CN102590420A - 一种乳制品中l-羟脯氨酸含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，包括如下步骤：(1)样品预处理：乳制品加酸水解，制得测试液；(2)采用液相色谱-串联质谱联用分析L-羟脯氨酸含量，采用亲水作用色谱柱HILIC，流动相为流动相A与流动相B的混合溶液，流动相A为10mM醋酸铵水溶液，pH＝5.6；流动相B为乙腈，质谱条件：采用电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应检测，电喷雾电压5500V，离子源温度600℃，气帘气压力20Psi，雾化气压力50Psi，辅助气压力30Psi。本发明能够显著提高检测的准确度、灵敏度，操作简便快速地测定乳制品中L-羟脯氨酸含量。

Description

一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法。

背景技术

L-羟脯氨酸，英文名称hydroxyproline，简称HYP，又名反式-4-羟基-L-脯氨酸，分子式为C₅H₉NO₃，分子量131.13。

L-羟脯氨酸是一种亚氨基酸，通常在脯氨酸的第4位上带有羟基，但有时也在第3位上。L-羟脯氨酸是胶原蛋白所特有的氨基酸，约占胶原蛋白中氨基酸总量的10％，而在其他蛋白质中含量甚微，这使得它几乎成为胶原蛋白所特有的成分，因而可通过测定L-羟脯氨酸含量来计算胶原蛋白的含量，从而确定胶原蛋白的总体水平。

动物胶原水解蛋白是一种廉价蛋白原料，是将牛皮及其制品下脚料等成分粗加工后制成的水解蛋白质，皮革水解蛋白粉就是利用皮革下脚料甚至动物毛发等物质，经水解而生成的一种粉状物，因其氨基酸或者说蛋白含量较高，故人们称之为皮革水解蛋白粉。某些非法厂家在乳粉中掺入廉价的水解动物蛋白来冒充或替代乳蛋白质，提高乳中蛋白的质量分数，降低成本。掺加动物胶原水解蛋白不但会影响乳的口感和风味，改变牛乳的溶解度，因其氨基酸的组成不合理，且不易消化，所以营养价值低下，导致人体吸收利用率降低，会严重影响消费者的健康状况。严格来讲皮革水解蛋白粉对人体健康并无伤害，不过其前提条件是所用皮革必须是未经糅制、染色等人工加工处理过的；然而这样的皮革水解蛋白粉是不存在的，因为经过糅制、染色等人工加工处理过的皮革比直接制作成蛋白粉利润要高得多，因而皮革水解蛋白粉多用皮革厂制作服装、皮鞋后的下脚料来生产，自然这种蛋白粉中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，如果长期食用含有皮革水解蛋白粉的食物，铬重金属离子便会被人体吸收、积累、中毒，使人体关节疏松肿大，甚至造成儿童死亡。

L-羟脯氨酸为人体非必需氨基酸，是机体胶原蛋白(动物水解蛋白)的主要成分之一，含量相对稳定，为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10％以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。

目前国内对L-羟脯氨酸的检测方法主要有比色法、电泳法、氨基酸自动分析仪法、高效液相色谱法等。

L-羟脯氨酸的传统测定方法是氯胺T比色法，其基本原理是试样经酸水解，释放出L-羟脯氨酸。经氯胺T氧化，生成含有吡咯环的。先把含有HYP多肽的蛋白质、组织、血清、腹水或尿液等水解成游离的HYP，游离的HYP被氧化后再与对二甲氨基苯甲醛(PDAB)在一定温度下发生反应，生成红色的吡咯氧化物，用高氯酸破坏过量的氯胺T。L-羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558nm处进行通过分光光度计比色测定。氯胺T法的特异性差，灵敏度低，影响因素较多，目前研究及应用的已不多。

柱前衍生高效液相色谱法，主要是先将蛋白水解成L-羟脯氨酸，样品处理最终要求将各肽键断开，释放出游离的L-羟脯氨酸。然后用氨基酸衍生试剂，进行柱前衍生，C18色谱柱分离，通过配紫外检测器或荧光检测器的高效液相色谱仪测定。常见的L-羟脯氨酸衍生剂有邻苯二甲醛、1-氟-2，4-硝基苯、磺酰氯二甲胺偶氮苯、异硫氰酸苯酯等，这些衍生试剂有些还是剧毒的化合物。L-羟脯氨酸衍生步骤比较繁琐，衍生条件限制较多，而且影响检测的准确性，从而限制了其发展前景。另外，也有在200nm波长下直接检测出氨基酸的报道，但检测灵敏度较低，杂质峰干扰较大。

柱后衍生法氨基酸分析仪法，是传统的氨基酸分析方法。前处理与液相法一样，先将蛋白水解成L-羟脯氨酸，样品处理最终要求将各肽键断开，释放出游离的L-羟脯氨酸。然后，利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，将L-羟脯氨酸和其他氨基酸及杂质分离开，洗脱下来的L-羟脯氨酸与茚三酮反应后生成黄色产物，在波长440nm有最大吸收，且保留时间不与其他氨基酸重迭。氨基酸自动分析仪法更加快速、准确、自动化程度和灵敏度高，但此法需专门仪器一氨基酸分析仪，该仪器只能用于分析氨基酸，限制了该仪器广泛配置，从而限制了柱后衍生法氨基酸分析仪法在分析乳制品中L-羟脯氨酸中的广泛应用。

因而，探寻一种检测快速、准确、适用于复杂体系乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，对解决乳制品中非法添加皮革水解蛋白问题，规范乳制品科学规范生产具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，能够显著提高检测的准确度、灵敏度，操作简便快速地测定乳制品中L-羟脯氨酸含量。

本发明的技术问题是通过如下技术方案实现的：

一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，包括如下步骤：

(1)样品预处理：乳制品加酸水解，制得测试液；

(2)采用液相色谱-串联质谱联用分析L-羟脯氨酸含量：

液相条件：

采用亲水作用色谱柱HILIC，柱温：30℃，流速：0.8mL/min，进样量：20μL，

梯度洗脱：流动相为流动相A与流动相B的混合溶液，所述流动相A为10mM醋酸铵水溶液，pH＝5.6；所述流动相B为乙腈，

在0-10min内，流动相A的比例为15％，流动相B的比例为85％；在10-12min内，流动相A的比例由15％升至45％，流动相B的比例由85％降至55％；在12-18min内，流动相A的比例保持在45％，流动相B的比例保持在55％；在18-20min内，流动相A的比例由45％降至15％，流动相B的比例由55％升至85％；以上百分比均为体积百分比；

质谱条件：

采用电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应检测(MRM)，电喷雾电压5500V，离子源温度600℃，气帘气压力20Psi，雾化气压力50Psi，辅助气压力30Psi。

本发明中，所述的乳制品是指本领域常用的乳制品，具体可以分为三种：(1)液态乳制品，如纯牛奶和调制乳；(2)半固体状乳制品，如酸奶和奶酪；(3)固体状乳制品，如奶粉。

本发明中，所述的通过亲水色谱(HILIC)分析柱进行高效液相色谱-串联质谱测定的基本原理是：样品被水解成多种氨基酸，通过采用亲水色谱(HILIC)分析柱分离L-羟脯氨酸和相对分子量一样的氨基酸，串联质谱仪分析，用定性离子对准确定性，定量离子对准确定量。

本发明中，采用的色谱柱为亲水色谱(HILIC)分析柱，是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱的灵敏度。

优选的，

步骤(1)中，当乳制品为液态乳制品时，其样品预处理为：

称取2.0g液态乳制品，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解12～16h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容，转入离心管，8000转/min离心5-10min，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

步骤(1)中，当乳制品为半固体状乳制品时，其样品预处理为：

称取1.5g半固体状乳制品，加入1.0mL蒸馏水混匀，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解12～16h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容，转入离心管中，8000转/min离心5-10min，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

步骤(1)中，当乳制品为固体状乳制品时，其样品预处理为：

称取0.5g固体状乳制品，加入2.0mL蒸馏水复原，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解12～16h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容，转入离心管中，8000转/min离心5-10min，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

进一步优选的，步骤(1)中，水解时间为12h。

在检测过程中，如果上机溶液中L-羟脯氨酸含量高于标准曲线最高浓度时，在前述离心5-10min后，可以进一步用体积百分比20％的10mmol/L乙酸铵水溶液与体积百分比80％的乙腈混合溶液稀释，使上机溶液中L-羟脯氨酸含量落于标准曲线范围内，再过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

步骤(2)中，通过定性离子132.1＞86.0碰撞能量22V、定性离子132.1＞68.2碰撞能量18V进行定性分析，定量离子132.1＞86.0进行定量计算。

相对于现有技术，本发明的特点如下：

1、本发明将乳制品按照本领域常规方法进行水解来提取L-羟脯氨酸，再通过亲水色谱(HILIC)分析柱进行高效液相色谱-串联质谱测定含量。解决了现有测定乳制品中L-羟脯氨酸含量方法的特异性差，受杂质影响大，灵敏度低，定性不够准确，分析时间长，衍生重复性差，定量不够准确等缺陷，提供了一种可以提供丰富的结构信息，显著提高检测的准确度、灵敏度，操作简便快速地测定乳制品中L-羟脯氨酸含量的方法。

2、本发明只需要对样品进行酸水解，调pH值，定容离心，即可测定。整个前处理过程操作简单快速。不需要柱前或柱后衍生时间，解决了衍生受温度、时间影响大，衍生效果不稳定，重复性差的问题。本发明中，L-羟脯氨酸在50ng/mL～2000ng/mL之间，浓度与定量离子132.1＞86.0的峰面积成线性关系，相关系数r＝1(如图4所示)。在纯牛奶中分别添加1.5mg/kg～30mg/kg L-羟脯氨酸，用本发明的实验方法进行测定，回收率为82.5～96.3％，RSD为1.87～5.84％；在酸奶中分别添加1.5mg/kg～30mg/kgL-羟脯氨酸，用本发明的实验方法进行测定，回收率为85.4～97.9％，RSD为1.05～6.07％；在奶粉中分别添加1.5mg/kg～30mg/kgL-羟脯氨酸，用本发明的实验方法进行测定，回收率为80.1～94.0％，RSD为1.78～7.19％；实验结果表明：本发明可以获得精密度显著优于常规方法的检测结果。

3、本发明采用了高效液相色谱-串联质谱联用仪进行分析测定。充分利用了液相色谱的分离能力和质谱的定性定量能力。如图1、2、3所示，通过定性离子132.1＞86.0、132.1＞68.2进行定性分析，定量离子132.1＞86.0进行定量计算，提供丰富的结构信息，解决了比色法特异性差，无法定性分析，高效液相色谱法和氨基酸分析仪法只能靠保留时间定性分析受杂质影响大而导致定性不准的问题。为测定乳制品中L-羟脯氨酸含量提供了一个高准确度的保障。

4、本发明采用了分辨率高的串联质谱检测器进行分析测定。从图5中得出，以信噪比为3∶1时相应的浓度或注入仪器的量确定，检出限为：10ng/mL，定量限为：33ng/mL。在样品中添加最低检出限相当浓度的一系列浓度的标样，来验证方法的灵敏度，本发明方法的实际最低检测限为0.5mg/kg，定量限为1.5mg/kg。本发明为乳制品中L-羟脯氨酸含量提供了一种高灵敏度的检测手段。

附图说明

图1为L-羟脯氨酸标准溶液典型图谱；

图2为不含L-羟脯氨酸的纯牛奶样品的典型图谱；

图3为纯牛奶中加入L-羟脯氨酸标样的典型图谱；

图4为L-羟脯氨酸氨基酸在20μg/L～2000μg/L范围内标样浓度与峰面积成线性关系图；

图5为浓度为10ng/mL的L-羟脯氨酸标准溶液(定量离子132.1＞86.0)的图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

在纯牛奶样品(L-羟脯氨酸未检出)中加入胶原蛋白粉，制得本实施例的液态乳制品模拟阳性样品。

1、样品前处理。

称取2.0g样品，加10.6mol/L盐酸溶液6mL，真空封管，于110℃下水解12h。挥干溶剂，加水溶解，NaOH溶液调节至中性，加水定容至25mL。转入50mL离心管中，8000转/min离心5min，过0.22μm微孔滤膜，待检测。

2、亲水色谱(HILIC)分析柱进行高效液相色谱-串联质谱测定

本发明中，所述的通过亲水色谱(HILIC)分析柱进行高效液相色谱-串联质谱测定的基本原理是：样品被水解成多种氨基酸，通过采用亲水色谱(HILIC)分析柱分离L-羟脯氨酸和相对分子量一样的氨基酸，串联质谱仪分析，用定性离子对准确定性，定量离子对准确定量。

1)色谱条件

色谱柱：HILIC，150x2.1mm，5μm或相当柱；

流动相(v/v)：A醋酸铵(10mM，pH 5.6)；B乙腈；

梯度洗脱：0-10min 85-85％B，10-12min 85-55％B，12-18min 55-55％B，18-20min 85-85％B；

柱温：30℃；

流速：0.8mL/min；

进样量：20μL。

2)质谱条件

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应检测(MRM)；

电喷雾电压(V)：5500；

离子源温度(℃)：600；

气帘气压力(Psi)：20；

雾化气压力(Psi)：50；

辅助气压力(Psi)：30；

定性离子对、定量离子对、碰撞气能力见表1：

表1：定性离子对、定量离子对、碰撞气能量表

通过上述分析方法对同一种阳性样品进行5次分析，每次分析都能够获得准确的图谱和定量信息，对照标准曲线，结果如下表2：

表2：同一种液态乳(纯牛奶)中L-羟脯氨酸含量的测定表

上表中结果计算所得的相对标准偏差RSD＝3.36％。

图1为L-羟脯氨酸标准溶液典型图谱；图2为不含L-羟脯氨酸的纯牛奶样品的典型图谱；图3为纯牛奶中加入L-羟脯氨酸标样的典型图谱。如图1、图2和图3所示，通过定性离子132.1＞86.0、132.1＞68.2进行定性分析，定量离子132.1＞86.0进行定量计算，提供丰富的结构信息，解决了比色法特异性差，无法定性分析，高效液相色谱法和氨基酸分析仪法只能靠保留时间定性分析受杂质影响大而导致定性不准的问题。为测定乳制品中L-羟脯氨酸含量提供了一个高准确度的保障。

实施例2

(1)样品前处理：

称取1.5g市售的酸奶，加入1.0mL蒸馏水混匀，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解16h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容至25mL，转入50mL离心管中，8000转/min离心10min，上清液用体积百分比20％的10mmol/L乙酸铵水溶液稀释5倍，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

(2)亲水色谱(HILIC)分析柱进行高效液相色谱-串联质谱测定，方法与实施例1相同。

通过上述分析方法对同一种阳性样品进行5次分析，每次分析都能够获得准确的图谱和定量信息，对照标准曲线，结果如下表3：

表3：同一种半固体乳制品(酸奶)中L-羟脯氨酸含量的测定表

上表中结果计算所得的相对标准偏差RSD＝1.88％。

实施例3

(1)样品前处理

称取0.5g市售奶粉，加入2.0mL蒸馏水复原，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解14h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容至25mL，转入50mL离心管中，8000转/min离心8min，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

(2)亲水色谱(HILIC)分析柱进行高效液相色谱-串联质谱测定，方法与实施例1相同。

通过上述分析方法对同一种阳性样品进行5次分析，每次分析都能够获得准确的图谱和定量信息，对照标准曲线，结果如下表4：

表4：同一种固体乳制品(奶粉)中L-羟脯氨酸含量的测定表

上表中结果计算所得的相对标准偏差RSD＝5.72％。

图4为L-羟脯氨酸氨基酸在20μg/L～2000μg/L范围内标样浓度与峰面积成线性关系图。如图4所示，本发明中，L-羟脯氨酸在50ng/mL～2000ng/mL之间，浓度与定量离子132.1＞86.0的峰面积成线性关系，相关系数r＝1。在纯牛奶中分别添加1.5mg/kg～30mg/kg L-羟脯氨酸，用本发明的实验方法进行测定，回收率为82.5～96.3％，RSD为1.87～5.84％；在酸奶中分别添加1.5mg/kg～30mg/kgL-羟脯氨酸，用本发明的实验方法进行测定，回收率为85.4～97.9％，RSD为1.05～6.07％；在奶粉中分别添加1.5mg/kg～30mg/kgL-羟脯氨酸，用本发明的实验方法进行测定，回收率为80.1～94.0％，RSD为1.78～7.19％；实验结果表明：本发明可以获得精密度显著优于常规方法的检测结果。

图5为浓度为10ng/mL的L-羟脯氨酸标准溶液(定量离子132.1＞86.0)的图谱。从图5中得出，以信噪比为3∶1时相应的浓度或注入仪器的量确定，检出限为：10ng/mL，定量限为：33ng/mL。在样品中添加最低检出限相当浓度的一系列浓度的标样，来验证方法的灵敏度，本发明方法的实际最低检测限为0.5mg/kg，定量限为1.5mg/kg。本发明为乳制品中L-羟脯氨酸含量提供了一种高灵敏度的检测手段。

毫无疑问，本发明，还可以具有多种变换及改型，并不限于上述实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。

Claims (5)

1.一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品预处理：乳制品加酸水解，制得测试液；

(2)采用液相色谱-串联质谱联用分析L-羟脯氨酸含量：

液相条件：

采用亲水作用色谱柱HILIC，柱温：30℃，流速：0.8mL/min，进样量：20μL，

梯度洗脱：流动相为流动相A与流动相B的混合溶液，所述流动相A为10mM醋酸铵水溶液，pH＝5.6；所述流动相B为乙腈，

在0-10min内，流动相A的比例为15％，流动相B的比例为85％；在10-12min内，流动相A的比例由15％升至45％，流动相B的比例由85％降至55％；在12-18min内，流动相A的比例保持在45％，流动相B的比例保持在55％；在18-20min内，流动相A的比例由45％降至15％，流动相B的比例由55％升至85％；以上百分比均为体积百分比；

质谱条件：

采用电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应检测，电喷雾电压5500V，离子源温度600℃，气帘气压力20Psi，雾化气压力50Psi，辅助气压力30Psi。

2.如权利要求1所述的一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，其特征在于：

步骤(1)中，当乳制品为液态乳制品时，其样品预处理为：

称取2.0g液态乳制品，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解12～16h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容，转入离心管，8000转/min离心5-10min，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

3.如权利要求1所述的一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，其特征在于：

步骤(1)中，当乳制品为半固体状乳制品时，其样品预处理为：

称取1.5g半固体状乳制品，加入1.0mL蒸馏水混匀，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解12～16h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容，转入离心管中，8000转/min离心5-10min，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

4.如权利要求1所述的一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，其特征在于：

步骤(1)中，当乳制品为固体状乳制品时，其样品预处理为：

称取0.5g固体状乳制品，加入2.0mL蒸馏水复原，加10.6mol/L盐酸溶液6-9mL，真空封管，于110℃下水解12～16h，挥发干溶剂，加水溶解，用NaOH溶液调节至中性，加水定容，转入离心管中，8000转/min离心5-10min，过0.22μm微孔滤膜，制得测试液。

5.如权利要求1-4中任一项所述的一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，其特征在于：

步骤(2)中，通过定性离子132.1＞86.0碰撞能量22V、定性离子132.1＞68.2碰撞能量18V进行定性分析，定量离子132.1＞86.0进行定量计算。

Images