CN103048459A - 检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 - Google Patents
检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103048459A CN103048459A CN2012105161142A CN201210516114A CN103048459A CN 103048459 A CN103048459 A CN 103048459A CN 2012105161142 A CN2012105161142 A CN 2012105161142A CN 201210516114 A CN201210516114 A CN 201210516114A CN 103048459 A CN103048459 A CN 103048459A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- syncytial virus
- respiratory syncytial
- rsv
- monoclonal antibody
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 title claims abstract description 68
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000003097 anti-respiratory effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 230000036737 immune function Effects 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 208000030303 breathing problems Diseases 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000007037 hydroformylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000012946 outsourcing Methods 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 208000009421 viral pneumonia Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种检测呼吸道合胞病毒的双抗体检测试剂及相应的试剂盒，其中所述试剂包括作为包被抗体的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体、作为生物素标记抗体的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体以及亲和素-HRP。本发明还提供了应用所述试剂或试剂盒进行检测呼吸道合胞病毒的方法，该方法具有较高的灵敏度和特异性，且易于临床推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用杂交瘤技术生产单克隆抗体和相应的免疫检测试剂及试剂盒。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，可引起严重的呼吸道疾病，感染后与其他呼吸道感染有相似的临床表现和X线胸片特征，不易鉴别。十年来呼吸道合胞病毒肺炎及毛细支气管炎占我国婴幼儿病毒性肺炎第一位，其症状与副流感病毒肺炎、轻症流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎临床上几乎无法区别。重症流感病毒肺炎及重症腺病毒肺炎则高热持续，中毒症状及呼吸道症状重叠，临床表现却远较合胞病毒肺炎严重。合胞病毒肺炎其临床症状与一般支气管肺炎有相似之处，但与轻症腺病毒肺炎亦较难区别，确诊需结合病毒检查结果综合考虑，所以研究敏感快速的针对RSV病毒的检测方法，可以使检验室出具及时准确的病原检测报告，使临床医师及时明确病因，采取特异性针对性的治疗方案，避免滥用抗生素，而且可以便于早期及时诊断后立即加强患者管理，有效预防医院交叉感染，减少病毒传播。
目前，临床上RSV的检测方法很多，常见的有直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、桥联酶标免疫法、普通酶联免疫法、病毒分离法、PCR法及核酸杂交法等。主要使用的是荧光定量PCR法，该方法主要优点是灵敏度高，特异性好。但是缺点是操作复杂，需特定的仪器设备和操作间，且操作易污染，造成结果不如免疫方法直接检抗原可靠。而免疫诊断方法通过特异性直接检抗原，结果更可靠、特异性好，操作简便，无需特殊的仪器设备，普通实验室都可操作，易于基层单位推广和应用。它的主要缺点是不如荧光定量PCR高。因此研发高质量的单抗并制备相应的成试剂盒，使其拥有荧光定量PCR试剂同样的灵敏度和特异性，并且兼有上述免疫诊断试剂的优点，完全能满足临床对该病毒诊断的需求具有非常重要的实用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测呼吸道合胞病毒(RSV)的检测试剂，包括：
抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体1，由保藏编号为CCTCC C2012154的杂交瘤细胞株制备；
抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体2，由保藏编号为CCTCC C2012155的杂交瘤细胞株制备。
进一步地，上述抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体1为包被抗体；抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体2为生物素标记抗体。
进一步地，上述检测试剂还包括亲和素-HRP。
本发明的另一个目的是提供包括上述抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体1和抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体2的检测试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括亲和素-HRP。具体地，所述试剂盒的原理是用保藏编号为CCTCC C2012154的杂交瘤细胞株制备的抗RSV单克隆抗体包被的微孔板和用生物素标记由保藏编号为CCTCC C2012155的杂交瘤细胞株制备抗RSV单克隆抗体，形成双抗体夹心法检测RSV病毒的NP抗原，利用亲和素酶放大反应，从而高灵敏度和特异性地检测咽拭子抽提液中的RSV病毒。
本发明的又一个目的是提供一种检测呼吸道合胞病毒的方法，包括将待测样品与上述的检测试剂接触，从而检测样品中的呼吸道合胞病毒。
进一步地，还提供了使用本发明的检测试剂盒来检测样品中的呼吸道合胞病毒的方法。
本发明所述的检测试剂和方法具有较高的灵敏度和特异性，便于临床推广使用，能完全满足临床对RSV病毒诊断的需要。
生物材料的保藏
分泌抗RSV单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为KRSV2和KRSV5，于2012年10月25日提交到CCTCC保藏，保藏号为：CCTCC C2012154和CCTCC C2012155。
具体实施方式
以下实施例有助于进一步了解本发明的优点和特点，不应视为对本发明的限制。所使用的实验材料和试剂如无特别说明，均为普通市售。
【实施例1】RSV单克隆抗体的研制和配对筛选
1.免疫和筛选用抗原的制备
为研制RSV单克隆抗体，从该病毒蛋白组学分析，本发明选择该病毒相对保守且含量相对较高的NP(核衣壳)蛋白作为诊断的目标蛋白。
1.1用大肠杆菌表达RSV的NP蛋白并纯化：将RSV的NP蛋白基因通过PET30a质粒转入大肠杆菌表达，产物用HIS柱层析亲和纯化，用作免疫用抗原。具体方法和过程参见文献(地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达，病毒学报，CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 2007.06.vol.23459-465)。
1.2RSV的培养和分离纯化：将RSV的LONG株(国际标准株)接种Hep-2细胞，将100TCID/0.2mLRSV接种于已成片的Hep-2细胞试管中33℃旋转培养，待细胞病变后，收集培养物并浓缩超速离心纯化，用作筛选用抗原。具体方法和过程参见文献(呼吸道合胞病毒检测方法比较：，临床儿科杂志，2003年第21卷第1期)。
2.杂交瘤细胞株的建立
2.1免疫：
2.1.1免疫原：用上述1.1部分制备的RSV免疫BALB/C小鼠，雌性，6-8周龄(湖北省实验动物中心)。
2.1.2方法：按100微克/每只的免疫剂量，初免用完全弗氏佐剂，2周后用不完全佐剂100微克/每只加强一次。加强两次后，静脉抗原直接加强。三天后取脾细胞融合。
2.2细胞融合：
2.2.1融合用小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0(P2-X-Ag8·6·5·3)，为Ig非分泌型(武汉生物制品研究所)。
2.2.2融合方法：取加强免疫后第三天的小鼠，摘眼球放血，拉颈处死，置75％酒精浸泡5分钟，无菌操作取出脾脏，并用眼科剪刀将其剪成数段，放入盛有不含小牛血清RPMI1640培养基的10mL圆底塑料管中，用外包塑料王的研磨棒挤压出脾细胞，静置数分钟，取出细胞悬液，并用不含小牛血清RPMI1640培养基混合，离心洗涤两次，弃上清，计数，配制成细胞悬液。将SP2/0细胞与免疫脾细胞按1∶5比例混合，于4℃、1400rpm离心10分钟，吸净上清，加入50％PEG(Sigma P7181)处理，在5分钟内慢慢加入10mL不含小牛血清的RPMI1640培养基，在1000rpm条件下离心10分钟，弃上清，加入含20％小牛血清的RPMI1640培养基配制的HAT(Sigma H0262)中，然后接种到96孔接种预 先点有饲养层细胞培养板上，于融合后第10-14天挑选有杂交瘤细胞生长的孔，吸取培养上清液进行筛选，并换以HT培养基。
2.3筛选和克隆化：
2.3.1筛选：采用间接ELISA法，用超离心纯化的RSV抗原包被聚苯乙烯板，加入细胞培养上清孵育，洗板加入羊抗鼠酶结合物，洗板显色。
2.3.2克隆和再克隆：在96孔细胞培养板中进行。取阳性孔细胞计数，用含20％小牛血清的RPMI1640培养基稀释细胞含量为5个细胞/mL，接种于一块96孔板中，每孔0.2mL，第10-14天采用间接检测，挑选强阳性孔细胞扩大培养后冻存和再克隆，以连续两次克隆阳性率100％为止。
通过以上方法，共筛选出5株能稳定分泌抗RSV核蛋白(NP)的单抗杂交瘤细胞株，分别命名为KRSV1、KRSV2、KRSV3、KRSV4、KRSV5。
3.单克隆抗体的配对和选择
3.1将实施例1所获得的5株单抗细胞株制备腹水，分别用Protein-A蛋白亲和胶纯化，取一部分分别都标记上HRP。
3.2简易过碘酸钠法标记HRP：
本法是以NaIO 4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
(1)称取5mgHRP溶解于1mL蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO 4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化程RP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1mL 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1mL新配的4mg/mL NaBH 4液，混匀，再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜。
3.3将RSV培养物用PBS按1∶100比例的稀释做阳性标准品，以PBS作为阴性标准品。
3.4单抗ELISA配对实验：将KRSV1、KRSV2、KRSV3、KRSV4、KRSV5制备的单克隆抗体，分别以5微克/毫升包被聚苯乙烯板，将以上抗体HRP标记物3微克/毫升，方法为双抗体夹心法，抗体之间两两配对，以阳性标准品和阴性标准品做样品，测其OD值，见结果如下表1：
表1
结果可见：以KRSV2做包被抗体，KRSV5做标记抗体，其灵敏度最高，阴性本底最低，其P/N比值最高达到：1.6/0.01＝160。因此，选择KRSV2和KRSV5这两个杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，分别进一步用于本发明抗呼吸道合胞病毒(RSV)诊断试剂盒的预包被板和生物素标记物，且进一步作为的临床实验用抗体。
【实施例2】抗呼吸道合胞病毒(RSV)诊断试剂盒
原理
本试剂盒用特异性抗RSV单抗包被的微孔板和生物素标记抗RSV单抗双抗体夹心法检测RSV病毒的NP抗原，然后用亲和素酶放大反应，可以提高灵敏度和特异性的检测咽拭子抽提液中RSV病毒。
试剂盒组份(规格)96份样品：
其中，临床上由于所检测样本为病人咽拭子，所含病毒量极低，为提高临床检出率，本发明的试剂盒采用生物素-亲和素放大技术，即BAS系统(见《国际生物制品学杂志》1984年第03期作者：李绍康；章谷生。)
预包被板制备：将纯化KRSV2抗体按5微克/毫升浓度溶入pH9.6的碳酸盐缓冲液中，包被聚苯乙烯板，经洗板、封闭、干燥制成预包被反应板。
抗体生物素标记：生物素购自SIGMA公司(H1759)，严格按照生物素使用说明书，将KRSV5抗体进行生物素标记，充分透析后加入等体积甘油，-20℃保存。
亲和素-HRP结合物购自SIGMA公司(S2438)。
底物缓冲液：pH5.0柠檬酸缓冲液、千分之五的过氧化尿。
底物液：千分之五的TMB，pH4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
终止液：2M硫酸。
操作方法
1.加样：将预包被板条固定于板架上。每加入生物素标记物(抗RSV单抗)25μl。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔，然后分别加入阴、阳性对照75μl；设空白对照1孔；其余孔加待测咽拭子抽提样品液75μl。
2.温育：振荡混匀，置37℃温育60分钟。
3.洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30-60秒，弃去孔内洗液，扣干。重复洗5次。
4.加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入亲和素酶结合物100μl。
5.温育：置37℃温育30分钟。
6.洗涤：弃去孔内酶标记物，重复洗5次(同操作步骤3)。
7.显色：每孔加入底物缓冲液50μl(1滴)，再加入底物液50μl(1滴)，振荡混匀，置37℃温育10分钟。
8.终止：每孔加入终止液50μl(2M硫酸)(1滴)，轻拍混匀。在单波长450nm或双波长450nm/630nm下，用空白孔校零，再读取各孔OD值。
结果判定
1.临界值(C.O.)计算：
临界值(C.O.)＝2.1×阴性对照平均OD值
备注：阴性对照平均OD值小于0.05按0.05计算，大于0.05按实际值计算。
2.结果判断：
样品OD值≥临界值(C.O.)为RSV抗原阳性；
样品OD值＜临界值(C.O.)为RSV抗原阴性。
注意事项
实验准备
1.从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可打开使用。
2.未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存。
实验操作
1.试剂使用前应充分摇匀。
2.洗涤时各孔均需加满洗液，以防止孔口有游离酶标记物未被洗净。
3.结果判读请在反应终止后15分钟内完成。
【实施例3】抗呼吸道合胞病毒(RSV)诊断试剂盒的临床试验
1.灵敏度实验
以目前临床上使用的RSV荧光定量PCR试剂做对照试剂，取阳性RSV病毒培养物(细胞培养液)做样品，检测其灵敏度。RSV病毒培养物依次从1600X稀释到51200X，用ELISA方法检测的OD值，其结果见下表2：
表2
根据实施例2的结果判断方法：试剂阳性判定值(CUTOFF)＝2.1×阴性对照平均OD值，阴性值小于0.05按0.05算)，即OD值≥0.1判为阳性，即该样品灵敏度对应的稀释度为：12800。而样品12800X的荧光定量PCR对应的CT值为28。该值也是RSV荧光定量PCR试剂的CUTOFF值。
由此可见：RSV抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)试剂的灵敏度完全与RSV光定量PCR试剂相当。
2.临床阳性检出率
选取临床8份阳性咽拭子ELISA检测值与荧光定量PCR的CT值对照，结果如下表3所示：
表3
3.试剂的特异性检测
一定例数的甲流病毒、乙流病毒、副流感病毒、呼吸道ADV、MP等病原无交叉反应；
120份正常人咽拭子为阴性，结果见下表：
综上所述，本发明提供的试剂盒具有特异性好，灵敏度高，临床上能特异性很好的检出RSV病毒，且操作简便，易于临床推广等优点。可广泛用于临床上RSV病毒的检测。
Claims (9)
1.一种检测呼吸道合胞病毒的双抗体检测试剂，包括：
抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体1，由保藏编号为CCTCC C2012154的杂交瘤细胞株制备；
抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体2，由保藏编号为CCTCC C2012155的杂交瘤细胞株制备。
2.如权利要求1所述的试剂，其中所述抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体1为包被抗体；抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体2为生物素标记抗体。
3.如权利要求2所述的试剂，还进一步包括亲和素-HRP。
4.包括权利要求1-3中任一项所述试剂的检测试剂盒。
5.抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体1，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCCC2012154的杂交瘤细胞株制备。
6.抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体2，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCCC2012155的杂交瘤细胞株制备。
7.一种检测呼吸道合胞病毒的方法，包括将待测样品与权利要求1所述的免疫检测试剂接触，从而检测样品中的呼吸道合胞病毒。
8.一种检测呼吸道合胞病毒的方法，包括使用权利要求4所述的试剂盒检测呼吸道合胞病毒的步骤。
9.如要求7所述的方法，其中所述样品为咽拭子抽提液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210516114.2A CN103048459B (zh) | 2012-12-05 | 2012-12-05 | 检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210516114.2A CN103048459B (zh) | 2012-12-05 | 2012-12-05 | 检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103048459A true CN103048459A (zh) | 2013-04-17 |
| CN103048459B CN103048459B (zh) | 2014-08-20 |
Family
ID=48061173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210516114.2A Active CN103048459B (zh) | 2012-12-05 | 2012-12-05 | 检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103048459B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103399148A (zh) * | 2013-08-06 | 2013-11-20 | 西南大学 | 基于纳米金信号放大的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒 |
| WO2014198216A1 (zh) * | 2013-06-13 | 2014-12-18 | 广州华银医药科技有限公司 | 一种呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法 |
| CN103604922B (zh) * | 2013-11-20 | 2015-11-25 | 天津市宝坻区人民医院 | 呼吸道合胞病毒检测试剂盒 |
| WO2021095762A1 (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | デンカ株式会社 | 抗ｒｓウイルスｎ蛋白質を認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| JP2021075496A (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | デンカ株式会社 | 抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| CN113354734A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-07 | 北京保图生物技术有限公司 | 一种快速检测病毒的试剂盒及其制备方法 |
| CN115925909A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-04-07 | 深圳重链生物科技有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 |
| CN115960216A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-04-14 | 深圳重链生物科技有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 |
| CN117343166A (zh) * | 2022-07-05 | 2024-01-05 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100015596A1 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Sysmex Corporation | Rs virus detecting kit using anti-rs virus monoclonal antibody, immuno-chromatographic test device, and new anti-rs virus monoclonal antibody |
| WO2011110955A2 (en) * | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Novartis Ag | Methods of testing for intracellular pathogens |
| WO2012006596A2 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Calmune Corporation | Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use |
| CN102507933A (zh) * | 2011-10-27 | 2012-06-20 | 遵义医学院 | 一种呼吸道合胞病毒的检测方法 |
| CN102559608A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-11 | 遵义医学院 | 一种用omc685-1细胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法 |
| CN102656189A (zh) * | 2009-08-13 | 2012-09-05 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 针对人呼吸道合胞病毒(rsv)的抗体以及使用方法 |
| CN102680456A (zh) * | 2011-03-16 | 2012-09-19 | 北京联众泰克科技有限公司 | 一种电化学发光免疫测定方法 |
-
2012
- 2012-12-05 CN CN201210516114.2A patent/CN103048459B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100015596A1 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Sysmex Corporation | Rs virus detecting kit using anti-rs virus monoclonal antibody, immuno-chromatographic test device, and new anti-rs virus monoclonal antibody |
| CN102656189A (zh) * | 2009-08-13 | 2012-09-05 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 针对人呼吸道合胞病毒(rsv)的抗体以及使用方法 |
| WO2011110955A2 (en) * | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Novartis Ag | Methods of testing for intracellular pathogens |
| WO2012006596A2 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Calmune Corporation | Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use |
| CN102680456A (zh) * | 2011-03-16 | 2012-09-19 | 北京联众泰克科技有限公司 | 一种电化学发光免疫测定方法 |
| CN102507933A (zh) * | 2011-10-27 | 2012-06-20 | 遵义医学院 | 一种呼吸道合胞病毒的检测方法 |
| CN102559608A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-11 | 遵义医学院 | 一种用omc685-1细胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| STENSBALLE ET AL: "Seasonal Variation of Maternally Derived Respiratory Syncytial Virus Antibodies and Association with Infant Hospitalizations for Respiratory Syncytial Virus", 《THE JOURNAL OF PEDIATRICS》, 28 February 2009 (2009-02-28), pages 296 - 299 * |
| 汪治华等: "抗呼吸道合胞病毒免疫噬茵体抗体库的构建及初步鉴定", 《细胞与分子免疫学杂志》, vol. 24, no. 9, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 892 - 894 * |
| 苏跃青等: "人类偏肺病毒与呼吸道合胞病毒呼吸道感染的临床研究", 《中华传染病杂志》, vol. 28, no. 6, 30 June 2010 (2010-06-30), pages 343 - 347 * |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014198216A1 (zh) * | 2013-06-13 | 2014-12-18 | 广州华银医药科技有限公司 | 一种呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法 |
| CN103399148B (zh) * | 2013-08-06 | 2015-09-30 | 西南大学 | 基于纳米金信号放大的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒 |
| CN103399148A (zh) * | 2013-08-06 | 2013-11-20 | 西南大学 | 基于纳米金信号放大的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒 |
| CN103604922B (zh) * | 2013-11-20 | 2015-11-25 | 天津市宝坻区人民医院 | 呼吸道合胞病毒检测试剂盒 |
| CN114729032A (zh) * | 2019-11-12 | 2022-07-08 | 电化株式会社 | 识别抗rs病毒的抗体、以及使用了该抗体的免疫测定方法及免疫测定仪器 |
| WO2021095762A1 (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | デンカ株式会社 | 抗ｒｓウイルスｎ蛋白質を認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| JP2021073934A (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | デンカ株式会社 | 抗ｒｓウイルスｎ蛋白質を認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| JP2021075496A (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | デンカ株式会社 | 抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| WO2021095763A1 (ja) * | 2019-11-12 | 2021-05-20 | デンカ株式会社 | 抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| JP7479135B2 (ja) | 2019-11-12 | 2024-05-08 | デンカ株式会社 | 抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| CN113354734A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-07 | 北京保图生物技术有限公司 | 一种快速检测病毒的试剂盒及其制备方法 |
| CN113354734B (zh) * | 2021-07-14 | 2021-12-14 | 北京祥瑞生物制品有限公司 | 一种快速检测病毒的试剂盒及其制备方法 |
| CN117343166A (zh) * | 2022-07-05 | 2024-01-05 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒 |
| CN117343166B (zh) * | 2022-07-05 | 2024-05-31 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒 |
| CN115925909A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-04-07 | 深圳重链生物科技有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 |
| CN115960216A (zh) * | 2022-09-27 | 2023-04-14 | 深圳重链生物科技有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 |
| CN115960216B (zh) * | 2022-09-27 | 2023-07-07 | 深圳重链生物科技有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 |
| CN115925909B (zh) * | 2022-09-27 | 2023-07-21 | 深圳重链生物科技有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103048459B (zh) | 2014-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103048459B (zh) | 检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 | |
| CN111303254A (zh) | 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原检测试剂盒 | |
| CN102305859B (zh) | 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的活毒抗体试剂盒 | |
| CN102775473B (zh) | 人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的b细胞表位肽段及其应用 | |
| CN102731615A (zh) | Prrsv的检测试剂和检测方法 | |
| CN114807054B (zh) | 小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒 | |
| CN105675873A (zh) | 一种检测试剂盒及其应用 | |
| CN105319359B (zh) | 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN107365364A (zh) | 一种腺病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测腺病毒抗体的快速检测试剂盒 | |
| CN111999497B (zh) | 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN103308688A (zh) | 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及制备方法 | |
| CN106632691A (zh) | Hiv重组抗原、表达基因、表达载体以及hiv检测试剂盒 | |
| CN113092755A (zh) | 一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条 | |
| CN109187968A (zh) | 一种猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的二联金标检测试纸及其制备方法 | |
| CN107312088A (zh) | 猪流行性腹泻病毒特异性SIgA ELISA检测试剂盒及其应用 | |
| CN109082413A (zh) | 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN104357407A (zh) | 一种检测腺病毒IgM抗体的免疫荧光试剂及其应用 | |
| CN102533795B (zh) | 一种重组人巨细胞病毒蛋白及其应用 | |
| CN115947835B (zh) | 靶向乙型流感病毒核蛋白的抗体及其应用 | |
| CN109280644B (zh) | 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN1908667A (zh) | 弓形虫IgM抗体检测试剂及应用 | |
| CN102980997B (zh) | EB病毒衣壳抗原IgM抗体胶体金法检测试剂及其制备方法 | |
| KR20120132227A (ko) | 다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법 | |
| CN105753982B (zh) | 抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 | |
| CN105585633B (zh) | 抗人流感嗜血杆菌p6蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170216 Address after: 430000 East Lake high tech Development Zone, Wuhan Province, high and new avenue, No. 666 (Wuhan Institute of biotechnology, building B7, building 2, B102) Patentee after: Wuhan Kerui Hao Technology Development Co.,Ltd. Address before: 430071 Wuchang District, Hubei, Hongshan small Central District No. 44, No. Patentee before: Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170503 Address after: 430000 No. 2, building 21, building 76, building 118, 1 Qin Lu Yuan, Wuchang District, Hubei, Wuhan Patentee after: Yan Bing Address before: 430000 East Lake high tech Development Zone, Wuhan Province, high and new avenue, No. 666 (Wuhan Institute of biotechnology, building B7, building 2, B102) Patentee before: Wuhan Kerui Hao Technology Development Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170519 Address after: 2 B301-313, building 430000, building B7, 666 hi tech Avenue, East Lake Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan Patentee after: Wuhan Keyuan Bo Biological Technology Co.,Ltd. Address before: 430000 No. 2, building 21, building 76, building 118, 1 Qin Lu Yuan, Wuchang District, Hubei, Wuhan Patentee before: Yan Bing |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230627 Address after: 430071 No.44, Xiaohongshan Middle District, guoguohu street, Wuchang District, Wuhan City, Hubei Province Patentee after: Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences Address before: B301-313, 2 / F, B7 building, Biotechnology Research Institute, 666 Gaoxin Avenue, Wuhan East Lake Development Zone, Wuhan City, Hubei Province, 430000 Patentee before: Wuhan Keyuan Bo Biological Technology Co.,Ltd. |