CN109752465A - 一种采用高效液相色谱-质谱法测定乳粉中的牛磺酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品学检验领域。具体涉及乳粉中的牛磺酸含量的测定方法。该方法是将奶粉样品用水溶解，加乙酸锌沉淀蛋白，经离心、过0.45μm粒径的微孔膜过滤后，采用HPLC‑Q/ORBITRAPMS进行分析检测。质谱采用正离子模式分析,同位素内标法定量。色谱测定条件为色谱柱：ZORBAX SB‑AqC18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈（B）流速0.60 mL/min；进样量10μL；柱温箱温度25℃。采用梯度洗脱的分离模式。该方法在0.5~10μg/L范围内线性良好(r=0.9998)，检出限(limit of detection,LOD)为0.2μg/kg。分别在样品中添加牛磺酸标准溶液2、5、10μg/kg水平上进行添加回收率实验,方法回收率在79.9%~94.4%范围内,相对标准偏差在4.7%~6.9%范围内(n=5)。该方法具有准确度高、简单、快速等特点，精密度、准确度和灵敏度均满足乳粉中牛磺酸的检测要求。

Description

一种采用高效液相色谱-质谱法测定乳粉中的牛磺酸含量的 方法

技术领域

本发明属于食品学检验领域。具体涉及乳粉中的牛磺酸含量的测定方法。

背景技术

牛磺酸俗称牛胆碱、牛胆素,广泛分布于生物体内各组织、器官，主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中，化学名称为2-氨基乙基氨基酸，化学式 C₂H₇NO₃S，结构式H₂N-CH₂-CH₂-SO₃H，分子量为125.15。易溶于水，微溶于95%的乙醇，不溶于无水乙醇、醚及烃等有机溶剂。

牛磺酸是一种必需的非蛋白质氨基酸,适量的牛磺酸可以促进人体激素分泌，改善人体各种生理功能。牛磺酸是中枢神经系统最丰富的游离氨基酸之一，且能抑制心肌细胞凋亡，对心血管系统以及中枢神经系统的完善与保护起着重要作用。牛磺酸的含量对机体的生理、病理和生物学变化具有一定的调控作用, 甚至有研究表明血浆中的牛磺酸水平可能是心肌梗死的有用指标。由于牛磺酸对不同年龄阶层的人群均具有良好的保健作用，故通常作为添加剂应用于乳粉产品中。因此，精确测定乳粉中牛磺酸的含量,对均衡人体营养摄入, 维持机体健康具有重要意义。

目前常用的牛磺酸检测方法有氨基酸自动分析法、薄层扫描法、气相色谱法、柱前衍生化高效液相色谱法和柱后衍生化高效液相色谱法, 高效液相色谱-串联质谱法以及高效液相色谱-蒸发光散射检测器法。其中薄层扫描法容易受氨基酸的干扰，灵敏度与准确度均低；氨基酸自动分析法分析样品种类和数量有限；高效液相色谱法是目前广泛应用的牛磺酸测定方法，它能准确测定牛磺酸含量，但需要在柱前或柱后进行衍生化反应，且检测速度较慢,操作复杂，耗时长，不适合进行大宗样品的批量检测；高效液相色谱-蒸发光散射检测器法虽灵敏度较高， 但抗基质干扰能力不足。

高效液相色谱-串联质谱法应用广泛，但基质效应显著，影响分析的准确性。陈晓峰等采用外标法测定婴幼儿乳粉中牛磺酸含量，操作简便。黄焘等采用超高效液相色谱-串联质谱法测定人乳中牛磺酸含量，但人乳相较于乳粉蛋白质脂肪等大分子较少，操作不同，且测定人乳中牛磺酸方法适用范围小。基于他们的研究成果，本研究建立高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法，采用内标法定量，充分利用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱灵敏度高和抗干扰能力强的特点，优化乳粉样品前处理条件，提高检测的效率，并消除外标法中的基质效应，适用性强，可迅速、精确测定牛磺酸含量。

发明内容

高效液相色谱是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间不同，从而按照先后顺序从固定相中流出，达到对物质进行分离的效果，并进行定量分析和定性分析的方法。

本发明包括以下步骤：

（1）样品预处理

称取5.00g (±0.05g)乳粉样品于50 mL聚四氟乙烯塑料离心管中，加入35mL超纯水，涡旋5min；用移液枪准确加入2.50mL1.0mol/L乙酸锌溶液后定容至50mL，涡旋5min；于4℃，13000 r/min离心5min；取上清液0.1mL过0.45μm膜于进样瓶中，再用移液枪准确加入50μL内标液及850μL超纯水于进样瓶中，以备超高效液相色谱-串联质谱检测。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序表

（2）上机测定

用高效液相色谱-质谱法检测，记录色谱图，内标峰高（Hi）与牛磺酸峰高（Hs），用标准曲线换算浓度。

前述的牛磺酸含量的测定方法，其特征在于该方法色谱条件是是色谱柱：ZORBAXSB-Aq C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速0.60mL/min；进样量10μL；柱温箱温度25℃。采用梯度洗脱的分离模式；质谱条件是可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ)；采用正离子扫描模式；

毛细管温度320 ℃，鞘气(N2)流速50L/min，辅助气(N2)流速 8L/min，吹扫气(N2)流速5 L/min；喷雾电压3kV，透镜电压50V；采用正离子目标化合物-二级质谱扫描模式；分辨率R=35000。牛磺酸质谱检测参数设定见表2。

表2 牛磺酸质谱检测参数设定表

化合物名称

分子式

离子模式

保留时间（min）

实测分子量

理论分子量

偏差（10<sup>-6</sup>）

牛磺酸

C<sub>2</sub>H<sub>7</sub>NO<sub>3</sub>S

[M+H]+

4.2

126.02337

126.02260

5.63

<sup>13</sup>C<sub>2</sub>-牛磺酸

C<sub>2</sub>H<sub>7</sub>NO<sub>3</sub>S

[M+H]+

4.2

128.02980

128.02266

5.58

本发明的有益效果是：本发明应用高效液相色谱-质谱法测定乳粉中的牛磺酸含量具有较好的准确度与精密度。

附图说明

图1 实际样品中牛磺酸一级全扫描质谱图。

具体实施方式

下面将详细说明本发明的具体实施方式：

1.仪器与试剂：

仪器： Q-Exactive四级杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技公司ThermoFisher Scientific)配备有HESI-II源、Ultimate 3000 高压液相色谱、自动进样器；XW-80A型涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)；高速离心机(德国 Sigma公司)；LP403分析天平(德国赛多利斯公司)。

试剂：牛磺酸标准品(德国Sigma公司)；¹³C₂-牛磺酸(德国Sigma公司)；乙酸锌(分析纯，南京化学试剂有限公司)所有实验用水均由美国Milli-Q超纯水制备。

2.方法与结果

标准溶液的配制

精确称量1.0mg (精确至0.1 mg)牛磺酸标准品，用超纯水溶解并定容至10mL， 配成0.1mg/L的标准储备液, 置于4℃的冰箱贮存。内标液的配制：根据需要，吸取上述的标准储备液，用水逐级稀释，配制浓度为0.5、1、2、5和10 μg/L的标准系列溶液；配制内标溶液，浓度为0.1 mg/L，并分别加入至上述标准系列溶液中，使每份溶液中内标浓度为5μg/L。

沉淀方法的选择

奶粉中含有大量蛋白质，而牛磺酸易溶于水。需考虑充分提取牛磺酸的前提下选择沉淀蛋白的沉淀剂。常用蛋白沉淀方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法和重金属盐沉淀法。本实验比较3种沉淀方法效果：A(10 mmol/L 乙酸锌水溶液)、B(6％冰醋酸水溶液)和C(乙腈)。以空白国内某品牌婴幼儿配方奶粉

(S1)和国外某品牌婴幼儿奶粉(S2)为例，比较沉淀效果。结果如表3所示：10mmol/L乙酸锌水溶液的蛋白回收率最高，6％冰醋酸水溶液次之，而乙腈的回收率最低。因此，最终选择10mmol/L乙酸锌水溶液作为奶粉中牛磺酸测定的蛋白沉淀剂。

表3 采用不同沉淀蛋白方式处理奶粉样品的比较

色谱条件的优化

由于牛磺酸分子极性较强, 在普通的C18色谱柱上保留和分离效果较差，因此 选择亲水作用色谱原理的ZORBAX SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱作为分离柱。ZORBAX SB系列柱采用独特的单官能团硅烷，适用于增加极性化合物的保留值。实验过程中，使用SB-AqC18色谱柱分离，检测灵敏度高、分离效果好，并且能够得到满意的峰形。因此本研究选用ZORBAX SB-Aq C18色谱柱。

质谱条件的优化

本研究在ESI+模式下，采用流动注射方式，对牛磺酸进行高分辨质谱全扫描，以准分子离子[M+H]+理论精确质量数提取色谱图。采用高分辨质谱， 在全扫描采集模式下分辨率(R)为35000 h，得到一级全扫描的质谱图，如图1所示，分析物相对质量偏差小于6×10^-6。

线性范围和检出限

基于优化的色谱和质谱条件，采用Orbitrap高分辨质谱对配制的牛磺酸标准溶液进行定量分析。分别以牛磺酸分子的提取离子流质谱峰面积为纵坐标Y，以标准物质浓度为横坐标X，绘制标准曲线。牛磺酸标准曲线的相关系数为0.9998，线性关系良好。在空白样品中添加低浓度的牛磺酸，获得信噪比为3(S/N=3)时对应的浓度为此方法的检出限(limit ofdetection，LOD)，获得信噪比为10(S/N=10) 时对应的浓度为此方法的定量限(limit ofquantification，LOQ)。得出牛磺酸检出限为0.2 μg/kg，定量限为基本满足牛磺酸痕量分析要求。

回收率和精密度

对空白国内婴幼儿配方奶粉(A1)和国外婴幼儿奶粉(A2)进行5、10和20 μg/kg共 3个不同添加水平的加标回收率试验，对于每个添加水平重复测定5次，结果如表 4所示。3个添加水平的平均回收率在79.9%~94.4%范围内，相对标准差(RSD)在 4.7%~6.9%范围内。该方法基本符合国内外分析检测要求。

表4 2种不同品牌奶粉中牛磺酸的加标回收率(n=5)

实际样品的检测

本研究以实验室从市场抽检的样品为分析对象，挑选5种不同品牌的进口婴幼儿奶粉和5种国产奶粉(包括2种婴幼儿配方奶粉、2种孕妇奶粉、1 种青少年奶粉)， 按照样品前处理方法处理样品，采用优化后的液相色谱-质谱/质谱连用分析方法条件定性和定量分析乳粉中的牛磺酸。结果显示，抽检的所有奶粉样品中的牛磺酸含量与标签值基本一致。

Claims (2)

1.乳粉中的牛磺酸含量的测定方法，其特征在于将待测样品预处理后，用高效液相色谱-质谱法检测，包括以下步骤：

（1）样品预处理

称取5.00 g(±0.05g)乳粉样品于50 mL聚四氟乙烯塑料离心管中，加入35mL超纯水，涡旋5min；用移液枪准确加入2.50mL1.0 mol/L乙酸锌溶液后定容至50mL，涡旋5min；于4℃, 13000 r/min离心5 min；取上清液 0.1mL过0.45μm膜于进样瓶中，再用移液枪准确加入50 μL内标液及850μL超纯水于进样瓶，以备超高效液相色谱-串联质谱检测；

（2）上机测定

用高效液相色谱-质谱法检测，记录色谱图，内标峰高（Hi）与牛磺酸峰高（Hs），用标准曲线换算浓度；前述的牛磺酸含量的测定方法，其特征在于该方法色谱条件是是色谱柱:ZORBAX SB-Aq C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速0. 60 mL/min；进样量10μL；柱温箱温度25℃；采用梯度洗脱的分离模式；质谱条件是可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ)；采用正离子扫描模式； 毛细管温度320 ℃，鞘气(N2)流速50L/min，辅助气(N2)流速8L/min，吹扫气(N2)流速5L/min；喷雾电压3kV，透镜电压50V；采用正离子目标化合物-二级质谱扫描模式；分辨率R=35000。

2.本发明的有益效果是：本发明应用高效液相色谱-质谱法测定乳粉中的牛磺酸含量具有较好的准确度与精密度。