CN102435699B - 液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法，在待测的乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，使用正相色谱柱，用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相反相分离三聚氰胺，再串联质谱MRM定性、定量分析乳与乳制品中三聚氰胺。国标法中使用SPE小柱进行净化，最终定容体积为1mL，本发明所述快速方法最终体积为25mL，所用曲线线性范围为0.25ng?mL-1—5.00ng?mL-1，乘以25倍的稀释差距后为6.25mg/kg—125mg/kg，已经完全达到并且满足了国标要求。在提高灵敏度的同时，降低了样品过载的可能。
Description
技术领域
本发明属于一种液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法。
背景技术
三聚氰胺作为化工原料可用于塑料、涂料、粘合剂、食品包装材料的生产，资料表明，三聚氰胺可能从环境、食品包装袋等途径进入到食品中，其含量很低。三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加剂，是禁止人为添加到饲料和食品中的，国家标准[1]中三聚氰胺的限量为1 mg/kg。近年来，人为添加三聚氰胺导致的严重案例时有发生[2-4]，因此对三聚氰胺的快速有效的检测方法是十分必要的。
目前国际上通常采用凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白质的含量，即以含氮量的多少乘以6.25 得出蛋白质含量。三聚氰胺并没有实际作用，更没有任何营养价值。牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因为其能冒充蛋白质。每1 kg 牛奶中添加0.1 g 三聚氰胺，就能提高0.4 %的蛋白质含量。食品都要按规定检测蛋白质含量，要是蛋白质含量不够，说明牛奶兑水兑得太多，或者说明奶粉中有太多别的粉，用全氮测定法测蛋白质含量时根本不会区分这种伪蛋白氮。三聚氰胺进入体内后似乎不能被代谢，而是从尿液中原样排出。但是，科学家研究发现动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，如膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。
近年来，宠物饲料中发现三聚氰胺并导致宠物死亡的案例时有发生。2007 年3 月，美国发生宠物食品导致宠物死亡的事件，美国食品药品管理局(FDA)
在随后的调查中发现，宠物食品所用的小麦鼓蛋白添加物中含有较高浓度的三聚氰胺。同时，该物质也可能通过食物链影响人体的健康，前不久我国发生的“三鹿结石奶粉事件”，从三鹿集团的婴幼儿配方奶粉中发现高含量的有毒物质三聚氰胺，到全国阶段性查出22 家婴幼儿配方奶粉生产企业的69 批次产品检出了含量不同的三聚氰胺，令人触目惊心!
目前三聚氰胺在食品中的残留检测分析报道较少，主要有：气质联用（GC-MS）法、超高效液相色谱 - 电喷雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱 - 二极管阵列法、高效液相色谱法( HPLC) 、高效液相色谱 - 四极杆质谱联用、固相萃取与高效液相色谱联用、液相色谱串联质谱法(LC-MS/ MS) 等。
气质[7-9]法选择性好，但是其前处理过于复杂，并且需要较长的分析时间。无法适应需处理大量样品的场合。
高效液相色谱法[10-13]相比气质联用法则相对简便，快速，许多研究表明使用反相柱如C18，C18混合柱等可以有效地分析三聚氰胺，但由于柱分离及检测器的局限，易产生假阳性的结果。另外，由于检测器的灵敏度限制，必须对样品使用萃取柱进行富集处理，提高了处理的难度及成本。
液相色谱-质谱联用法[14-18]，目前主要的研究大都放在液相色谱串联质谱法上，在具备了液相相对简易的提取方法后，通过使用质谱检测提高了选择性和灵敏度。经过了许多研究者的演化，目前最理想的分析条件是样品经萃取柱净化，超高效液相色谱分离，最终采用电喷雾串联四极杆质谱进行检测。结果表明，当样品中三聚氰胺的含量范围为10～5 000 μg/kg时，线性关系良好( r>0.99)。在10～100 μg/kg的添加水平范围内的平均回收率为83%～94%，相对标准偏差为4.12%～6.15%。该方法的检出限为10 μg/kg。并且高效液相色谱-四极杆质谱联用法可以在定量的同时对样品进行定性，因此准确度高，误判的可能性小。
最终，国家标准GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[1]中包含中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）。定量限分别为2 mg/kg、0.01 mg/kg、0.05
mg/kg。
发明内容
本发明的目的是提供一种不经过萃取柱、能够快速测定乳与乳制品中三聚氰胺的液相色谱串联质谱的方法。
本发明的目的是这样实现的，所述的液相色谱串联质谱（以下简称LC-MS/MS）快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法，具体步骤为：
在待测的乳或乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，使用正向色谱柱，用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相反相分离三聚氰胺，再串联质谱MRM定性、定量分析乳或乳制品中三聚氰胺。所述的乙腈提取的提取剂优选体积比是1:9的水：乙腈的混合液。
所述的色谱柱以HELIC模式使用；流动相：4 mmol•L-1 乙酸胺水溶液和乙腈，其中乙酸胺水溶液与乙腈的体积比为1:9；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40℃；进样量：2 μL；在此条件下，三聚氰胺及15N3内标物的保留时间为1.200 min；
质谱条件是：电离方式为电喷雾离子化源(ESI) ，正离子模式；离子喷雾电压：4000 V；雾化气：（GS1，N2）50 psi；干燥气（GS1，N2）流速：11 L·min-1，温度：350℃；碰撞气：氮气；扫描模式：多反应监测MRM。
在标准品的乳粉基质实验中，三聚氰胺选用在34 ev的碰撞能量下荷质比为m/z
68的子离子为定量离子，在14 ev 的碰撞能量下荷质比为m/z
85 的子离子为辅助定性离子。
在15N3内标物实验中，三聚氰胺选用在29 ev 的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在17 ev
的碰撞能量下荷质比为m/z 85 的子离子为辅助定性离子。
本发明乳制品中加入内标，由乙腈提取三聚氰胺，不经过萃取柱，以液相色谱串联质谱MRM模式定性、定量分析。一批次约40个样品的前处理时间只需一小时。结果：在本实验条件下，加标回收率在95.0%-103.3%
之间，相对标准偏差5.5%-7.6%(n = 5) 。定性、定量检出限分别为0.02 ng•mL-1，0.20 ng•mL-1，较国标方法的灵敏度高。该方法已用于乳粉的日常监测。
本发明的检测方法的主要技术内容及基本原理：
① 以乙腈来提取三聚氰胺，不经过固相萃取小柱，前处理时间缩短，每个样品处理时间不超过45分钟；
② 不使用固相萃取小柱，可以节省大量的资金；
③ 高样品通量，每批40个在一小时能处理完成；
④ 使用以液相色谱串联质谱检测，能同时进行定性、定量分析，提高了灵敏度，使检测限达到0.20
ng•mL-1，能达到国标要求的0.01 mg•kg-1（10 ng•mL-1）；
⑤ 使用正向色谱柱反相分离三聚氰胺，可以不使用离子对试剂，仅用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相，同反相柱相比，具有更好地分离度、分辨率和灵敏度。
经过三聚事件到现在，人为添加三聚的行为已经被基本防治，在多数样品中，三聚氰胺的主要来源变为从运输，贮存过程中与包装材料粘附产生的吸附作用，还有因后期加工而产生的富集作用，因而对乳制品中三聚氰胺的分析，已经进入到了痕量分析阶段，另外，对于质谱来说，因为其灵敏度很高，过高浓度的样品反而有可能引起信号过载，遇到三聚氰胺含量过高的样品还可能造成仪器损伤等严重后果，国标法中使用SPE小柱进行净化，最终定容体积为1 mL，本文所述快速方法最终体积为25 mL，所用曲线线性范围为0.25ng•mL-1-5.00
ng•mL-1，乘以25倍的稀释差距后为6.25 mg/kg-125
mg/kg，已经完全达到并且满足了国标要求。在提高灵敏度的同时，降低了样品过载的可能。
同国标法对比，该法具有灵敏、准确、简便、快速等特点。
本发明优点为：本发明的研究了乳与乳制品中三聚氰胺含量的快速检测法，简化了前处理操作，并采用高效液相色谱-串联质谱技术，检验结果准确、灵敏、快速。
附图说明
图
1
为本发明的三聚氰胺
[M+H]+
的二级全扫描质谱图。
图
2A
为本发明的取流动相
1.0
mL
，进样
2
μ
L
作空白图谱，得色谱图。
图
2B
为本发明的取一定浓度（
0.50
ng
•
mL-1
）的三聚氰胺对照品溶液
1.0 mL
，进样
10
μ
L
作对照图谱。
图
2C
为本发明的取空白乳粉溶液（
0.00
ng
•
mL-1
）
1.0 mL
，进样
2
μ
L
作样品图谱，得色谱图。
图
2D
为本发明的取空白乳粉
+
三聚氰胺对照品（
0.20 ng
•
mL-1
）溶液
1.0 mL
，进样
2
μ
L
作样品图谱。
图
3
为本发明的
LC-MS/MS
测定三聚氰胺的色谱图，样品浓度：
0.0380 ng
•
mL-1
测定性限。
图
4
本发明的
LC-MS/MS
测定三聚氰胺的色谱图，样品浓度：
0.2305 ng
•
mL-1
，测定量限。
图
5-1
为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺定量子离子
127.1
→
68
色谱峰。
图
5-2
为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺定性子离子
127.1
→
85
与定量子离子
127.1
→
68
的重叠色谱峰。
图
5-3
为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺三个离子的总响应量。
图
5-4
为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺内标定量子离子
130.1
→
87
色谱峰。
图
5-5
为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺内标定性子离子
130.1
→
87
与定量子离子
130.1
→
69
的重叠色谱峰。
图
5-6
为实样检测阳性乳粉未中三聚氰胺的完整色谱图，三聚氰胺内标三个离子的总响应量。
图
6
为本发明的
LC-MS/MS
测定三聚氰胺的校正曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明
1仪器
高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪（Agilent
1200-6410 Triple Quad LC-MS；安捷伦公司）；包括：G1322A在线脱气机，G1312B二元梯度泵，G1329B自动进样器，G1316B柱温箱，ESI电喷雾离子源；MassHunter4.0工作站软件。超声波清洗器。
2 试剂
三聚氰胺标准品、三聚氰胺内标15N3，上海安谱公司产品。
乙腈为默克公司色谱纯；乙酸铵为CNW公司色谱纯。
3 分析方法
3.1 LC条件
色谱柱：Zorbax RX-SIL, 2.1×50mm, 1.8 μm，使用时转为HELIC模式。
流动相：4 mmol•L-1 乙酸胺水溶液：乙腈（体积比为1:9）；流速：0.4mL•min-1；柱温：40℃；进样量：2 μL。
在此条件下，三聚氰胺及15N3内标物的保留时间约为1.200 min。
3.2
MS/MS条件
电离方式：电喷雾离子化源(ESI) ，正离子模式；离子喷雾电压：4000 V；雾化气：（GS1，N2）50 psi；干燥气（GS1，N2）流速：11 L·min-1，温度：350℃；碰撞气：氮气；扫描模式：多反应监测MRM，参数见表1。
表
1
是三聚氰胺内标法
LC-ESI-MS/MS
质量条件参数
Tab l Segments list of Melamine and Melamine-15N3 for ESI
ion source
注：打*号为定性子离子。
3.3 具体的测试方法的步骤
步骤1）称取 1 g （精确到 0.0001 g）的乳粉样品至 50 mL 的离心管中;
步骤2）加入 250
ng•mL-1 的三聚氰胺内标液 100 μL，加入 25 mL 水：乙腈（1:9）；
步骤3）涡流震荡 2
min，超声 30 min，不时摇动；
步骤4）取出，经
10000 r/min 离心 4 min；
步骤5）离心上清液经 0.22
μm 滤膜过滤。
注：三聚氰胺内标液提取稀释后的浓度为1.00 ng•mL-1。
4 方法优化与方法验证
4.1 MS条件的优化
根据三聚氰胺分子结构，选择ESI(+)作为电离模式，将标准品配成浓度为100 ng•mL-1
的90%乙腈溶液，分别对毛细管电压、锥孔电压、原温度、脱溶剂温度、碰撞能量、质谱分辨率等条件进行了优化。
对三聚氰胺样品的总离子扫描质谱图中得到特征离子为母离子m/z 127.1，子离子68和85。对三聚氰胺15N3样品的总离子扫描质谱图中得到特征离子为母离子m/z 130.1，子离子m/z
69和m/z 87。
标准品的乳粉基质实验中m/z 85的子离子在保留时间处有干扰峰，因此选择m/z
68为定量子离子，随着碰撞能量的增加，母离子丰度逐渐减少，子离子m/z 68，m/z 85的丰度逐渐增加，再增加碰撞能量，子离子m/z
68，m/z 85的丰度逐渐下降，所以三聚氰胺最终选用在34 ev
的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在14 ev
的碰撞能量下荷质比为m/z 85 的子离子为辅助定性离子。
对15N3内标物，同三聚氰胺，选择m/z 69为定量子离子，随着碰撞能量的增加，母离子丰度逐渐减少，子离子m/z 69，m/z 87的丰度逐渐增加，再增加碰撞能量，子离子m/z
69，m/z 87的丰度逐渐下降，所以三聚氰胺最终选用在29ev 的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在17ev 的碰撞能量下荷质比为m/z 85 的子离子为辅助定性离子。
4.2 质谱分析
打入三聚氰胺准品，按步骤3.2“质谱条件”项上机操作，峰值时间相应的二级全扫描质谱图见图1。
4.3特异性
取流动相1.0 mL，进样2 μL作空白图谱，得色谱图2A；取一定浓度的三聚氰胺对照品溶液1.0 mL，进样10 μL作对照图谱，得色谱图2 B，三聚氰胺的保留时间别为1.2 min；取空白乳粉溶液1.0
mL，进样2 μL作样品图谱，得色谱图2 C；取空白乳粉+三聚氰胺对照品溶液1.0 mL，进样2 μL作样品图谱，得色谱图2 D。
结果表明：空白基质对三聚氰胺的分离不构成干扰。
4.4 基质效应
在空白乳粉中加入三聚氰胺标准溶液，制得12 ng·mL-1的溶液来考察基质效应对测定三聚氰胺的影响。按“3.3”项处理后进行LC-MS/MS分析，得标准品峰面积A1，保留时间为1.202 min，得内标峰面积B1，保留时间为1.202 min；同样对12 ng·mL-1三聚氰胺标准溶液进行分析，得到相应的峰面积A2、B2，保留时间为1.209 min、1.209 min；以A1/B1接近1的方法考察其基质效应，结果本方法基质效应下响应值约为标准对照的70%，但内标比例A1/B1：A2：B2接近于1，表明在以三聚氰胺内标物作为内标参考的情况下，可以完全体现基质效应的影响，从而通过内标法准确定量。
4.5 标准曲线
三聚氰胺标准曲线中添加1.00 ng•mL-1浓度的内标物，浓度分别为0.25 ng•mL-1、0.50 ng•mL-1、1.00 ng•mL-1、2.50 ng•mL-1、5.00 ng•mL-1。内标曲线配置方法数据见表2。
表
2
三聚氰胺标准曲线配制（内标法）
Tab 2 The Calibration Curve of Melamine standards
以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积比值为纵坐标，即得标准曲线，见图6：y=1.183x+0.107 (r=0.9987)。线性范围为
0.25-5.00 ng·mL-1。
4.6 灵敏度
在空白乳粉中加入三聚氰胺标准溶液，制得尽可能低浓度的溶液来考察基质环境下三聚氰胺的检测灵敏度，见图3和图4，图3为LC-MS/MS测定三聚氰胺的色谱图，样品浓度：0.0380
ng•mL-1测定性限，图4 LC-MS/MS测定三聚氰胺的色谱图，样品浓度：0.2305
ng•mL-1，测定量限；获得定性限为0.02 ng·mL-1
(S/N=3)，定量限为0.20 ng·mL-1
(S/N=10)。
4.7 精密度
按步骤“4.5标准曲线的制备”项下操作, 制备三聚氰胺低、中、高三个浓度（分别为1.0, 5.0, 10.0 ng·mL-1）的质量控制（QC）样品，每一浓度进行5 次分析，连续测定三天，根据当日的标准曲线，计算QC 样品的测得浓度，根据QC 样品结果计算本法的准确度与精密度，结果见表3。
表
3 LC-MS/MS
测定三聚氰胺含量的日间精密度与日内精密度（
n=5
）
4.8 回收率
取空白样品1g，按“3.3”项下样品前处理操作，加入标准品贮备液制备低、中、高三个浓度（三聚氰胺分别为0.25, 5.00,
100.0 ng·mL-1）的样品，每一浓度测定5次。同时另取已知浓度的对照品1.0 mL，加入一定浓度的标准溶液，涡流混合，按“3.3”项下操作，获得相应峰面积（五次测定的平均值）。计算回归得到高、中、低三个浓度的提取回收率分别为105.6%，99.4%，98.7%，平均回收率为101.76%。结果见表4。
表
4 LC-MS/MS
测定三聚氰胺含量的回收率试验结果（
n=5
）
Tab 4 The recovery of Melamine in Milk Powers
4.9 稳定性
样品经处理后，室温下放置3h，6h，9h和12 h 测得峰面积比不变（RSD<0.5%），说明乳粉中的三聚氰胺在该方法处理下室温稳定。
4.10 实样测定
取数个未知含量的各品牌乳粉，按照步骤“3.3”样品前处理方法进行处理，依次进样，测定结果见表5，实样测定图见图5。
表
5
实际测定三聚氰胺含量的结果（
n=4
）
Tab 5 The detection of Melamine in Milk Powers
| 样品 （Sample） | 三聚氰胺 （Melamine） ug•kg-1 |
| 1 | 未检出 |
| 2 | 未检出 |
| 3 | 0.015 |
| 4 | 0.013 |
5 讨论
本发明利用HPLC-MS/ MS具有很高的专属性、灵敏性、准确性等优点，将国标中含量区限于大剂量、高浓度的视野转移至小剂量、低浓度、高精度的检测方向上来，用一种更为精确的质量分析方法来服务于三聚氰胺的测定。该方法的检测限已达到0.20
ng·mL-1。
而本发明运用LC-MS/MS方法，质谱为浓度型检测器，提高了灵敏度可以提高几个数量级，所建立的LC-MS/MS方法可满足日常奶粉样品的检测要求。
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Claims (1)
1.一种液相色谱串联质谱快速测定乳与乳制品中三聚氰胺方法，其特征在于：在待测的乳或乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，使用正向色谱柱，用乙腈与乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相反相分离三聚氰胺，再串联质谱MRM定性、定量分析乳或乳制品中三聚氰胺；
所述的色谱柱以HELIC模式使用；流动相：4 mmol•L-1 乙酸胺水溶液和乙腈，其中乙酸胺水溶液与乙腈的体积比为1:9；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40℃；进样量：2 μL；在此条件下，三聚氰胺及15N3内标物的保留时间为1.200 min；
质谱条件是：电离方式为电喷雾离子化源，正离子模式；离子喷雾电压：4000 V；雾化气： GS1，N2 50 psi；干燥气GS1，N2 流速：11 L·min-1，温度：350℃；碰撞气：氮气；扫描模式：多反应监测MRM；标准品的乳粉基质实验中，三聚氰胺选用在34 ev的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在14 ev
的碰撞能量下荷质比为m/z 85 的子离子为辅助定性离子；15N3内标物实验中，三聚氰胺选用在29 ev
的碰撞能量下荷质比为m/z 68的子离子为定量离子，在17 ev
的碰撞能量下荷质比为m/z 85 的子离子为辅助定性离子； 具体乳粉样品处理步骤为：1）称取 1 g的乳粉样品至 50 mL 的离心管中;2）加入 250 ng•mL-1 的三聚氰胺内标液 100 μL，加入 25 mL
的水：乙腈体积比为1:9的液体；3）涡流震荡 2 min，超声 30 min，不时摇动；4）取出，经 10000 r/min 离心 4 min；5）离心上清液经 0.22 μm 滤膜过滤。
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| 超高效液相色谱-串联质谱法测定乳制品中三聚氰胺的残留量;宗珊盈 等;《分析实验室》;20090531;第28卷;摘要 * |
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