生管理办法。1994年发布了GB 14880《食品营养强化剂使用标准》，目前更新至2012版，对规范我国的食品营养强化，指导企业生产，保障消费者健康安全起到了积极作用。其中对维生素A的使用量根据食品类别要求为600μg/kg-17000μg/kg，维生素E要求为5μg/kg-1450μg/kg。

蛋类，乳品等动物源食品是人体所需脂溶性维生素A,E的重要来源，但维生素A,E化学性质不稳定，很容易受光、空气、温度影响而被氧化分解，同时动物源食品中蛋白脂肪含量高，干扰因素多。因此，高效提取和测定复杂基质中的维生素A,E仍是维生素分析技术的难点。目前维生素A,E的分析方法主要有层析法，比色法，电化学法，气相色谱法和高效液相色谱法，其中以高效液相色谱法最常用。现行食品检验标准GB5009.82-2016在内的大多数在分析方法中，样品前处理主要包括皂化、萃取、浓缩、净化等步骤，涉及多次的蒸发溶解，操作繁琐费时，容易造成待测组分的损失，导致测定结果偏低，大大影响样品的分析效率。

2014年中粮营养健康研究院谢云峰等报道了在线固相萃取-高效液相色谱连用测定动物源食品中维生素A,E的方法，此方法避免了样品的萃取，浓缩等步骤，显著缩短了样品的前处理时间。但其前处理过程中，样品皂化冷却后需要调节pH值并加水定容。由于样品皂化溶液为强碱性，pH调节过程中会有放热现象出现，需要缓慢加入酸性溶液，比较耗时。同时受溶解度影响，样品中含有的脂肪、乳化剂、磷脂、甾醇等有机物质在溶液由碱性变为中性和水分含量增加的过程中逐渐析出。析出物吸附和包裹目标物维生素A,E，会导致测试结果偏低的情况出现。

[发明内容]

本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种测定奶粉中维生素A,E的方法，简化了操作步骤，消耗溶剂少，大大缩短了前处理的时间，节省了人力，实现了自动在线净化检测，提高了灵敏度，保证了测试结果的准确性和再现性。

为实现上述目的设计一种测定奶粉中维生素A,E的方法，包括以下步骤：

1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；

2)采用结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素A,E：若液相色谱结果显示样品疑似含有维生素A,E时，则比较样品与维生素A,E标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素A,E；

3)若确认样品中含有维生素A,E，则通过公式计算样品中维生素A,E的含量。

进一步地，步骤1)中，称取样品量为2g，样品中加入20mL温水、30mL无水乙醇、1g抗坏血酸、1g BHT与20mL 50％KOH水溶液，80℃水浴加热30min，完成后冷却至室温，用50％乙醇水溶液定容至100mL，取2mL过0.45μm滤膜，待上机分析。

进一步地，步骤1)中，若样品中含有淀粉，则在皂化前加入适量淀粉酶。

进一步地，步骤2)中，结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定条件中，在线固相萃取部分的运行条件为：(1)维生素A,E富集净化柱采用PLRP-S柱，规格为4.6×12.5mm，孔径15-20um；(2)流动相为40％乙醇水溶液，运行时间为22min；流动相流速：0-4min为1mL/min；4-15min为0.2mL/min；15-22min为1mL/min，进样体积为200μL；(3)外置六通阀3的流路设置为：0-4min为4→5→7→6；8→9；4-18min为8→7→5→9；4→6；18-22min为4→5→7→6；8→9。

进一步地，步骤2)中，结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定条件中，液相色谱仪的运行条件为：(1)液相色谱柱采用Poroshell 120EC-C8柱，规格为4.6×100mm，粒径4μm；(2)流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流动相流速为1.5mL/min；(3)采用紫外检测器，0-11min波长设置为325nm，11-22min波长设置为294nm。

进一步地，步骤2)中，经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物维生素A,E。

进一步地，步骤3)中，若确认样品中含有维生素A,E，则采用标准曲线外标法进行定量，再根据样品提取液中维生素A,E的含量，换算后计算样品中维生素A,E的含量。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明建立了一种结合柱切换技术对奶粉的皂化提取液直接进行在线净化，测试其中维生素A,E的的双梯度高效液相色谱法，简化了操作步骤，消耗溶剂少，大大缩短了前处理的时间，节省了人力，实现了自动在线净化检测，提高了灵敏度，保证了测试结果的准确性和再现性，从而指导食品企业生产调节，从源头防止维生素强化剂量不准给消费者健康带来的不利影响。

(2)现有方法的前处理中，样品皂化液冷却后需要用乙酸调节pH，纯水定容，离心后取上清液分析。受溶解度影响，样品中含有的脂肪、乳化剂、磷脂、甾醇等有机物质在溶液由碱性变为中性和水分含量增加的过程中逐渐析出。析出物吸附和包裹目标物维生素A,E，导致出现测试结果偏低的情况。同时由于样品皂化溶液为强碱性，pH调节过程中会有放热现象出现，需要缓慢加入酸性溶液，比较耗时。而本发明采用皂化液直接定容后上机分析，省略了pH调节和离心的操作步骤，简化样品前处理过程，提高样品的分析效率，同时不会出现有机析成分的析出和包裹目标物维生素A,E，而导致测试结果偏低的情况。确保测试结果的结果的准确性和再现性。其对比图如附图5所示。

(3)本发明采用特殊的填料和规格的净化柱和色谱柱，实现了强碱性样品溶液的高效液相色谱分析。

(4)本发明中目标物富集在净化柱后，采用反向洗脱的方式，将目标物转移至分析柱中，获得的色谱峰，峰宽适中，对称性好。

(5)本发明通过采用结合柱切换技术的双梯度高效液相色谱系统，可实现一次皂化液进样完成奶粉中维生素A,E的在线净化和检测。

(6)本发明中维生素A，α维生素E，δ维生素E，γ维生素E的定量限均为80μg/100g。

[附图说明]

图1是本发明实施例1中维生素A,E的液相色谱图；

图2是本发明实施例1中结合柱切换技术的高效液相色谱系统SPE上样时分析溶液流路示意图；

图3是本发明实施例1中结合柱切换技术的高效液相色谱系统SPE洗脱时，VA/VE转移至色谱柱时分析溶液流路示意图；

图4是本发明实施例1中结合柱切换技术的高效液相色谱系统SPE清洗平衡时，VA/VE从色谱柱洗脱时分析溶液流路示意图；

图5是现有方法流程与本发明皂化液直接分析方法流程的对比图；

图2至图4中：1、固相萃取进样泵2、自动进样器3、外置六通阀4、第一阀口5、第二阀口6、第三阀口7、第四阀口8、第五阀口9、第六阀口10、废液收集装置11、固相萃取柱12、一维分析泵13、一维分析柱14、可变波长检测器。

[具体实施方式]

本发明属于分析化学领域对奶粉中维生素A,E的测定，其原理为：将样品中的维生素A,E用水，无水乙醇及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容，经配结合柱切换技术的双梯度高效液相色谱仪测定含量，通过比较样品及标准物质色谱峰保留时间和光谱图对检测结果进行确认。

该测定奶粉中维生素A,E的方法，包括以下步骤：1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；2)采用结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素A,E：若液相色谱结果显示样品疑似含有维生素A,E时，则比较样品与维生素A,E标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素A,E；3)若确认样品中含有维生素A,E，则通过公式计算样品中维生素A,E的含量。

其中，步骤1)中，若样品中含有淀粉，则在皂化前需加入适量淀粉酶。步骤2)中，经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物维生素A,E。即，通过比较液相色谱中样品及标准物质的保留时间，确认样品中是否含有维生素A,E。步骤3)中，若确认样品中含有维生素A,E，则采用标准曲线外标法进行定量，再根据样品提取液中维生素A,E的含量，换算后计算样品中维生素A,E的含量。

本发明中结合柱切换技术的高效液相色谱系统，包括固相萃取进样泵1、自动进样器2、外置六通阀3、废液收集装置10、固相萃取柱11、一维分析泵12、一维分析柱13、可变波长检测器14，外置六通阀3上设有第一阀口4、第二阀口5、第三阀口6、第四阀口7、第五阀口8、第六阀口9，固相萃取进样泵1与自动进样器2连接，用于实现样品分析溶液的吸取和进样；自动进样器2另一端与阀3的第一阀口4连接；固相萃取柱11两端分别与外置六通阀3的第二阀口5和第四阀口7连接，其正向流路用于实现样品分析溶液的一次净化，反向流路用于实现富集分析物的洗脱进样；废液收集装置10与阀3的第三阀口6连接，用于收集洗脱液；一维分析泵12与外置六通阀3的第五阀口8连，用于运输流动相平衡一维分析柱13和反向洗脱富集在固相萃取柱11的目标物；一维分析柱13一端与外置六通阀3的第六阀口9连接，一维分析柱13另一端与可变波长检测器14连接，用于检测目标物。

下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：

实施例1：奶粉中生素A,E的测定

1.样品的制备：

准确称取混匀后的样品2g于150mL平底烧瓶中，加入20mL蒸馏水，30mL无水乙醇，1g抗坏血酸，1g BHT 20mL50％KOH水溶液，80℃水浴加热30min，完成后冷却至室温，用50％乙醇水溶液定容至100mL，取2mL过0.45μm滤膜，待上机分析。

2.设定仪器参数：

在线固相萃取部分的运行条件为：

(1)维生素A,E富集净化柱采用PLRP-S柱，规格为4.6×12.5mm，孔径15-20um；

(2)流动相为40％乙醇水溶液，运行时间为22min；流动相流速：0-4min为1mL/min；4-15min为0.2mL/min；15-22min为1mL/min，进样体积为200μL；

(3)外置六通阀3的流路设置为：0-4min为4→5→7→6；8→9；4-18min为8→7→5→9；4→6；18-22min为4→5→7→6；8→9。

液相色谱的运行条件为：

(1)液相色谱柱采用Poroshell 120EC-C8柱，规格为4.6×100mm，粒径4μm；

(2)流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流动相流速为1.5mL/min；

(3)采用紫外检测器，0-11min波长设置为325nm，11-22min波长设置为294nm。

3.定性

经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物。

4.定量

采用标准曲线外标法定量。

5.计算

根据样品提取液中维生素A,E的含量，进行样品中维生素A,E含量的计算。

本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种测定奶粉中维生素A,E的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水，无水乙醇，抗坏血酸，BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；

2)采用结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素A,E：若液相色谱结果显示样品疑似含有维生素A,E时，则比较样品与维生素A,E标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素A,E；

3)若确认样品中含有维生素A,E，则通过公式计算样品中维生素A,E的含量；

步骤1)中，称取样品量为2g，样品中加入20mL温水，30mL无水乙醇，1g抗坏血酸，1g BHT与20mL 50％KOH水溶液，80℃水浴加热30min，完成后冷却至室温，用50％乙醇水溶液定容至100mL，取2mL过0.45μm滤膜，待上机分析；

步骤2)中，结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定条件中，在线固相萃取部分的运行条件为：

(1)维生素A,E富集净化柱采用PLRP-S柱，规格为4.6×12.5mm，孔径15-20um；

(2)流动相为40％乙醇水溶液，运行时间为22min；流动相流速：0-4min为1mL/min；4-15min为0.2mL/min；15-22min为1mL/min，进样体积为200μL；

(3)外置六通阀3的流路设置为：0-4min为4→5→7→6；8→9；4-18min为8→7→5→9；4→6；18-22min为4→5→7→6；8→9；

步骤2)中，结合柱切换技术的双梯度液相色谱仪测定条件中，液相色谱仪的运行条件为：

(1)液相色谱柱采用Poroshell 120EC-C8柱，规格为4.6×100mm，粒径4μm；

(2)流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流动相流速为1.5mL/min；

(3)采用紫外检测器，0-11min波长设置为325nm，11-22min波长设置为294nm。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，若样品中含有淀粉，则在皂化前加入适量淀粉酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物维生素A,E。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，若确认样品中含有维生素A,E，则采用标准曲线外标法进行定量，再根据样品提取液中维生素A,E的含量，换算后计算样品中维生素A,E的含量。

Images