CN105842450A - 一种蓝舌病抗体竞争液及其对应的快速elisa检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蓝舌病抗体竞争液及其对应的快速ELISA检测方法，其中本发明中的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，包括以下步骤：基于BTV抗原固化板通过待检抗体和抗体竞争液竞争得到抗原位点；基于抗原位点进行底物显色，本发明在保持原来BTV C‑ELISA的敏感性和重复性的前提下，简化实验步骤至2步，缩短诊断时间至1小时内，使得蓝舌病血清抗体的检测更加方便和快速。

Description

一种蓝舌病抗体竞争液及其对应的快速 ELISA 检测方法
技术领域
本发明涉及蓝舌病病毒领域，尤其涉及一种蓝舌病抗体竞争液及其对应的快速ELISA检测方法。
背景技术
蓝舌病（Blue Tongue, BT）是由蓝舌病病毒(Blue Tongue Virus, TV)引起的、由库蠓传播的反刍动物病毒性传染病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类动物疫病。蓝舌病血清学检测是动物进出口检验的重要项目，血清学检测是指通过检测蓝舌病感染动物后产生的抗体来区别健康动物和感染动物的方法，目前，国际上使用的蓝舌病血清学检测方法有间接蓝舌病酶连免疫吸附实验（ELISA）和蓝舌病琼脂扩散实验方法（AGID）,其中AGID方法由于敏感性不够，已经逐步被ELISA方法代替。ELISA基本原理是:把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
常用的BTV 间接ELISA方法主要有竞争ELISA（C-ELISA）阻断ELISA(B-ELISA)两种, 这些ELISA方法基本上包括抗体包被、抗原吸附、待检血清BTV抗体阻断或者竞争检测抗体、二抗反应、底物显色5个步骤。 两种ELISA方法的敏感性和重复性都能够达到检测要求，但是检测时间较长，其中B-ELISA要4个小时，C-ELISA要3个小时的时间。
发明内容
鉴于目前技术存在的上述不足，本发明提供一种蓝舌病抗体竞争液及其对应的快速ELISA检测方法，本发明把蓝舌病病毒抗体的ELISA的检测步骤减少到只包括反应和显色2步，45分钟完成实验，而实验的敏感性和重复性和常规的BTV C-ELISA、B-ELISA相同，该方法能够极大的提高蓝舌病抗体检测水平，降低BTV抗体检测的难度，提升BTV抗体检测工作效率。
本发明采用如下技术方案：
一种蓝舌病抗体竞争液，包括以下原料组成：BTV单抗，抗鼠HPR酶标二抗，阴性牛血清，硫柳汞，蛋白保护剂。
本发明的另一面，一种蓝舌病抗体竞争液的配制方法，包括以下步骤：
在C-ELISA的基础上使用抗原固化板，将BTV单抗直接包被在抗原固化板上提供检测使用，通过真空干燥包装使抗原固定板能够在4°C保存1年以上；
将C-ELISA中的BTV单抗和抗鼠HPR酶标二抗整合成抗体竞争液。
作为本发明的优选技术方案，其中抗原固化板的制备包括以下步骤：
通过蔗糖梯度离心获得纯化蓝舌病病毒；
用0.05M PH9.6碳酸缓冲液稀释病毒，包被板过夜；
将包被板进行真空干燥包装，放入4°C备用。
本发明的再一面，一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，包括以下步骤：
基于BTV抗原固化板通过待检抗体和抗体竞争液竞争得到抗原位点；
基于抗原位点进行底物显色。
作为本发明的优选技术方案，所述基于BTV抗原固化板通过待检抗体和抗体竞争液竞争得到抗原位点的步骤还包括：
取出4℃保存的真空包装BTV抗原固化ELISA板，撕开封口，按样品数量取出ELISA板并进行编号，每个样品测量2孔，阳性对照2-4孔，阴性对照4孔；
按每孔20ul把样品、对照样加到相应孔中；
配制检测竞争液；
将上述检测竞争液按50ul每孔加到ELISA板中并在37℃温箱里温育40-60分钟；
将温育结束的ELISA板取出，甩掉里面的液体，洗板至少5次，甩干准备显色。
作为本发明的优选技术方案，所述配制检测竞争液的步骤中，用竞争混合剂按1/100用稀释液配制检测竞争液。
作为本发明的优选技术方案，所述将上述检测竞争液按50ul每孔加到ELISA板中并在37℃温箱里温育40-60分钟的步骤，还包括在温育的过程中进行震荡。
作为本发明的优选技术方案，所述基于抗原位点进行底物显色的步骤还包括：
在BTV抗原固化板中加TMB单组份显色液每孔50ul，室温 5-10分钟，显色充分后加50ul 终止液终止反应；
在酶标仪450nm处读板，每孔计算抑制率。
作为本发明的优选技术方案，所述在酶标仪450nm处读板，每孔计算抑制率的步骤中，其中抑制率 >50% 为阳性，抑制率介于 40% 和 50% 为可疑，低于40%为阴性。
作为本发明的优选技术方案，其中强阳性对照大于80%，弱阳性对照60–80% ，阴性对照小于40%。
本发明的一种蓝舌病抗体竞争液及其对应的快速ELISA检测方法，其中本发明中的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，包括以下步骤：基于BTV抗原固化板通过待检抗体和抗体竞争液竞争得到抗原位点；基于抗原位点进行底物显色，本发明在保持原来BTV C-ELISA的敏感性和重复性的前提下，简化实验步骤至2步，缩短诊断时间至1小时内，使得蓝舌病血清抗体的检测更加方便和快速。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的原理图。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，本发明提供的一种蓝舌病抗体竞争液，包括以下原料组成：BTV单抗，抗鼠HPR酶标二抗，阴性牛血清，硫柳汞，蛋白保护剂，其中BTV单抗为BTV VP7单抗，作用和待检抗体竞争抗原位点，来自单抗杂交瘤细胞株编号Hybasvigl01（武汉中国细胞库）；抗鼠HPR酶标二抗，作用和单抗结合，提供HPR酶活性，由Invitrogen 公司提供；阴性牛血清防止非特异性反应，由Gibco公司提供；硫柳汞具有防腐保质；蛋白保护剂具有保护蛋白的作用，来自Thermo公司产品 Conjagate stabilizer prod#37548。
本发明的另一面，一种蓝舌病抗体竞争液的配制方法，包括以下步骤：
步骤A：在C-ELISA的基础上使用抗原固化板，将BTV单抗直接包被在抗原固化板上提供检测使用，通过真空干燥包装使抗原固定板能够在4°C保存1年以上，其中抗原固化板的制备包括以下步骤：通过蔗糖梯度离心获得纯化蓝舌病病毒；用0.05M PH9.6碳酸缓冲液稀释病毒，包被板过夜；将包被板进行真空干燥包装，放入4°C备用。
步骤B：将C-ELISA中的BTV单抗和抗鼠HPR酶标二抗整合成抗体竞争液。
本发明的再一面，如图1所示，一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤S1：基于BTV抗原固化板通过待检抗体和抗体竞争液竞争得到抗原位点，具体包括：步骤S1a：取出4℃保存的真空包装BTV抗原固化ELISA板，撕开封口，按样品数量取出ELISA板（条）并进行编号，每个样品测量2孔，阳性对照2-4孔，阴性对照4孔；步骤S1b：按每孔20ul把样品、对照样加到相应孔中；步骤S1c：配制检测竞争液，具体用竞争混合剂按1/100用稀释液配制检测竞争液；步骤S1d：将上述检测竞争液按50ul每孔加到ELISA板中并在37℃温箱里温育40-60分钟，具体为把检测竞争液按50ul每孔加到ELISA板中，所有孔都要加，这时板中有孔中都有70ul 液体（20ul血清加50ul 检测竞争液），以及温育过程中有条件可进行震荡；步骤S1e：将温育结束的ELISA板取出，甩掉里面的液体，洗板至少5次，甩干准备显色。
步骤S2：基于抗原位点进行底物显色，具体包括步骤S2a：在BTV抗原固化板中加TMB单组份显色液每孔50ul，室温 5-10分钟，显色充分后加50ul 终止液终止反应；
步骤S2b：在酶标仪450nm处读板，每孔计算抑制率，具体为抑制率(PI)=(阴性对照平均OD-样品OD)/阴性对照平均OD，其中抑制率>50%为阳性，抑制率介于40%和50%为可疑，低于40%为阴性，以及强阳性对照应该大于80%，弱阳性对照60–80% ，阴性对照应该小于40%。
本发明减少原来蓝舌病抗体检测C-ELISA的操作步骤，从4步减少到2步，检测一份样品的时间从原来4-5小时缩短到45分钟；在缩短检测时间和步骤的同时，保持了BTV C-ELISA的特异性和敏感性，能够用于国际贸易中。下面用表一和表二说明快速ELISA和常规C-ELISA对比的结果。
在本发明中，快速竞争ELISA和常规C-ELISA的特异性相同，表一为快速ELISA和常规C-ELISA的特异性对比实验，实验检测BTV阳性、弱阳性、阴性血清的抑制率，其中BTV阴性血清中还包括蓝舌病类似病毒马鹿出血热病毒阳性、口蹄疫阳性、阿卡邦病毒阳性血清。可以看出，快速竞争ELISA在检测阳性血清和弱阳性血清时和常规C-ELISA结果相同，在检测阴性血清时所有血清抑制率低于10%，而常规C-ELISA检测阴性血清时有二个样品的抑制率超过20%，用快速竞争ELISA检测的阴性血清标准差为0.033，而常规C-ELISA阴性血清标准差为0.102，说明快速竞争ELISA稳定性要高于常规C-ELISA。从强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清综合检测效果来看，快速竞争ELISA和常规C-ELISA的特异性相同。
表一
在表一中，*结果表示为抑制率，其中强阳性对照应该大于80%，弱阳性对照60–80% ，阴性对照应该小于40%。
快速竞争ELISA和常规C-ELISA的敏感性相同 表二为7头绵羊人工感染蓝舌病(BTV-16)后的每二天采血一次的检测结果，结果表明快速竞争ELISA和常规C-ELISA都在第8天检测出抗体阳性，阳性率分别为3/7和2/7,第12天都检测出6/7的阳性，说明两只方法的敏感性相同。
表二
　 0dpi 2dpi 4dpi 6dpi 8dpi 14dpi
快速竞争ELISA 0/7 0/7 0/7 0/7 3/7 6/7
常规C-ELISA 0/7 0/7 0/7 0/7 2/7 6/7
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种蓝舌病抗体竞争液，其特征在于，包括以下原料组成：BTV单抗，抗鼠HPR酶标二抗，阴性牛血清，硫柳汞，蛋白保护剂。
2.一种蓝舌病抗体竞争液的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：
在C-ELISA的基础上使用抗原固化板，将BTV单抗直接包被在抗原固化板上提供检测使用；
将BTV C-ELISA中的BTV单抗和抗鼠HPR酶标二抗整合成抗体竞争液。
3.根据权利要求2所述的一种蓝舌病抗体竞争液的配制方法，其特征在于，其中抗原固化板的制备包括以下步骤：
通过蔗糖梯度离心获得纯化蓝舌病病毒；
用0.05M PH9.6碳酸缓冲液稀释病毒，包被板过夜；
将包被板进行真空干燥包装，放入4°C备用。
4.一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
基于BTV抗原固化板通过待检抗体和抗体竞争液竞争得到抗原位点；
基于抗原位点进行底物显色。
5.根据权利要求4所述的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，其特征在于，所述基于BTV抗原固化板通过待检抗体和抗体竞争液竞争得到抗原位点的步骤还包括：
取出4℃保存的真空包装BTV抗原固化ELISA板，撕开封口，按样品数量取出ELISA板并进行编号，每个样品测量2孔，阳性对照2-4孔，阴性对照4孔；
按每孔20ul把样品、对照样加到相应孔中；
配制检测竞争液；
将上述检测竞争液按50ul每孔加到ELISA板中并在37℃温箱里温育40-60分钟；
将温育结束的ELISA板取出，甩掉里面的液体，洗板至少5次，甩干准备显色。
6. 根据权利要求5所述的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，其特征在于，所述配制检测竞争液的步骤中，用竞争混合剂按1/100用稀释液配制检测竞争液。
7.根据权利要求5所述的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，其特征在于，所述将上述检测竞争液按50ul每孔加到ELISA板中并在37℃温箱里温育40-60分钟的步骤，还包括在温育的过程中进行震荡。
8.根据权利要求4所述的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，其特征在于，所述基于抗原位点进行底物显色的步骤还包括：
在BTV抗原固化板中加TMB单组份显色液每孔50ul，室温 5-10分钟，显色充分后加50ul 终止液终止反应；
在酶标仪450nm处读板，每孔计算抑制率。
9.根据权利要求8所述的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，其特征在于，所述在酶标仪450nm处读板，每孔计算抑制率的步骤中，其中抑制率>50%为阳性，抑制率介于40%和50%为可疑，低于40%为阴性。
10.根据权利要求9所述的一种蓝舌病抗体竞争液的快速ELISA检测方法，其特征在于，其中强阳性对照大于80%，弱阳性对照60–80% ，阴性对照小于40%。
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