CN102565252B - 检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法 - Google Patents
检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102565252B CN102565252B CN201010581678.5A CN201010581678A CN102565252B CN 102565252 B CN102565252 B CN 102565252B CN 201010581678 A CN201010581678 A CN 201010581678A CN 102565252 B CN102565252 B CN 102565252B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- homocysteine
- blood
- content
- urine
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，包括如下步骤：将标品、待测样本分别和内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入巯基乙醇、二硫苏糖醇或TCEP混匀，静置10min；加入质量百分含量10％的三氯乙酸，高速离心，取上清液，用去离子水稀释，与流动相一起流经色谱柱进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中同型半胱氨酸的含量。本发明的检测同型半胱氨酸含量的方法，简便、快速、灵敏，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确、特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法。
背景技术
同型半胱氨酸作为独立的心血管风险指标已被广泛接受，是高血脂、吸烟、糖尿病之外的又一危险因子。同型半胱氨酸除与血管疾病有关外，还与神经管畸形、先兆子痫、帕金森病、胎儿生长缓慢、慢性肾功能衰竭等多种疾病及某些药物、肿瘤的影响有关。目前，同型半胱氨酸的定量测定主要采用酶免试剂盒方法，但酶免试剂盒方法具有时间长、价格高，准确性低，不能大规模应用等缺点。而我们建立的液相串联质谱的检测方法是一种简单、高效、灵敏且准确度高的定量测定方法，为大规模应用提供了必要条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法。
本发明所提供的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，包括如下步骤：
将标品、待测样本分别和内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)混匀，静置10min；加入质量百分含量10％的三氯乙酸，高速离心，取上清液，用去离子水稀释，与流动相一起流经色谱柱进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中同型半胱氨酸的含量。
本发明的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，其中：所述基质溶液为质量百分含量4％的牛血清蛋白溶液、生理盐水或空白血浆溶液。
本发明的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，其中：所述流动相为水∶有机相＝90∶10，其中所述水相含有体积百分含量0.2％的甲酸，所述有机相中含有体积百分含量0.1％的甲酸。
本发明的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，其中：所述TCEP的浓度为120g/L。
本发明的检测同型半胱氨酸含量的方法以同位素为内标，使得目标化合物的识别更为准确，同时更好的消除了系统误差，定量结果更为准确。添加基质溶液，模拟体液环境，消除基质效应，提高了同型半胱氨酸的回收率。以巯基乙胺为还原试剂，可以将与蛋白质残基结合的同型半胱氨酸全部还原出来，以游离形式存在。本发明用10％的三氯乙酸除蛋白，除去蛋白的效率较高。用去离子水稀释上清液可以降低三氯乙酸的浓度，结合较小的进样量，降低离子抑制作用。本发明的检测同型半胱氨酸含量的方法，简便、快速、准确，不仅可以应用于大规模样本检测，而且定量准确。
附图说明
图1为标准品(同型半胱氨酸)的色谱图。
图2为内标品(D4-同型半胱氨酸)的色谱图。
图3为血清中同型半胱氨酸的色谱图。
图4为血清中内标(D4-同型半胱氨酸)色谱图。
图5为同型半胱氨酸质谱图。
图6为内标D4-同型半胱氨酸质谱图。
具体实施方式
步骤1：用移液器移取标品和内标溶液，涡旋仪混匀；同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混匀；
步骤2：向上述混合液中加入基质溶液(质量百分含量4％的牛血清蛋白溶液、生理盐水或空白血清溶液)，涡旋混匀；
步骤3：分别加入巯基乙胺、巯基乙醇、二硫苏糖醇或120g/L TCEP，充分混匀；
步骤4：静置10min；
步骤5：加入除蛋白试剂试剂(质量百分含量10％的三氯乙酸)，涡旋混匀，高速离心；
步骤6：取上清液，用去离子水稀释；
步骤7：取上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析血液或尿液中同型半胱氨酸的含量。
液相色谱条件：
样品经液相的自动进样器进样，流动相为水∶有机相＝90∶10，其中水相含有0.2％的甲酸，有机相中含有0.1％的甲酸，等度洗脱分离，流速200μL/min，进样量3μL。色谱柱：Discovery C18(SUPELCO，HPLC，5cm*2.1mm，5μm)
三重四级杆串联质谱仪条件：
ESI离子源，正离子扫描；MRM模式，扫描时间2.5min，喷雾电压5000V，鞘气(氮气)30psi，辅助气(氮气)10psi，毛细管温度450℃，碰撞气(氮气)1.5mTorr；m/z 136→90、m/z 136→118作为Hcy的特征定性离子对，m/z 140→94、m/z 140→122作为内标D4-Hcy的特征定性离子对，m/z 136→90用于Hcy定量，CE为15eV，扫描时间0.5s，扫描宽度1u。
四种还原试剂对测定值的影响见表1，采用巯基乙胺还原的样本，其最终产物的色谱峰强度小于其他3种还原试剂还原的样本色谱峰强度。
表1.不同还原试剂测定值结果比较
不同静置时间对测定值的影响见表2，其它条件不变的情况下，静置10min，检测结果最准确。
表2.静置时间比较
二.检测实例
步骤1：用移液器移取30μL的标品溶液(浓度10-1000μmol/l，可自行依据待测物的浓度范围配制不同浓度的标品溶液)、30μL的待测血清分别与10μL的浓度为76μmol/l的同位素内标溶液(D4-同型半胱氨酸：D4-Hcy)混合，涡旋仪混匀；
步骤2：向上述标液和内标的混合液中加入质量百分含量4％的牛血清蛋白溶液，涡旋混匀；
步骤3：再加入巯基乙醇，充分混匀；
步骤4：静置10min；
步骤5：加入除蛋白试剂试剂(质量百分含量10％的三氯乙酸)，涡旋混匀，高速离心；
步骤6：取上清液，用去离子水稀释；
步骤7：取上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析血清中同型半胱氨酸(Hcy)的含量。
液相色谱条件：
样品经液相的自动进样器进样，流动相为水∶甲醇＝90∶10，其中水相含有0.2％的甲酸，甲醇中含有0.1％的甲酸。，等度洗脱分离，流速200μL/min，进样量3μL。色谱柱：Discovery C18(SUPELCO，HPLC，5cm*2.1mm，5μm)
三重四级杆串联质谱仪条件：
ESI离子源，正离子扫描；MRM模式，扫描时间2.5min，喷雾电压5000V，鞘气(氮气)30psi，辅助气(氮气)10psi，毛细管温度450℃，碰撞气(氮气)1.5mTorr；m/z 136→90、m/z 136→118作为HCY的特征定性离子对，m/z 140→94、m/z 140→122作为内标D4-HCY的特征定性离子对，m/z 136→90用于HCY定量，CE为15eV，扫描时间0.5s，扫描宽度1u。
标准品(同型半胱氨酸)及其内标(D4-同型半胱氨酸)的色谱图如图1、2、5和6所示。
血清样本中同型半胱氨酸及其内标D4-同型半胱氨酸的色谱图如图3和4所示，表明该方法的特异性强、准确度和灵敏度高。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (1)
1.检测血液中同型半胱氨酸含量的方法，包括如下步骤：
步骤1：用移液器移取30μL的标品溶液、30μL的待测血清分别与10μL的浓度为76μmol/L的D4-同型半胱氨酸同位素内标溶液混合，涡旋仪混匀，其中，所述标品溶液的浓度为10-1000μmol/L；
步骤2：向上述标液和内标的混合液中加入质量百分含量4%的牛血清蛋白溶液，涡旋混匀；
步骤3：再加入巯基乙醇，充分混匀；
步骤4：静置10min；
步骤5：加入质量百分含量10%的三氯乙酸，涡旋混匀，高速离心；
步骤6：取上清液，用去离子水稀释；
步骤7：取上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析血清中同型半胱氨酸的含量；
液相色谱条件：
样品经液相的自动进样器进样，流动相为水：甲醇=90：10，其中水相含有0.2%的甲酸，甲醇中含有0.1%的甲酸，等度洗脱分离，流速200μL/min，进样量3μL，色谱柱为Discovery C18，SUPELCO，HPLC，5cm×2.1mm，5μm；
三重四级杆串联质谱仪条件：
ESI离子源，正离子扫描；MRM模式，扫描时间2.5min，喷雾电压5000V，氮气作为鞘气30psi，氮气作为辅助气10psi，毛细管温度450℃，氮气作为碰撞气1.5mTorr；m/z136→90、m/z136→118作为HCY的特征定性离子对，m/z140→94、m/z140→122作为内标D4-HCY的特征定性离子对，m/z136→90用于HCY定量，CE为15eV，扫描时间0.5s，扫描宽度1u。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010581678.5A CN102565252B (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010581678.5A CN102565252B (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102565252A CN102565252A (zh) | 2012-07-11 |
| CN102565252B true CN102565252B (zh) | 2014-07-02 |
Family
ID=46411214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010581678.5A Active CN102565252B (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102565252B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106442836A (zh) * | 2016-10-09 | 2017-02-22 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法 |
| CN110441457A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-11-12 | 深圳市绿航星际太空科技研究院 | 一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法 |
| CN111239292B (zh) * | 2019-10-24 | 2022-11-25 | 丁芬 | 同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1580759A (zh) * | 2003-08-13 | 2005-02-16 | 上海市徐汇区中心医院 | 一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定方法 |
| CN1979155A (zh) * | 2005-11-30 | 2007-06-13 | 上海特敏生物医药科技有限公司 | 一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒 |
| CN101430307A (zh) * | 2008-12-18 | 2009-05-13 | 浙江大学 | 一种同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法 |
| CN101796408A (zh) * | 2007-06-29 | 2010-08-04 | 奎斯特诊断投资公司 | 用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004222518A (ja) * | 2003-01-20 | 2004-08-12 | Kiyoshi Toda | 発酵法によるｓ位置換システイン誘導体および／あるいはｓ位置換ホモシステイン誘導体の製造法 |
| US20070281361A1 (en) * | 2006-05-11 | 2007-12-06 | Meenakshisundaram Hariharan | Human plasma free amino acids profile using pre-column derivatizing reagent- 1-naphthylisocyanate and high performance liquid chromatographic method |
-
2010
- 2010-12-09 CN CN201010581678.5A patent/CN102565252B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1580759A (zh) * | 2003-08-13 | 2005-02-16 | 上海市徐汇区中心医院 | 一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定方法 |
| CN1979155A (zh) * | 2005-11-30 | 2007-06-13 | 上海特敏生物医药科技有限公司 | 一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒 |
| CN101796408A (zh) * | 2007-06-29 | 2010-08-04 | 奎斯特诊断投资公司 | 用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸 |
| CN101430307A (zh) * | 2008-12-18 | 2009-05-13 | 浙江大学 | 一种同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples;Xiangming Guan et al;《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》;20030226;第31卷(第2期);第251-261页 * |
| JP特开2004-222518A 2004.08.12 |
| LC/MS测定中生物样品的基质效应问题;谢家树 等;《药物分析杂志》;20080831;第28卷(第8期);第1386-1389页 * |
| Simultaneous determination of total homocysteine, cysteine, cysteinylglycine, and glutathione in human plasma by high-performance liquid chromatography: Application to studies of oxidative stress;Thomas D. Nolin et al;《Journal of Chromatography B》;20070630;第852卷(第1-2期);第554-561页 * |
| Thomas D. Nolin et al.Simultaneous determination of total homocysteine, cysteine, cysteinylglycine, and glutathione in human plasma by high-performance liquid chromatography: Application to studies of oxidative stress.《Journal of Chromatography B》.2007,第852卷(第1-2期), |
| Xiangming Guan et al.A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples.《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》.2003,第31卷(第2期), |
| 刘罡一 等.用液相色谱-串联质谱法测定血浆总同型半胱氨酸.《药学服务与研究》.2003,第3卷(第4期), |
| 用液相色谱-串联质谱法测定血浆总同型半胱氨酸;刘罡一 等;《药学服务与研究》;20031230;第3卷(第4期);第224-226页 * |
| 谢家树 等.LC/MS测定中生物样品的基质效应问题.《药物分析杂志》.2008,第28卷(第8期), |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102565252A (zh) | 2012-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stokes et al. | Development of a liquid chromatography–mass spectrometry method for the high-accuracy determination of creatinine in serum | |
| Purdie et al. | Analytical applications of circular dichroism | |
| EP1962097A1 (en) | Mass spectrometric quantitative detection of methyl malonic acid and succinic acid using hilic on a zwitterionic stationary phase | |
| CN102147397B (zh) | 一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法 | |
| CN108362795A (zh) | 干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法 | |
| Głowacki et al. | A simple HPLC—UV method for simultaneous determination of cysteine and cysteinylglycine in biological fluids | |
| CN102539595B (zh) | 检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法 | |
| CN102565252B (zh) | 检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法 | |
| CN115902048A (zh) | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法 | |
| Jemal et al. | Liquid chromatography-tandem mass spectrometric quantitative determination of the HIV protease inhibitor atazanavir (BMS-232632) in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC): practical approaches to PBMC preparation and PBMC assay design for high-throughput analysis | |
| CN102565251A (zh) | 检测血清或血纸片中酰基肉碱含量的方法 | |
| CN111458417A (zh) | 联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒 | |
| Jenčo et al. | Development of novel liquid chromatography method for clinical monitoring of vitamin B1 metabolites and B6 status in the whole blood | |
| Zhu et al. | Comprehensive screening and separation of cyclooxygenase-2 inhibitors from Pterocephalus hookeri by affinity solid-phase extraction coupled with preparative high-performance liquid chromatography | |
| Goryński et al. | Developing and Evaluating the Greenness of a Reliable, All-in-One Thin-Film Microextraction Protocol for Determining Fentanyl, Methadone, and Zolpidem in Plasma, Urine, and Oral Fluid | |
| CN110007034A (zh) | 一种基于液相色谱串联质谱测定医用食品中氨基酸的方法 | |
| Abdessadek et al. | Validation steps and parameters of bioanalytical methods using in clinical studies: A narrative review | |
| CN105699575A (zh) | 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒 | |
| CN100414293C (zh) | 一种测定咪唑立宾血药浓度的方法 | |
| Jagtap et al. | Development of novel dynamic drop-to-drop microextraction coupled with GC-MS for the trace level screening of phenothiazine drug in human biological samples | |
| CN116858978B (zh) | 一种同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法及其血浆样品处理方法 | |
| Wang et al. | Advancing towards practice: A novel LC-MS/MS method for detecting retinol in dried blood spots | |
| CN109324140A (zh) | 一种烟叶中玉米素核苷固相萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法 | |
| CN107941960A (zh) | 一种4‑氨基喹哪啶的高效液相色谱分析方法 | |
| CN108037221A (zh) | 用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18aa中蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜杂质的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING HEHE MEDICAL DETECTION INSTITUTE CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: BEIJING GUOLI BOLIN MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD. Effective date: 20150727 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150727 Address after: Beijing City, Chaoyang District Street No. 4 No. 3 3, 4, 5 Patentee after: Beijing hehe medical laboratory Co., Ltd. Address before: 100011 Beijing City, Chaoyang District Street No. 3 (Golden Phoenix Business Center 3) Patentee before: Beijing Guoli Bolin Medical Technology Development Co.,Ltd. |
|
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 101111 Beijing Yizhuang economic and Technological Development Zone by sea six road No. 5 Building No. 14 East Garden E Patentee after: Beijing hehe diagnostic medical technology Limited by Share Ltd Address before: Beijing City, Chaoyang District Street No. 4 No. 3 3, 4, 5 Patentee before: Beijing hehe medical laboratory Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200115 Address after: No.04 and 05, 5 / F, No.02 and 03, 4 / F, building 11, No.228, West Fourth Ring Road, Zhengzhou hi tech Industrial Development Zone, Zhengzhou City, Henan Province Patentee after: Zhengzhou hehe medical laboratory Co., Ltd Address before: 101111 Beijing Yizhuang economic and Technological Development Zone by sea six road No. 5 Building No. 14 East Garden E Patentee before: Beijing hehe diagnostic medical technology Limited by Share Ltd |
|
| TR01 | Transfer of patent right |