CN1979155A - 一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒。该试剂盒包括：添加有稳定剂的样品管、不同Hcy浓度的对照品和质控品血清、DL－高胱氨酸－D8内标溶液、还原剂和三氯乙酸蛋白沉淀剂。本发明用透析方法制备了不含本底、可配制标准曲线的血清，用加稳定剂的专用样品管采集血样，选用了优质还原剂，优化了流动相，使测定方法操作简便，血样杂质对Hcy的定量无干扰。经稳定性考察，证明本发明试剂盒稳定，样品检测专一性强，灵敏度高。可准确、快速地用于开展大规模临床Hcy研究。
Description
技术领域
本发明涉及医药检测领域，具体涉及一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，又称高半胱氨酸，为蛋氨酸代谢的中间产物，目前已被国际医学界认为是一种新的独立致病因子。动物试验结果已表明Hcy能诱导胚胎发生神经管畸形，同时血中Hcy的积蓄可导致血管损害。现有的研究结果已表明某些先天性疾病，弱智，动静脉血栓，慢性肾病，II型糖尿病及阿兹海默氏综合症也常伴有同型半胱氨酸代谢异常。目前在发达国家中，Hcy已为公众所认识并成为临床检测的常规项目，我国近年来有关Hcy的临床研究也已列入国家“863”高科技项目和自然科学基金项目。
目前体内Hcy的定量测定主要有液相色谱—荧光衍生化法和免疫法。液相色谱法具有专一灵敏的特点，是目前临床研究的通用方法，但其操作复杂，技术要求较高。免疫法的操作相对简便，但专一性较差难以满足高水平临床研究的需要，且按人份计算的试剂价格较高。
液相色谱-质谱联用(LC-MS)具有专一性强、灵敏度高的优点，在体内药物分析、新生儿遗传性代谢疾病筛选和临床生化等领域方面均开始有成熟的应用，是近年来获得迅速发展的分析测试技术，已成为临床科研的尖端武器。
本发明人在中国专利申请03142257.8中，公开了一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定方法，该方法根据Hcy的理化性质，对血样采用简便的巯基乙醇即刻还原-三氯醋酸蛋白直接沉淀预处理方法，并采用C18键合相硅胶为固定相，以乙腈-水-三氟乙酸为流动相进行反相色谱等度分离，运用质谱仪进行检测，简便、可靠地对血浆总同型半胱氨酸浓度进行定量检测，各项方法学指标均可满足开展大规模临床Hcy研究的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，在于在中国专利申请03142257.8的基础上，对现有的血浆总同型半胱氨酸浓度检测方法予以改进，提供一种操作简便、专一灵敏的血浆Hcy浓度的定量检测法及配套试剂盒，以满足开展大规模临床Hcy研究的需要。
本发明公开的血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒其组成包括：
1、样品管：添加有0.2μg-20μg作为稳定剂的氟化物、柠檬酸、肝素钠或3-去氮腺苷及其类似物；
2、对照品：Hcy浓度为45、15和5μmol/L的血清或血清冻干品；
3、质控品：Hcy浓度为30μmol/L和20μmol/L的血清或血清冻干品；
4、内标溶液：1μmol/L-100μmol/L的DL-高胱氨酸-D8水溶液或冻干品；
5、还原剂：30mmol/L-100mmol/L的1，4-二硫苏糖醇、三糖磷化氢或二硫代赤藓糖醇水溶液或冻干品；
6、蛋白沉淀剂：1％-50％(w/v)的三氯乙酸水溶液或冻干品。
其中，对照品和质控品为采用经透析的Hcy浓度为0的空白血清，分别加入Hcy化学品配制的不同Hcy浓度的血清样品。
采用本发明试剂盒进行血浆总同型半胱氨酸测定的步骤包括：
1、标准曲线制备：用对照品绘制标准曲线，质控品进行验证；
2、血样采集：采集静脉血至样品管中，室温放置，8小时内离心分离血浆；
3、血样预处理：取分离后的血浆，加入内标溶液和还原剂，旋涡振荡，加入蛋白沉淀剂，旋涡振荡后高速离心，取上清液进样；
4、LC-MS测定：
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描；喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：10L/min，气帘气流速：10L/min，碰撞气流速：9L/min，离子源电压：5500V，离子源温度：400℃；MRM扫描分析，离子选择通道分别为m/z：Hcy 136/90，内标140/94；
液相条件：分析柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱(50×2.1mm，5μm)；流动相A为0.02-0.5％(v/v)甲酸的甲醇溶液，流动相B为0.02-0.5％(v/v)甲酸的水溶液，流动相比例A∶B为10∶90，等度洗脱，流速为0.25ml/min，进样5μl；
5、按内标法以峰面积或峰高计算出样品中总同型半胱氨酸浓度。
本发明血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒，配备了用于制备试剂盒标准曲线的Hcy含量稳定的对照品和质控品。本发明采用透析方法将血清中已有的Hcy洗脱，由此获得不含本底的血清，为精确配制低浓度的Hcy血样标准品提供了可能，使检测结果更为准确。
在室温条件下，血样红细胞能持续合成Hcy释放到血浆中，使测定结果高于实际数值。据报道，室温状态下血浆Hcy增加的速度为每小时1.0μmol/L，相当于在一份含10μmol/L的血样中每小时增加10％。因此即使在采血后1h内离心分取血浆，其准确性已经受到影响。在室温下放置2h以上的全血样品，即已经失去了检测价值。临床上要求血样采集后立即离心分离血清/血浆，或放置在4℃冰箱中保存，应用极为不便。本发明在样品管中添加了稳定剂，如3-去氮腺苷，一种能竞争抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，特异性地阻断Hcy合成途径的化合物，从而可使血样中的Hcy保持稳定。使用本发明稳定剂后，血样室温放置，8小时内离心分离血浆进行测定，可保持样品中Hcy含量稳定。
同型半胱氨酸在体内有多种形式，其中绝大部分Hcy通过二硫键与蛋白质、胱氨酸及Hcy自身结合的氧化型存在，而还原型Hcy约占Hcy总量(tHcy)的1％左右。在测定血浆(清)中Hcy过程中，结合型Hcy经还原剂的作用还原为游离型Hcy，然后进行含量测定。故还原反应过程中各种条件的优化对测定结果的影响至关重要。在中国专利申请03142257.8中使用的还原剂为巯基乙醇。由于巯基乙醇为危险品且操作中的气味较大，使临床使用受到限制。本发明重新对还原剂进行了考察，选择了无毒无臭的1，4-二硫苏糖醇、三糖磷化氢和二硫代赤藓糖醇作为还原剂，达到了与巯基乙醇同样的还原效果。
在采用本发明试剂盒进行血浆总同型半胱氨酸测定中，本发明还优化了LC-MS测定时液相色谱的流动相。在中国专利申请03142257.8中液相色谱的流动相含有三氟醋酸，长期使用会对色谱仪的不锈钢产生局部腐蚀作用，本发明改为甲酸溶液后可有效地避免这一问题。此外本发明比较了乙腈/水/甲酸和甲醇/水/甲酸及乙腈/水/三氟乙酸三种流动相对色谱洗脱行为的影响，结果表明甲醇/水/甲酸流动相系统适合本试验，而流动相中含有乙腈容易使Hcy过早被洗脱，导致Hcy和干扰物的分离较差。故本试验选择C18键合硅胶柱(50mm×2.1mm，5μm)为分析柱，含0.02％甲酸的甲醇和0.02％甲酸的水(v/v＝10/90)为流动相。在该条件下，Hcy的保留时间为1.35min，样品总的分析时间为2.0min。一个工作日即可分析测定至少200个样品，可满足临床和科研上对分析方法快速和高通量的要求。
本发明用透析方法制备了不含本底、可配置标准曲线的血清，用加稳定剂的专用样品管采集血样，选用了优质还原剂，优化了流动相，使测定方法操作简便，血样杂质对Hcy的定量无干扰；最低检测限为0.1μmol/L(信噪比≥5)；精密度试验的RSD小于10％。经-20℃、室温、37℃稳定性考察，证明本发明试剂盒稳定，样品检测专一性强，灵敏度高。可简便、可靠地满足开展大规模临床Hcy研究的需要。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
附图说明
图13-去氮腺苷(3-DZA)对全血样品Hcy含量稳定作用
图2Hcy代表性色谱图
其中A：空白血清，B：中浓度对照品，C：低浓度质控品，D：临床血样
图3Hcy标准曲线
具体实施方式
实施例1
1、试剂盒试剂配制：
样品管：添加有2μg的3-去氮腺苷作为稳定剂；
对照品：经透析的Hcy浓度为0的空白血清，分别加入Hcy化学品配制Hcy浓度为45、15和5μmol/L；
质控品：经透析的Hcy浓度为0的空白血清，分别加入Hcy化学品配制Hcy浓度为30μmol/L和10μmol/L；
内标溶液：DL-高胱氨酸-D8水溶液，浓度为10μmol/L；
还原剂：1，4-二硫苏糖醇水溶液，浓度为75mmol/L；
蛋白沉淀剂：三氯乙酸水溶液，浓度为15％(w/v)
2、血样采集：采集静脉血于样品管中，8小时内离心分离血浆(4000rpm×10min)，室温下保存。
3、样品处理：取50μl待测血浆置于离心管中，加入内标DL-高胱氨酸-D8和1，4-二硫苏糖醇各50μl，混匀，室温下放置10分钟，再加入50μl三氯乙酸，旋涡混合1.0min，15000rpm离心3分钟，吸取上清液5μl进样分析。
4、色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(50mm×2.1mm，5μm)。
流动相：A为0.02％(v/v)甲酸的甲醇溶液，B为0.02％(v/v)甲酸的水溶液，流动相比例A∶B为10∶90，等度洗脱，流速为0.25ml/min。
柱温：25℃。
进样量：5μl。
5、质谱条件：
ESI离子源，正离子扫描；MRM扫描分析，Q1/Q3离子通道分别选择为m/z：136/90amu(Hcy)和140/94amu(内标)。
喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：10L/min，气帘气流速：10L/min，碰撞气流速：9L/min；离子源电压：5500V，离子源温度：400℃。
6、结果计算：采用内标法，以峰面积或峰高计算样品中总同型半胱氨酸浓度。
在此条件下，Hcy和内标的保留时间同为1.35min，一个样品的总分析时间为2.0min，最低检测限为0.1μmol/L(信噪比≥5)，Hcy代表性色谱图(包括空白血清、中浓度对照品、低浓度质控品及临床血样)见图2，相应的峰面积和Hcy含量计算结果列于表1。
表1Hcy代表性样品测定结果
| 样品 | Hcy峰面积 | 内标峰面积 | Hcy含量(μmol/L) |
| 空白血清中浓度对照品低浓度质控品临床血样 | 0492034964445 | 0112461090711037 | 014.810.312.7 |
实施例2
试剂盒、血样的采集及预处理方法除还原剂1，4-二硫苏糖醇水溶液，浓度为100mmol/L外，其他同实施例1，质谱条件也同实施例1。
色谱条件：采用Aquasil十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，流动相A：0.1％甲酸的甲醇溶液，流动相B：0.1％甲酸的水溶液，比例为10∶90；等度洗脱，流速为0.25mL/min，进样5μl。
在此条件下，Hcy和内标的保留时间同为1.05min，一个样品的总分析时间为2.0min，最低检测限为0.1μmol/L(信噪比≥5)。
按内标法以峰面积或峰高计算样品中总同型半胱氨酸浓度。
实施例3
样品管添加肝素钠2μg/支为稳定剂，其余试剂盒、血样的采集及预处理方法同实施例1，色谱和质谱条件也同实施例1。
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中总同型半胱氨酸浓度。
实施例4
试剂盒中还原剂为二硫代赤藓糖醇，浓度为50mmol/L，其余试剂盒、血样的采集及预处理方法同实施例1，色谱和质谱条件也同实施例1。
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中总同型半胱氨酸浓度。
实施例5
试剂盒中样品瓶均为冻干品，使用前分别加入蒸馏水溶解，加入蒸馏水的量如表2所示。
表2试剂盒中冻干品溶解时加水量
| 样品名称 | 对照品 | 质控品 | 内标溶液 | 还原剂 | 蛋白沉淀剂 |
| 加入水量(μl) | 0.4 | 0.8 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
血样的采集及预处理方法同实施例1，色谱和质谱条件也同实施例1。
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中总同型半胱氨酸浓度。
试剂使用后立即放入-20℃冰箱冻结，以便下次再用。
实施例6方法学验证
1、标准曲线和定量范围
在血浆中加入不同量的Hcy标准贮备液，配制成添加浓度分别为5、15、45μmol/L和2.5、5、10、20、40、80、160μmol/L的Hcy血浆2套标准曲线。同时取25个临床血样，与2套不同浓度范围的标准曲线一起按生物样本预处理方法处理后进样。以添加的Hcy浓度为X轴，Hcy与内标的峰面积之比为Y轴，进行线性回归，建立回归方程。结果表明，3点法标准曲线和7点法标准曲线线性回归方程分别为Y＝0.0346X-0.0249(r＝0.9997)和Y＝0.0332X-0.0338(r＝0.9999)。以上述2套标准曲线计算25个临床样品(浓度范围4.6～134.9μmol/L)含量相差2～8％之间(P＞0.05)。说明不同浓度范围的标准曲线线性关系良好，都能准确测定样品中的Hcy含量，故选择简便经济的3点法标准曲线(图3)，各浓度对照品峰面积、计算浓度及准确度结果列于表3。本法的最低检测浓度为0.1μmol/L(S/N≥5)。
表3Hcy对照品测定结果
| 对照品 | Hcy浓度(μmol/L) | Hcy峰面积 | 内标峰面积 | 峰面积比值 | 计算浓度(μmol/L) | 准确度(％) |
| 空白低浓度中浓度高浓度 | 051545 | 01735482615368 | 0106001020010000 | /0.160.471.54 | /5.4514.4045.15 | /109.096.0100.3 |
斜率：0.0346，截距：-0.0249，相关系数：0.9997
2、精密度与准确度
在空白血浆中加入适量的Hcy标准贮备液，配制成添加浓度分别为10和30μmol/L的Hcy质控品。每种浓度配制6份，在同一天内按上述样品处理方法及LC/MS/MS条件进行处理和分析，计算批内准确度和精密度。按上述同样方法，配制10和30μmol/L的质控品各18份，于6周内每周一次取每种浓度的样品各3份，按上述样品处置方法及色谱条件进行处理和分析，计算批间准确度(以回收率表示)和精密度。结果表明(见表4)，本方法批内、批间准确度90～110％，精密度(RSD)均小于10％。
表4精密度及回收率试验
| 添加浓度(μmol/L) | 批内(n＝6) | 批间(n＝18) | ||
| 回收率(％) | 精密度(％) | 回收率(％) | 精密度(％) | |
| 1030 | 94.499.3 | 8.36.7 | 99.2101.5 | 7.96.8 |
实施例7添加3-去氮腺苷对血样Hcy浓度的稳定作用
1、实验方法：
取Na2EDTA为抗凝剂的采血管4支，其中2支加入50μl浓度为100μmol/L的3-去氮腺苷(3-DZA)水溶液，另外2支对应加入50μl水。取A、B健康志愿者血样各5ml，分成2份对应加入上述4支采血管中，轻轻晃动使均匀混合。于室温条件下，从采血后间隔一定的时间(0、1、3、6、12、24、72小时)取血浆，置-20℃下冷冻保存，直至样品分析。
2、试验结果：
结果表明(见表5)，未经离心分离红细胞的血样，在25℃条件下放置，和不加3-去氮腺苷的对照组相比，在采血管中加入3-去氮腺苷可有效地保持全血样品中Hcy含量的稳定。添加3-去氮腺苷组的血样，分离血细胞前，在室温条件下放置6h，可以保持Hcy含量的稳定，即使放置24h，Hcy浓度增加尚不足10％。而对照组在采血后增加趋势明显，3h后增加了2-3μmol/L，已经失去了临床样品检验的意义。从实验结果来看，3-去氮腺苷能使Hcy含量在较长的时间内(24h)保持稳定，但仍在缓慢增加，为了保证测定结果的准确性，建议在6h内将血浆或血清与红细胞分离，于-20℃下冻存直到样品分析。
表5添加3-去氮腺苷对全血样品中Hcy含量的稳定性考察
| 采样时间(h) | Hcy浓度(μmol/L) | |||
| A样 | B样 | |||
| 加3-DZA | 对照组 | 加3-DZA | 对照组 | |
| 0136122472 | 8.78.89.09.39.59.510.7 | 8.79.411.714.218.624.828.8 | 6.76.96.57.06.57.210.8 | 6.77.78.810.513.122.536.1 |
实施例8还原剂条件优化比较试验
1、试剂：
吸取Hcy内标贮备液适量于量瓶中，用水稀释至浓度为15μmol/L；称取1，4-二硫苏糖醇(DTT)适量于量瓶中，以水稀释至需要浓度；巯基乙醇，使用时直接加入。
2、还原剂选择：
对DTT和巯基乙醇进行考察，从还原效率、使用方便程度等方面比较二者的作为Hcy测定还原剂的可行性。按照样品处理方法，50μl血浆中分别加入5μl巯基乙醇和50μlDTT(100mmol/L)，分别对5份血样进行含量测定，经t检验统计分析以比较二者有无差异(表6)。
3、还原条件考察：
取同一份血浆样品，分别对DTT浓度、反应时间和反应温度三个因素进行考察，其中DTT浓度和反应时间分三个水平、反应温度分二个水平(将室温作为第三个拟水平)，以Hcy峰面积为考察指标，进行正交实验(表7)。按照样品处理方法，处理后进样分析。
4、样品处理方法：
取50μl血浆样品，加入内标(15μmol/L)溶液，再分别加入巯基乙醇和DTT溶液各50μl，混匀，放置适当时间，然后加入50μl三氯乙酸(15％)溶液，涡旋振荡30秒，高速离心(16000rpm)3min，取上清溶液进样分析。
5、试验结果
表6两种还原剂还原效果比较
| 还原剂 | Hcy含量(μmol/L) | t检验(双尾) | ||||
| 血样1 | 血样2 | 血样3 | 血样4 | 血样5 | ||
| 巯基乙醇DTT | 6.8937.334 | 10.35810.175 | 8.4928.024 | 7.5957.524 | 10.17910.756 | p＝0.78＞0.05 |
结果表明，用巯基乙醇和DTT作为还原剂测定结果无差异。由于巯基乙醇属危险试剂，具有强烈的刺激性和一定的毒性，操作时需在通风柜中进行，不便在常规实验室使用，二硫苏糖醇则属于普通试剂，不具有巯基乙醇所述缺点，且还原效率无异，故选择二硫苏糖醇为Hcy测定的还原剂。
表7正交试验考察的因素和水平
| 水平 | 因素 | ||
| A | B | C | |
| DTT浓度(mmol/L) | 反应时间(min) | 反应温度 | |
| 123 | 5075150 | 51030 | 室温37℃室温 |
表8正交试验结果
| 试验号 | 因素 | Hcy峰面积 | ||
| A | B | C | ||
| 123456789 | 111222333 | 123123123 | 123231312 | 175021970318400206362239822526220112194222013 |
| K1K2K3△K | 55605655606596610361 | 6014964043629393894 | 619706235262809839 | 影响因素大小：A＞B＞C优选组合：A3B2C3 |
实验结果显示(表8)：以Hcy峰面积为考察指标，还原的最佳条件为DTT浓度150mmol/L，室温下反应10min。由于A2和A3的峰面积总和相差无几，说明75mmol/L的还原剂浓度已经达到饱和，故选择A2为最佳组合中一个因素。最后确定还原反应的最佳条件为A2B2C3，即加入75mmol/L的DTT，室温放置10min。
Claims (3)
1、一种血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括：
1)样品管：添加有0.2μg-20μg作为稳定剂的氟化物、柠檬酸、肝素钠或3-去氮腺苷及其类似物；
2)对照品：Hcy浓度为45、15和5μmol/L的血清或血清冻干品；
3)质控品：Hcy浓度为30μmol/L和20μmol/L的血清或血清冻干品；
4)内标溶液：1μmol/L-100μmol/L的DL-高胱氨酸-D8水溶液或冻干品；
5)还原剂：30mmol/L-100mmol/L的1，4-二硫苏糖醇、三糖磷化氢或二硫代赤藓糖醇水溶液或冻干品；
6)蛋白沉淀剂：1％-50％w/v的三氯乙酸水溶液或冻干品。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其中所述的对照品和质控品为采用经透析的Hcy浓度为0的空白血清，分别加入Hcy化学品配制的不同Hcy浓度的血清样品。
3、一种采用权利要求1所述试剂盒进行血浆总同型半胱氨酸测定的方法，其特征在于该方法为：
1)标准曲线制备：用对照品绘制标准曲线，质控品进行验证；
2)血样采集：采集静脉血于样品管中，室温放置，8小时内离心分离血浆；
3)血样预处理：取分离后的血浆，加入内标溶液和还原剂，旋涡振荡，加入蛋白沉淀剂溶液，旋涡振荡后高速离心，取上清液进样；
4)LC-MS测定：
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描；喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：10L/min，气帘气流速：10L/min，碰撞气流速：9L/min，离子源电压：5500V，离子源温度：400℃；MRM扫描分析，离子选择通道分别为m/z：Hcy 136/90，内标140/94；
液相条件：分析柱为十八烷基硅烷键合硅胶(50×2.1mm，5μm)；流动相A为0.02-0.5％(v/v)甲酸的甲醇溶液，流动相B为0.02-0.5％(v/v)甲酸的水溶液，流动相比例A∶B为10∶90，等度洗脱，流速为0.25mL/min，进样5μl；
5)按内标法以峰面积或峰高计算出样品中总同型半胱氨酸浓度。
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