CN107121326B - 红细胞放散用的快速酸放散法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开红细胞放散用的快速酸放散法，用于放散红细胞表面结合的抗体，属于医学检测技术领域。所述快速酸放散法包括步骤：红细胞的预处理、洗脱红细胞上的抗体、中和、取红细胞上放散下来的放散液进行检测；所述红细胞放散用的快速酸放散法采用的试剂包括洗脱液和中和液；所述洗脱液的制备步骤包括：①称取1.0‑10.0g氯化钠和10.0‑20.0g甘氨酸,用蒸馏水或去离子水溶解，用盐酸调节PH值至1.9‑2.5，定容至1000ml；②称取0.3‑1.0g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按250‑300:1比例混匀后存储于2～30℃的温度中。该快速酸放散法具有操作简洁、放散红细胞表面抗体快速完全的特点。
Description
〖技术领域〗
本发明属于医学检测技术领域，涉及用于待测样本的预处理，使样本中的待测物从与其他物质结合的状态中释放出来，以便于使用体外诊断试剂或仪器对待测物进行检测的红细胞放散用快速酸放散法。
〖背景技术〗
放散实验是检测新生儿溶血病的一个常规检测方法，采用放散的方法将致敏红细胞上吸附的抗体放散下来进行分析，鉴别诊断ABO血型系统和Rh血型系统新生儿溶血病。目前国内临床主要应用的是热放散方法，但热放散方法存在耗时长，操作复杂、灵敏度低等缺陷。AABB(美国血库协会)手册强烈推荐应用酸放散法，而目前国内试剂由三个试剂组成(通俗称为三步法)，其中洗脱液由二种试剂分开保存，使用前需要提前准备工作液，临用新配，配制时间稍长就会出现白色沉淀，引起试剂失效，步骤繁琐，且经此方法从红细胞上放散下来的放散液检测灵敏度不高，使得临床使用非常不方便。
〖发明内容〗
本发明旨在克服酸放散三步法的不足，提供一种质量稳定且操作简便的酸放散法以及只需二步操作快速完全放散红细胞表面抗体的红细胞放散用快速酸放散法。
本发明采用的技术方案如下：红细胞放散用的快速酸放散法，用于放散红细胞表面结合的抗体，采用本方法无需使用前配制洗脱液，洗脱液可直接使用，所述快速酸放散法包括步骤：红细胞的预处理、洗脱红细胞上的抗体、中和、取红细胞上放散下来的放散液检测；
所述红细胞放散用的快速酸放散法需要用到的试剂包括洗脱液和中和液；
所述洗脱液的制备步骤包括：①称取1.0-10.0g氯化钠、10.0-20.0g甘氨酸和,用蒸馏水或去离子水溶解，用盐酸调节PH值至1.9-2.5，定容至1000ml；②称取0.3-1.0g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按250-300：1比例混匀后存储于2～30℃的温度中；
所述中和液的制备步骤包括：①称取1.0-10.0g氯化钠、10.0-20.0g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水或去离子水溶解，用盐酸调节PH值至8.9-9.5，定容至1000ml，存储于2～30℃的温度中。中和液用于中和洗脱液，通过颜色反应判定是否中和完全。
进一步的，所述红细胞的预处理是指：取待检血样离心分离血浆，尽可能去除血浆，确保至少有1ml的压积红细胞。用生理盐水洗涤待检红细胞4-5次，最后1次去尽上清，收集压积红细胞，留取最后一次洗涤液1ml。
进一步的，所述洗脱红细胞上的抗体是指：取洗涤后的压积红细胞1ml，直接加入1ml(若压积红细胞<1ml，则加等量洗脱液)洗脱液混合均匀，室温下反应10-15秒(将试管倒置4-5次轻轻混合)，立即以3400rpm(离心力900-1000×g)离心1分钟。
离心完成后，迅速分离红细胞和上清液(红细胞浸泡在洗脱液中时间过长会引起红细胞变性)，用吸管吸取上清液转移入另一试管。
进一步的，所述中和是指：分离的上清液中滴入中和液，边滴边摇匀，液体颜色由黄色变为蓝色即可(此时pH值已调节至接近中性)。
进一步的，所述检测取红细胞上放散下来的放散液进行检测是指：取分离后的上清液以3400rpm(离心力900-1000×g)离心1分钟，此时上清液即为红细胞放散液，标记清楚用于做抗体检测。
将洗涤步骤中留取的最后一次洗涤液和检测步骤中的红细胞放散液做平行检测。(若最后一次洗涤液出现阳性反应，则需重取标本重新彻底洗涤红细胞后再进行放散试验检测)
检测原理：红细胞在低pH值的甘氨酸溶液中，红细胞膜表面的抗原以及其所结合的抗体均带有正电荷而互相排斥，使得结合在红细胞上的抗体解离下来，离心取上清，经中和液调节pH近中性后，再离心取上清，此上清液便含有红细胞上解离下来的抗体，可用于抗体筛查或鉴定实验；解离后的红细胞经洗涤后可用于血型定型。
本发明提供红细胞放散用的快速酸放散法有益效果在于：
1)红细胞放散用的快速酸放散法采用洗脱液和中和液二种试剂，洗脱液由二剂变为一剂可直接制备，操作方法由原来的三步法变成二步法，无需提前准备工作液，操作更简便快速，弥补了三步法检测步骤繁琐的不足；
2)通过调整洗脱液配方，提高洗脱抗体的完全性，增加放散液的灵敏度：洗脱液洗脱抗体的能力决定了放散液的灵敏度，从而提高了诊断的准确性。
〖具体实施方式〗
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
红细胞放散用的快速酸放散法采用的试剂包括洗脱液和中和液。洗脱液的主要成分为甘氨酸、溴甲酚紫；中和液的主要成分为三羟甲基氨基甲烷。
所述洗脱液的制备步骤包括：①称取1.0g氯化钠和10.0g甘氨酸,用蒸馏水溶解，用盐酸调节PH值至1.9，定容至1000ml；②称取0.3g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按250：1比例混匀后存储于2℃的温度中；
所述中和液的制备步骤包括：①称取1.0g氯化钠、10.0g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解，用盐酸调节PH值至8.9，定容至1000ml，存储于2℃的温度中。中和液用于中和洗脱液，通过颜色反应判定是否中和完全。
应用该放散法进行红细胞表面结合抗体的放散，所述快速酸放散法包括步骤：红细胞的预处理、洗脱红细胞上面的抗体、中和、取红细胞上放散下来的放散液进行检测；
红细胞的预处理：取待检血样离心分离血浆，尽可能去除血浆，确保至少有1ml的压积红细胞。用生理盐水洗涤待检红细胞4-5次，最后1次去尽上清，收集压积红细胞，留取最后一次洗涤液1ml。
洗脱红细胞上面的抗体：取洗涤后的压积红细胞1ml，加入1ml(若压积红细胞<1ml，则加等量洗脱液)洗脱液混合均匀，室温下反应10-15秒(将试管倒置4-5次轻轻混合)，立即以3400rpm(离心力900-1000×g)离心1分钟。离心完成后，迅速分离红细胞和上清液(红细胞浸泡在洗脱液中时间过长会引起红细胞变性)，用吸管吸取上清液转移入另一试管。
中和：分离的上清液中滴入中和液，边滴边摇匀，液体颜色由黄色变为蓝色即可(此时pH值已调节至接近中性)。取红细胞上放散下来的放散液进行检测：取分离后的上清液以3400rpm(离心力900-1000×g)离心1分钟，此时上清液即为红细胞放散液，标记清楚用于做抗体检测；将洗涤步骤中留取的最后一次洗涤液和检测步骤中的红细胞放散液做平行检测。(若最后一次洗涤液出现阳性反应，则需重取标本重新彻底洗涤红细胞后再进行放散试验检测)
实施例2
红细胞放散用的快速酸放散法采用的试剂包括洗脱液和中和液。洗脱液的主要成分为甘氨酸、溴甲酚紫；中和液的主要成分为三羟甲基氨基甲烷。
所述洗脱液的制备步骤包括：①称取10.0g氯化钠和20.0g甘氨酸,用去离子水溶解，用盐酸调节PH值至2.5，定容至1000ml；②称取1.0g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按300:1比例混匀后存储于30℃的温度中；
所述中和液的制备步骤包括：①称取10.0g氯化钠、20.0g三羟甲基氨基甲烷用去离子水溶解，用盐酸调节PH值至9.5，定容至1000ml，存储于30℃的温度中。中和液用于中和洗脱液，通过颜色反应判定是否中和完全。
红细胞放散用的快速酸放散法同实施例1。
实施例3
红细胞放散用的快速酸放散法采用的试剂包括洗脱液和中和液。洗脱液的主要成分为甘氨酸、溴甲酚紫；中和液的主要成分为三羟甲基氨基甲烷。
所述洗脱液的制备步骤包括：①称取5.0g氯化钠和15.0g甘氨酸,用蒸馏水溶解，用盐酸调节PH值至2.2，定容至1000ml；②称取0.7g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按比例275：1混匀后存储于16℃的温度中；
所述中和液的制备步骤包括：①称取5.0g氯化钠、15.0g三羟甲基氨基甲烷用去离子水溶解，用盐酸调节PH值至9.2，定容至1000ml，存储于16℃的温度中。中和液用于中和洗脱液，通过颜色反应判定是否中和完全。
红细胞放散用的快速酸放散法同实施例1。
实施例4
红细胞放散用快速酸放散法包括洗脱液和中和液。洗脱液的主要成分为甘氨酸、溴甲酚紫；中和液的主要成分为三羟甲基氨基甲烷。
所述洗脱液的制备步骤包括：①称取3.0g氯化钠和12.0g甘氨酸,用去离子水溶解，用盐酸调节PH值至2.4，定容至1000ml；②称取0.8g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按比例275：1混匀后存储于25℃的温度中；
所述中和液的制备步骤包括：①称取8.0g氯化钠、18.0g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解，用盐酸调节PH值至9.0，定容至1000ml，存储于25℃的温度中。中和液用于中和洗脱液，通过颜色反应判定是否中和完全。
红细胞放散用的快速酸放散法同实施例1。
实施例5
红细胞放散用快速酸放散法包括洗脱液和中和液。洗脱液的主要成分为甘氨酸、溴甲酚紫；中和液的主要成分为三羟甲基氨基甲烷。
所述洗脱液的制备步骤包括：①称取7.0g氯化钠和18.0g甘氨酸,用蒸馏水溶解，用盐酸调节PH值至2.0，定容至1000ml；②称取0.4g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按比例280：1混匀后存储于10℃的温度中；
所述中和液的制备步骤包括：①称取2.0g氯化钠、12.0g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解，用盐酸调节PH值至9.4，定容至1000ml，存储于10℃的温度中。中和液用于中和洗脱液，通过颜色反应判定是否中和完全。
红细胞放散用的快速酸放散法同实施例1。
以上实施例仅为充分公开而非限制本发明，凡基于本发明的创作主旨、未经创造性劳动的等效技术特征的替换，应当视为本申请揭露的范围。
Claims (5)
1.红细胞放散用的快速酸放散法,用于放散红细胞表面结合的抗体，其特征在于，所述快速酸放散法包括步骤：红细胞的预处理、洗脱红细胞上的抗体、中和、取红细胞上放散下来的放散液进行检测；
所述红细胞放散用的快速酸放散法采用的试剂由洗脱液和中和液组成；
所述洗脱液的制备步骤包括：①称取1.0-10.0g氯化钠和10.0-20.0g甘氨酸,用蒸馏水或去离子水溶解，用盐酸调节PH值至1.9-2.5，定容至1000ml；②称取0.3-1.0g溴甲酚紫溶于100ml0.01mol/L氢氧化钠溶液中；将①和②按250-300:1比例混匀后存储于2～30℃的温度中；
所述中和液的制备步骤包括：①称取1.0-10.0g氯化钠、10.0-20.0g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水或去离子水溶解，用盐酸调节PH值至8.9-9.5，定容至1000ml，存储于2～30℃的温度中。
2.如权利要求1所述的快速酸放散法，其特征在于，所述红细胞的预处理是指：取待检血样离心分离血浆，确保至少有1ml的压积红细胞；
用生理盐水洗涤待检红细胞4-5次，最后1次去尽上清，收集压积红细胞，留取最后一次洗涤液1ml。
3.如权利要求1所述的快速酸放散法，其特征在于，所述洗脱红细胞上的抗体是指：取洗涤后的压积红细胞1ml，直接加入1ml洗脱液混合均匀，室温下反应10-15秒，立即以3400rpm离心1分钟；
离心完成后，迅速分离红细胞和上清液，用吸管吸取上清液转移入另一试管。
4.如权利要求1所述的快速酸放散法，其特征在于，所述中和是指：分离的上清液中滴入中和液，边滴边摇匀，液体颜色由黄色变为蓝色即可。
5.如权利要求1所述的快速酸放散法，其特征在于，所述取红细胞上放散下来的放散液进行检测是指：取分离后的上清液以3400rpm离心1分钟，此时上清液即为红细胞放散液，标记清楚用于做抗体检测；
将洗涤步骤中留取的最后一次洗涤液和检测步骤中的红细胞放散液做平行检测。
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