CN105929044A - 一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法，采用微波酸水解法对样品进行前处理，然后采用离子色谱法对前处理样品进行色谱柱分析L‑羟脯氨酸的含量。该方法样品处理简单快速，结果准确可靠，方法灵敏度较国标法高，稳定性好，可以准确地测定添加有动物水解蛋白的乳及乳制品中L‑羟脯氨酸的含量，可对动物水解蛋白进行定性定量分析，为乳及乳制品掺假提供了可靠的检测方法。

Description

一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法
技术领域
本发明涉及分析化学的技术领域，具体涉及一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量方法。
背景技术
国家卫生部于2009年2月公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》的通知中明确规定乳及乳制品、含乳饮料中禁止添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白的主体蛋白类型为胶原蛋白，羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸，约占胶原蛋白氨基酸总量的13.63％。乳蛋白质则不含羟脯氨酸，因此常将羟脯氨酸作为奶粉及乳饮料产品掺假与否的证据。
羟脯氨酸的测定方法很多，前处理过程中常见的水解蛋白质的方法有酶水解、酸水解和碱水解。其中酶水解因成本高而很少使用，碱水解会使部分氨基酸发生旋光异构；酸水解较彻底，且不引起消旋，是较为常用的方法，其中最常用的是105℃烘箱酸水解法，但这个方法耗时长，效率低下。除了前处理过程，羟脯氨酸的分析方法主要有比色法、氨基酸自动分析仪测定法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等。其中比色法因其操作简单、经济实用，是目前最为常用的一种方法，但由于缺乏相应的分离手段，容易出现假阳性现象。另外，由于大部分氨基酸没有紫外吸收，因而液相色谱法、氨基酸分析仪都需要先经过衍生才可被检测，整个操作复杂，检测时间久，并且容易污染环境。
发明内容
本发明就是针对上述技术现状，提供一种快速测定乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法。
本发明采用的技术方案为：
一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)采用微波酸水解法对乳及乳制品样品进行前处理：在聚四氟乙烯反应罐中加入待测的乳及乳制品样品、浓度3mol/L的硫酸水溶液，所述硫酸水溶液的体积用量以样品质量计为15mL/g，将反应罐密封后，置于微波消解仪中，设置微波消解仪于100℃反应1min，然后再升到120-180℃的水解温度反应5-45min，反应完毕后，取出反应罐，所得反应液用水定容至50mL，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，所得流出液稀释100倍后，再用0.22μm水系膜过滤，取滤液，待用；
(2)采用离子色谱法对步骤(1)制备的滤液进行检测分析，得到滤液的离子色谱图，滤液的离子色谱图中检测到的L-羟脯氨酸的峰面积与L-羟脯氨酸的标准曲线比较，计算得到滤液中L-羟脯氨酸的含量，相应换算得到乳及乳制品中L-羟脯氨酸的含量。
乳与乳制品指的是所有与奶有关的样品，包括奶粉、液态奶、酸奶等等。更具体的乳制品指的是使用牛乳或羊乳及其加工制品为主要原料，加入或不加入适量的维生素、矿物质和其他辅料，使用法律法规及标准规定所要求的条件，加工制作的产品。乳制品包括液体乳(巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳、发酵乳等)；乳粉类(全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉、牛初乳粉等)；炼乳类；乳脂肪类(稀奶油、奶油等)；干酪类；乳冰淇淋类；其他乳制品类(干酪素、乳清粉、乳糖、奶片等)。这都是本领域技术人员公知的食品分类名称。
所述的步骤(1)中的水解温度为120-180℃，优选为150-160℃，更优选155℃。
所述的步骤(1)中水解温度下的反应时间为5-45min，优选为25-35min，更优选30min。
所述步骤(1)中，所得反应液用水定容至50mL，一般可将反应液转移至50mL离心管中，随后用水分3次洗涤反应罐，再用水定容至50mL。这是本领域公知的洗涤定容方法。
所述步骤(2)中，离子色谱法优选采用ICS-5000离子色谱仪，脉冲安培检测器检测。
所述步骤(2)中，L-羟脯氨酸的标准曲线可按照常规方法制作，一般按照以下操作：配制不同浓度的L-羟脯氨酸标准溶液，按照步骤(2)分析滤液同样的方法用离子色谱法进行检测，得到L-羟脯氨酸标准溶液的离子色谱图，以L-羟脯氨酸标准溶液的离子色谱图中L-羟脯氨酸的峰面积为纵坐标，L-羟脯氨酸标准溶液的浓度为横坐标，制作得到L-羟脯氨酸的标准曲线。
所述的步骤(2)中采用的色谱柱为Thermo AminoPacTM PA10分析柱(2mm×250mm)，AminoPacTM PA10保护柱(2mm×50mm)。
所述的步骤(2)中脉冲安培检测器中，工作电极采用金电极，参比电极采用pH电极，氨基酸检测电位。
所述的步骤(2)中，离子色谱法中，色谱柱的流速为0.25mL/min；柱温为30℃；进样体积为25μL。
所述的步骤(2)中，离子色谱法采用NaOH/NaOAc/HOAc梯度洗脱，淋洗液梯度程序如下表1。
表1：淋洗液梯度程序
注:一般出峰在7～9分钟,为了洗柱和平衡，必须进行后续得操作,这样才能进下一针.
与现有技术相比，该方法的优点如下：
(1)样品前处理的时间大大缩短，从传统法的16h缩短至1h以内。
(2)该方法样品处理简单快速，结果准确可靠，方法灵敏度较国标法高，稳定性好。
(3)该方法可以准确地测定添加有动物水解蛋白的乳及乳制品中L-羟脯氨酸的含量，可对动物水解蛋白进行定性定量分析，为乳及乳制品掺假提供了可靠的检测方法。
附图说明
图1比色法检测L-羟脯氨酸的标准曲线图。
图2离子色谱法检测L-羟脯氨酸的标准曲线图。
图3外加标L-羟脯氨酸浓度为0.050μg/mL阴性样品的离子色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
1.1实施方案所使用的试剂、仪器与耗材如下：
Thermo ICS-5000离子色谱仪(包括DP四元梯度泵和SP单泵，DC控制单元，EG淋洗液发生器，AS自动进样器)、Chromeleon 6.8色谱工作站、Elix Advantage纯水系统(美国密理博公司)、Milli-Q Direct超纯水系统(美国密理博公司)、DGG-9053AD电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)、HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)、723PCS可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)、TOPEX全能型微波化学工作平台(上海屹尧仪器科技发展有限公司)、Vortex-Genie 2漩涡混合器(美国思博明科学器材公司)、SK8210HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)、SARTORIOUS QUINTIX213-1CN电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、Mettler Toledo XS205DualRange分析天平(梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司)、Eppendorf Research移液枪(20～200μL，500～1000μL，5000μL)(德国艾本德股份公司)。Bond Elut C18柱(Agilent)、WondaDisc水系针头滤器MCE 0.22μm(Shimadzu-GL)。NaOH(色谱纯，Fluka)、乙酸钠(色谱纯，Thermo)、L-羟脯氨酸(优级纯，Sigma)、氢氧化钠，冰乙酸，硫酸，4-(二甲氨基)苯甲醛，明胶，氯胺-T，正丙醇，异丙醇，三氯乙酸，一水柠檬酸，无水乙酸钠(分析纯，沪试)。
2实验方法
2.1样品预处理
2.1.1对比方法：传统烘箱酸水解法
在50mL塑料离心管中加入0.4g奶粉样品、500μL明胶溶液(15g/L)、6mL硫酸溶液(3mol/L)，盖紧管盖，随后在漩涡混合器中混合均匀。在105℃烘箱中放置16h，反应完毕，取出离心管，趁热加水至40mL，待冷却后用水定容至50mL，为传统烘箱酸水解液，在漩涡混合器中混合1min，经中速滤纸过滤，取滤液，稀释10倍，待用。
注：本实施例中采用的奶粉样品为阴性样品，是不掺杂明胶的，为了验证本发明的可靠性和准确性，额外在样品中加入明胶进行实验。
2.1.2实施方案方法：微波酸水解法
在聚四氟乙烯反应罐中加入0.4g奶粉样品、500μL明胶溶液(15g/L)、6mL硫酸溶液(3mol/L)，盖紧罐顶，置于微波消解器中，设置温度梯度为100℃1min、水解温度155℃30min。反应完毕，取出反应罐，将反应液转移至50mL离心管中，随后用30mL水分3次洗涤反应罐，待冷却后用水定容至50mL，为微波酸水解液，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，然后稀释100倍，再用0.22μm水系膜过滤，取滤液，待用。
2.2检测方法：
2.2.1对比方法：比色法
1试剂准备
(1)缓冲溶液：用500mL水溶解26.0g一水柠檬酸、14.0g氢氧化钠、78.0g无水乙酸钠并转入1L的容量瓶，加入250mL正丙醇，用水定容至刻度。
(2)氯胺T溶液：用100mL上述配制的缓冲溶液溶解1.41g氯胺T，临用时现配。
(3)显色剂：称取10.0g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸水溶液[60％(m/m)]溶液溶解，然后缓慢加入65mL异丙醇。临用时现配。
2反应与比色
分别移取步骤2.1.1和步骤2.1.2采用两种方法得到的滤液4.00mL于25mL比色管中，加入2.00mL氯胺T溶液，混合后在室温下放置20min。随后加入2.00mL显色剂于比色管中，混合后迅速放入60℃水浴中，加热20min。在558nm处用分光光度计测定吸光度。
2.2.2实施方案方法：离子色谱法
步骤2.1.1和步骤2.1.2采用两种方法得到的滤液分别用离子色谱法进样分析，色谱条件如下：色谱柱：Thermo AminoPacTM PA10分析柱(2mm×250mm)，AminoPacTM PA10保护柱(2mm×50mm)；检测器：脉冲安培检测器，金工作电极，pH参比电极，氨基酸检测电位；流速：0.25mL/min；柱温：30℃；进样体积：25μL。
淋洗液梯度程序见下表2。
表2：淋洗液梯度程序
3实验结果：
明胶中的羟脯氨酸含量与水解液中的羟脯氨酸含量不等，查阅文献发现明胶中的羟脯氨酸含量(m/m)一般为11-13％。
水解液中的羟脯氨酸含量，w(μg/mL)＝c×n
明胶中的羟脯氨酸含量，
c为测定的羟脯氨酸的浓度(μg/mL)；
n为稀释倍数，其中比色法为10，离子色谱法为100；
m为明胶质量(g)。
水解液中L-羟脯氨酸含量根据标准曲线计算。
分别配制L-羟脯氨酸含量为0.500、1.000、1.500、2.000μg/mL的系列标准溶液，按比色法的测定方法进行测定，以吸光度(y，Abs)对浓度(x，μg/mL)进行线性回归，计算得y＝0.21833x，r＝1.000，比色法的标准曲线如图1所示。
分别配制L-羟脯氨酸含量为0.050、0.100、0.150、0.200μg/mL的系列标准溶液，按离子色谱法的测定方法进行测定，以L-羟脯氨酸的峰面积值(y，nC·min)对浓度(x，μg/mL)进行线性回归，计算得y＝18.42707x，r＝0.999，离子色谱法的标准曲线图如图2所示。
根据标准曲线计算，步骤2.1.2奶粉样品采用微波水解法进行处理，155℃水解温度下，离子色谱法检测，水解液中的羟脯氨酸含量为1.695μg/mL，折合L-羟脯氨酸在明胶中的含量为11.30％。
实施例2：
用步骤2.1.2的微波水解法作为样品前处理方法，但改变水解温度分别为120℃、140℃、145℃、150℃，分别采用步骤2.2.1比色法和2.2.2离子色谱法检测水解液中L-羟脯氨酸含量的含量，结果如表3。
表3
结果表明，
a.水解温度在120～150℃间时，样品因水解不彻底，导致计算结果偏低。
b.其中120℃水解组中，两种测定方法的数值相差较大，是因为对于比色法而言，该浓度已小于其定量限，测定数值不准确；而对于离子色谱法法，该浓度大于其定量限，测定数值可靠。
c.除120℃水解组，其余温度水解组中，2种测定方法计算数值较为接近，说明2种测定方法结果一致，没有误差。
实施例3
按实施例1步骤2.1.1传统酸水解法和2.1.2微波酸水解法对奶粉样品进行前处理，所不同的是，将加入的500μL的15g/L明胶溶液分别替换为250、500、1000μg的L-羟脯氨酸，，然后将所得水解液均用实施例1步骤2.2.1的比色法进行检测，并作6次平行，计算羟脯氨酸的回收率和精密度，结果如表4所示。
表4
回收率计算公式如下(阴性样品中不含羟脯氨酸)：
c1为测定的水解液中羟脯氨酸的浓度(μg/mL)；
n为稀释倍数，其中比色法为10，离子色谱法为100；
m1为加入的羟脯氨酸质量(mg)。
实施例4
将实施例1步骤2.1.2的微波酸水解法加入的500μL的15g/L明胶溶液分别替换为500μL的0.050、0.100、0.200μg/mL的L-羟脯氨酸系列标准溶液，然后按微波酸水解-离子色谱法分别测定其回收率，并作6次平行。结果表明3者平均回收率分别为92.93、102.47和94.48％，RSD分别为3.57、4.88、1.18％，说明仪器、加标阴性样品较稳定，加标回收率较好。当加标浓度为0.025μg/mL时，但由于相邻峰的干扰，导致目标峰峰形不佳，因而确定其定量限(LOQ)为0.050μg/mL，得峰面积为0.885nC·min(离子色谱图见图3)。根据内标法，在阴性样品的基础上逐级加入不同浓度的L-羟脯氨酸标准品，直至与相邻峰无法分开，确定检出限(LOD)为0.015μg/mL。
实施例5
取正规渠道购买的不同乳制品样品，分别为奶粉、酸奶、炼乳、干酪，前处理方法如下：
在聚四氟乙烯反应罐中加入0.4g样品、6mL硫酸溶液(3mol/L)，盖紧罐顶，置于微波消解器中，设置温度梯度为100℃1min、水解温度155℃30min。反应完毕，取出反应罐，将水解液转移至50mL离心管中，随后用30mL水分3次洗涤反应罐，待冷却后用水定容至50mL，为微波酸水解液，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，然后稀释100倍，再用0.22μm水系膜过滤，取滤液，待用。
检测方法按照实施例1的步骤2.2.2离子色谱法，检测得到上述四种样品的水解液中L-羟脯氨酸的含量均为0，未检出L-羟脯氨酸，均为合格产品。

Claims (10)

1.一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)采用微波酸水解法对乳及乳制品样品进行前处理：在聚四氟乙烯反应罐中加入待测的乳及乳制品样品、浓度3mol/L的硫酸水溶液，所述硫酸水溶液的体积用量以样品质量计为15mL/g，将反应罐密封后，置于微波消解仪中，设置微波消解仪于100℃反应1min，然后再升到120-180℃的水解温度反应5-45min，反应完毕后，取出反应罐，所得反应液用水定容至50mL，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，所得流出液稀释100倍后，再用0.22μm水系膜过滤，取滤液，待用；
(2)采用离子色谱法对步骤(1)制备的滤液进行检测分析，得到滤液的离子色谱图，滤液的离子色谱图中检测到的L-羟脯氨酸的峰面积与L-羟脯氨酸的标准曲线比较，计算得到滤液中L-羟脯氨酸的含量，相应换算得到乳及乳制品中L-羟脯氨酸的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，水解温度为150-160℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，水解温度为155℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，水解温度下的反应时间为25-35min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，离子色谱法采用ICS-5000离子色谱仪，脉冲安培检测器检测。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，L-羟脯氨酸的标准曲线按照以下方法操作：配制不同浓度的L-羟脯氨酸标准溶液，按照步骤(2)分析滤液同样的方法用离子色谱法进行检测，得到L-羟脯氨酸标准溶液的离子色谱图，以L-羟脯氨酸标准溶液的离子色谱图中L-羟脯氨酸的峰面积为纵坐标，L-羟脯氨酸标准溶液的浓度为横坐标，制作得到L-羟脯氨酸的标准曲线。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，离子色谱法采用的色谱柱为Dionex AminoPacTM PA10分析柱：2mm×250mm，AminoPacTM PA10保护柱：2mm×50mm。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，脉冲安培检测器中，工作电极采用金电极，参比电极采用pH电极，氨基酸检测电位。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，离子色谱法中，色谱柱的流速为0.25mL/min；柱温为30℃；进样体积为25μL。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，离子色谱法采用NaOH、醋酸钠、醋酸梯度洗脱，梯度程序如下表：
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