CN1580759A - 一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血浆总同型半胱氨酸的定量测定方法，其特点为根据Hcy的理化性质，样品预处理方法采用简便的巯基乙醇即刻还原－三氯醋酸蛋白直接沉淀法。采用C18键合相硅胶为固定相，以乙腈－水－三氟乙酸为流动相进行反相色谱等度分离，运用质谱仪进行检测，离子选择通道分别为m/z：136/90(Hcy)，140/94(Hcy－d4)。采用本法可简便、可靠地对血浆总同型半胱氨酸浓度进行定量检测，各项方法学指标均可满足开展大规模临床Hcy研究的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种血浆总同型半胱氨酸的定量测定方法，更具体地说是一种对血浆中总同型半胱氨酸进行高灵敏度定量测定的方法。
背景技术
同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，又称高半胱氨酸，为蛋氨酸代谢的中间产物，目前已被国际医学界认为是一种新的独立致病因子。动物试验结果已表明Hcy能诱导胚胎发生神经管畸形，同时血中Hcy的积蓄可导致血管损害。现有的研究结果已表明某些先天性疾病，弱智，动静脉血栓，慢性肾病，II型糖尿病及阿兹海默氏综合症也常伴有同型半胱氨酸代谢异常。目前在发达国家中，Hcy已为公众所认识并成为临床检测的常规项目，我国近年来有关Hcy的临床研究也已列入国家“863”高科技项目和自然科学基金项目。
目前对体内Hcy的定量测定主要有液相色谱—荧光衍生化法和免疫法两种。液相色谱法具有专一灵敏的特点，是目前临床研究的通用方法，但其操作复杂，技术要求较高。免疫法的操作相对简便，但专一性较差难以满足高水平临床研究的需要，且按人份计算的试剂价格较高。
液相色谱-质谱联用(LC-MS)具有专一性强、灵敏度高的优点，在体内药物分析、新生儿遗传性代谢疾病筛选和临床生化等领域方面均开始有成熟的应用，是近年来获得迅速发展的分析测试技术，已成为临床科研的尖端武器。
发明内容
本发明的目的是采用LC-MS技术建立了一种血浆中Hcy浓度的定量检测法，以满足开展大规模临床Hcy研究的需要。
本发明是这样实现的：
1.血样采集及预处理：
采集的静脉血于30min内离心分离血浆(4000r×10min)，置于-20℃冰柜保存。取血浆50μL置1.5mL具塞的塑料离心管中，加5μL内标(D8-高胱氨酸，D8-Homocystine)溶液，及5μL的巯基乙醇，旋涡振荡1.0min，室温放置2分钟，加入100g·L-1三氯醋酸50μL或乙腈50μL旋涡振荡1.0min，经高速离心17000r×3min后，取上清液进样。
2.LC-MS测定条件：
电喷雾离子源，正离子扫描；喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：10L/min，气帘气流速：10L/min，碰撞气流速：9L/min，离子源电压：5500V，离子源温度：400℃；MRM扫描分析，离子选择通道分别为m/z：136/90(Hcy)，140/94(Hcy-d4)。
液相条件：分析柱为Intersil ODS-3(150×2.1mm，5μm)；流动相A：水-0.01～0.1％(v/v)三氟醋酸，流动相B：乙腈-0.01～0.1％(V/V)三氟醋酸；梯度洗脱：0～0.1min，97～0％A；0.1～1min，0％A；1～1.1min，0～97％A；1.1～9min，97％A。流速为0.2mL·min-1，进样5μL。
本发明预处理方法操作省时简便，血样杂质对Hcy的定量无干扰； 最低检测限为0.1μmol/l(信噪比≥5)；精密度试验的RSD小于10％。样品、检测专一性强、灵敏度高。各项方法学指标均可简便、可靠地满足开展大规模临床Hcy研究的需要。
有益效果：
目前对体内Hcy的定量测定主要有液相色谱-荧光衍生化法和免疫法两种。液相色谱法具有专一灵敏的特点，是目前临床研究的通用方法，但其操作复杂，技术要求较高。免疫法的操作相对简便，但专一性较差难以满足高水平临床研究的需要，且按人份计算的试剂价格较高。
本发明预处理方法操作省时简便，血样杂质对Hcy的定量无干扰；最低检测限为0.1μmol/l(信噪比≥5)；精密度试验的RSD小于10％。样品、检测专一性强、灵敏度高。各项方法学指标均可简便、可靠地满足开展大规模临床Hcy研究的需要。
具体实施方式
实施例1
血样的采集及预处理：采集静脉血于30min内离心分离血浆(4000g×10min)，置于-20℃冰柜保存。样品预处理：取血浆50μL置1.5mL具塞塑料离心管中，加内标(D8-高胱氨酸，D8-Homocystine)溶液5μL，及5μL巯基乙醇旋涡振荡1.0min，室温放置2分钟，加入100g·L-1三氯醋酸75μL旋涡振荡1.0min，经高速离心17000g×3min后，取上清液10μL进样。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描；喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：10L/min，气帘气流速：10L/min，碰撞气流速：9L/min，离子源电压：5500V，离子源温度：400℃；MRM扫描分析，离子选择通道分别为m/z：136.2/46.9(Hcy)，140.2/48.9(Hcy-d4)。
液相条件：分析柱为Intersil ODS-3(150×2.1mm，5μm)；流动相A：水-0.1％三氟醋酸，流动相B：乙腈-0.1％三氟醋酸；梯度洗脱：0～0.1min，97～0％A；0.1～1min，0％A；1～1.1min，0～97％A；1.1～9min，97％A。流速为0.2mL·min-1，进样5μL。
在此条件下，Hcy、Hcy-d4的保留时间同为6.37min，最低检测限为0.1μmol·l-1(信噪比≥5)。
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中总同型半胱氨酸浓度。
实施例2
血样的采集及预处理同上。样品预处理：取血浆50μL置1.5mL具塞塑料离心管中，加内标(D8-高胱氨酸，D8-Homocystine)溶液5μL，及5μL巯基乙醇旋涡振荡1.0min，室温放置2分钟，加入乙腈100μL旋涡振荡1.0min，经高速离心17000g×3min后，取上清液10μL进样。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描；喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：8L/min，气帘气流速：10L/min，碰撞气流速：8L/min，离子源电压：4000V，离子源温度：400℃；MRM扫描分析，离子选择通道分别为m/z：136.2/46.9(Hcy)，140.2/48.9(Hcy-d4)。
液相条件：分析柱为Zorbax Eclipse XDB-C8(50×2.1mm，5μm)；流动相A：水-0.1％三氟醋酸，流动相B：乙腈-0.1％三氟醋酸；等度洗脱：A∶B＝60∶40。流速为0.2mL·min-1，进样5μL。
在此条件下，Hcy、Hcy-d4的保留时间同为1.3min，最低检测限为0.1μmol·l-1(信噪比≥5)。
Claims (3)
1、一种血浆总同型半胱氨酸测定方法，包括：
(1)血样本预处理：
取一定量的血浆，加入一定量内标溶液及一定量巯基乙醇振荡，加入稀三氯醋酸、乙腈或高氯酸等再振荡，高速离心取上清液；
(2)液相分离：
a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相；
b.流动相A
水：0.01～0.1％三氟醋酸
流动相B
乙腈：0.01～0.1％三氟醋酸
等度或梯度洗脱
控制流速
(3)MS测定：
电喷雾离子源，正离子扫描。
2、根据权利要求1所述的血浆总同型半胱氨酸测定方法，其特征在于用100％巯基乙醇还原结合型Hcy。
3、根据权利要求1所述的血浆总同型半胱氨酸测定方法，其特征在于液相分离的流动相为：乙腈∶水∶三氟醋酸，三氟醋酸浓度为0.01～0.1％(V/V)；反相色谱等度或梯度分离。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100465640C (zh) * | 2005-11-30 | 2009-03-04 | 上海特敏生物医药科技有限公司 | 一种高灵敏血浆总同型半胱氨酸测定试剂盒 |
| CN102565252A (zh) * | 2010-12-09 | 2012-07-11 | 北京国立柏林医学科技发展有限公司 | 检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法 |
| ITRM20130317A1 (it) * | 2013-05-31 | 2014-12-01 | Uni Cattolica Del Sacro Cuor E | Metodo per la determinazione dell'omocisteina. |
| CN106442836A (zh) * | 2016-10-09 | 2017-02-22 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法 |
-
2003
- 2003-08-13 CN CN 03142257 patent/CN1580759A/zh active Pending
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