CN115925909A - 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的单克隆抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体、该抗体的制备方法、及其用于免疫检测的相关应用。本发明的单克隆抗RSV抗体表现出针对RSV的高灵敏度和高特异性，在层析平台能够用于纳克级浓度的RSV检测，在诸如化学发光法的其他平台中能够实现如皮克级浓度的更灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及病毒的检测领域，并具体地涉及一种单克隆抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体、其制备方法及其用于免疫检测的相关应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV病毒)属于副黏病毒科肺病毒属，是一种有包膜的单股负链RNA病毒。RSV病毒每年会在全球引起约6400万人感染，造成超过300万的婴幼儿住院治疗，导致16万人死亡。因此针对RSV感染灵敏、快速的检测是极其重要的，而针对RSV病毒的抗体是RSV病毒感染免疫诊断的重要一环。
RSV表达两种主要的表面糖蛋白：融合蛋白(F蛋白)和附着蛋白(G蛋白)。F蛋白的遗传可变性小于G蛋白，它与宿主细胞膜表面的特异受体结合，介导病毒包膜与宿主细胞质膜的融合，引起病毒核酸进入宿主细胞内而得到复制。因此，RSV F蛋白是免疫检测和基于抗体的疗法的非常有吸引力的靶标。
目前现有的抗RSV F蛋白的抗体在灵敏度、特异性方面上都存在不足，在临床中会造成假阴性结果，仍有较大的改善空间。因此，本领域仍需要一种具有高特异性和高灵敏度的抗RSV F蛋白抗体。
发明内容
如前所述，本领域需要一种高特异性和高灵敏度的抗RSV抗体。
本发明人通过将纯化的RSV融合蛋白作为免疫原诱导小鼠产生免疫应答，再利用杂交瘤技术获得能够分泌抗RSV单抗的杂交瘤细胞株，通过体外滚瓶培养的方法收取上清，获得大量抗RSV单克隆抗体，经筛选得到具有高灵敏度和高特异性的抗RSV的抗体。由此，实现了本发明。
在第一方面，本发明提供了一种单克隆抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体，所述抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45239。
在第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含编码单克隆抗RSV抗体的基因，其中所述单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:10-12所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第三方面所述的表达载体。
在第五方面，本发明提供了一种检测呼吸道合胞病毒(RSV)的方法，所述方法用于非诊断目的或者诊断目的，包括使用第一方面所述的单克隆抗RSV抗体的步骤。
在第六方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗RSV抗体在制备用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)的试剂中的用途。
在第七方面，本发明提供了一种用于免疫检测的单克隆抗RSV抗体组合，其包括作为标记抗体的第一单克隆抗RSV抗体和作为包被抗体的第二单克隆抗RSV抗体，其中，
所述第一单克隆抗RSV抗体为第一方面所述的单克隆抗RSV抗体；
所述第二单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
或者
所述第一单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
所述第二单克隆抗RSV抗体为第一方面所述的单克隆抗RSV抗体。
在第八方面，本发明提供了一种用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的单克隆抗RSV抗体以及用于指导如何检测呼吸道合胞病毒(RSV)的说明书。
综上，本发明提供了一种新的抗RSV单克隆抗体，其表现出针对RSV的高灵敏度和高特异性，能够用于纳克级甚至皮克级浓度的RSV检测，极大地提高了RSV检测与分析的灵敏度。本发明的抗RSV抗体能够适用于多种免疫层析检测如荧光微球层析、胶体金层析、彩色微球层析；ELISA检测如直接法、间接法、夹心法和竞争法；化学发光法；电化学发光法等。本发明的抗RSV抗体表现出针对RSV的高灵敏度和高特异性，在层析平台能够用于纳克级浓度的RSV检测，并且在诸如化学发光法的其他平台中可以实现如皮克级浓度的更灵敏检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了本发明的抗体RSV101、RSV200和RSV300的SDS-PAGE电泳图(每孔上样5μg)。
图2示出了本发明的抗体RSV101、RSV200和RSV300经酶标仪测定的OD450nm吸光度曲线。
图3示出了本发明的抗体RSV101和RSV102经酶标仪测定的OD450nm吸光度曲线。
图4示出了本发明中使用的胶体金比色卡示意图。
图5示出了由本发明的抗体制备的示例性荧光微球免疫层析测试剂对RSV融合蛋白重组抗原的灵敏度曲线。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链，其可变区各自包含三个CDR，即CDR1、CDR2和CDR3。因此，各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991))；Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia et al.,Nature 1989；342:878-883；Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009；38(suppl_1):D301-D307。
CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定，Kabat系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDR的精确残基边界，这些CDR被称为Kabat CDR；Chothia发现Kabat系统CDR内的某些亚部分尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性，但具有几乎相同的肽主链构象，这些亚部分被称为Chothia CDR，Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。上述重叠的边界又由Padlan和MacCallum描述，CDR边界定义可能不严格遵守上述系统，例如AbM定义。在本文中，可以根据这些系统中任何一种限定的CDR，尽管优选实施方案使用Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。根据Chothia编号系统，抗体的VH CDR1位于第26至32位，VH CDR2位于第52至57位，VH CDR3位于第99至108位，而VLCDR1位于第24至39位，VL CDR2位于第55至61位，并且VL CDR3位于第94至102位。
如本文中所使用，术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。所述抗体分子可以是免疫球蛋白，无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。所述抗体分子还可以包括具有抗体结构结合域的所有多肽或蛋白质，具有抗体结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子，以及双功能抗体。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如前所述，本发明旨在提供一种具有高灵敏度和高特异性的单克隆抗RSV抗体。
在第一方面，本发明提供了一种单克隆抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体，所述抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:10-12所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包括至少六个CDR。
在一些优选的实施方案中，所述抗体包括：
1)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，优选95％以上一致性的序列。
2)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，优选95％以上一致性的序列。
在一些实施方案中，所述抗体为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言，可以使用任何构架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列，也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明所述CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。
在一些实施方案中，所述抗体可以为纳米抗体、Fab、dAb、Fd、Fv、scFv以及双功能抗体中的一种。
在一些实施方案中，所示抗体还包括恒定区序列。
在一些实施方案中，所述恒定区序列可以为选自IgG、lgA、IgM、IgE、IgD中任何一种的恒定区序列。
在一些实施方案中，所述恒定区序列种属来源为小鼠。
在一个示例性的实施方案中，所述恒定区序列可以包括下述序列或由下述序列组成：
具有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；及
具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述抗体是由于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏号为CGMCC No.45239的杂交瘤细胞生产的。
在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45239。
在第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含编码单克隆抗RSV抗体的基因，其中所述单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具体分别由SEQ ID NO:10-12所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个优选的实施方案中，对于所述单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
在一个优选的实施方案中，所述表达载体可以为质粒载体，例如pCDNA3.1、pEE12、pCAGGS。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第三方面所述的表达载体。
如前所述，本发明人将纯化的RSV融合蛋白(F蛋白，SEQ ID NO:27)作为免疫原诱导小鼠产生免疫应答，再利用杂交瘤技术获得能够分泌抗RSV单抗的杂交瘤细胞株，通过体外滚瓶培养的方法收取上清，获得大量抗RSV抗体，经筛选得到具有高灵敏度和高特异性的单克隆抗RSV抗体，命名为RSV200。
利用单克隆及其他抗体和重组DNA技术可以产生保留了原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子，这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加构架区。
在一个实施方案中，所述表达细胞可以为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。在一个更具体的实施方案中，所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞，Graham et al.,1977，J.GenVirol.36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaubet al.,1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216；例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1，ATCCCCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCCCCL75)、人肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述表达细胞可以为HEK293细胞。
在第五方面，本发明提供了一种检测呼吸道合胞病毒(RSV)的方法，所述方法用于非诊断目的或者诊断目的，包括使用第一方面所述的单克隆抗RSV抗体的步骤。
在一个具体的实施方案中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。
在一个优选的实施方案中，所述酶标抗体法可以为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在一个优选的实施方案中，所述免疫层析法包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
在本发明中，所述单克隆抗RSV抗体可以作为包被抗体使用。例如单克隆抗RSV抗体与固相如固相支持物结合。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制，其可以是多孔或无孔材料，例如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
本发明的检测方法可以用于即时检验(POCT)或电化学免疫测定系统。根据本发明的检测方法或其任何示例性形式可以在自动化和半自动化系统中使用，并根据具体情况进行优化。
不期望被理论束缚，所述单克隆抗RSV抗体也可以作为标记抗体使用。例如所述单克隆抗RSV抗体与磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合。
举例来说，当进行基于彩色乳胶微球的免疫层析测试时，可以用本发明的抗RSV抗体标记的乳胶微球、包被有另一种抗RSV抗体的硝酸纤维素膜(NC膜)、样品垫、吸水纸、聚酯板等按常规方式组装成免疫层析快速测试卡。检测时，阳性样品中的待测物与标记有抗RSV抗体的乳胶微球结合，在室温下发生凝集反应，因此放置一段时间后，可以通过肉眼观察并判定结果。
又例如，当进行胶体金免疫层析测试时，可以用胶体金标记抗RSV抗体，另一种抗RSV抗体包被硝酸纤维素膜(NC膜)，划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式，组装得到胶体金检测试纸。检测时，阳性样品中的待测物与胶体金标记抗RSV抗体结合形成复合物，所述复合物在T线处与包被抗体结合，形成夹心复合物，此处胶体金发生聚集沉淀显示红色，指示样品为阳性。
又例如，当进行荧光微球免疫层析测试时，可以用本发明的单克隆抗RSV抗体标记时间分辨荧光微球，用另一种抗RSV抗体包被硝酸纤维素膜(NC膜)，与样品垫等组装成免疫层析快速测试卡。当检测时，样品中的待测物与结合垫中的荧光微球标记抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线T线上固定的另一种抗RSV抗体进一步结合形成双抗夹心的“三明治”型。层析结束后，用免疫荧光仪读取T线和C线的荧光强度并计算T/C值，通过仪器内置的标准曲线即可计算出样品中待测物的含量。
因此，在一个具体的实施方案中，在所述检测中还使用另一种单克隆抗RSV抗体，并且所述单克隆抗RSV抗体作为包被抗体和标记抗体中的一种使用，所述另一种单克隆抗RSV抗体作为包被抗体和标记抗体中的另一种使用。
值得注意的是，在本发明的上下文中，“另一种单克隆抗RSV抗体”是指能够与本发明的单克隆抗RSV抗体结合相同抗原、优选结合相同抗原的不同表位的抗体，其可以是本发明的单克隆抗RSV抗体，也可以不是本发明的单克隆抗RSV抗体。举例来说，在检测中，当选择抗体RSV200作为标记抗体时，可以仍然选择RSV200作为包被抗体，但优选选择另一种不同的单克隆抗RSV抗体作为包被抗体，例如，可以选择包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及具有分别由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的单克隆抗RSV抗体，如RSV101或RSV102，或者包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的单克隆抗RSV抗体，例如RSV300。
因此，在一个优选的实施方案中，所述另一种单克隆抗RSV抗体可以是本发明第一方面的单克隆抗RSV抗体，例如为RSV200，也可以是本发明的单克隆抗RSV抗体以外的其他单克隆抗体。
在一个进一步优选的实施方案中，所述另一种单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，如RSV101或RSV102。在一个更优选的实施方案中，对于另一种单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
在又一个优选的实施方案中，所述另一种单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一个更优选的实施方案中，对于所述另一种单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。作为一个具体的示例，所述单克隆抗RSV抗体可以为RSV300。
因此，在本发明的检测方法中，标记抗体与包被抗体可以是相同的。也就是说，当本发明的单克隆抗RSV抗体用于免疫层析以检测RSV病毒时，其在用作标记抗体以标记磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、胶体金等的同时，也用作包被抗体包被固相支持物如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
在一个优选的实施方案中，在本发明的检测方法中，标记抗体与包被抗体是不同的。
在第六方面，本发明提供了第一方面所述的单克隆抗RSV抗体在制备用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)的试剂中的用途。
在一个具体的实施方案中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。
在又一个优选的实施方案中，ELISA可以是直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在一个优选的实施方案中，所述免疫层析法包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
如前所述，所述单克隆抗RSV抗体在检测中可以作为包被抗体使用。例如单克隆抗RSV抗体与固相如固相支持物结合。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制，其可以是多孔或无孔材料，例如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
同样，所述单克隆抗RSV抗体也可以作为标记抗体使用。例如所述单克隆抗RSV抗体与磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合。
在一个具体的实施方案中，在所述用途中还可以使用另一种单克隆抗RSV抗体，并且所述单克隆抗RSV抗体作为包被抗体和标记抗体中的一种使用，所述另一种单克隆抗RSV抗体作为包被抗体和标记抗体中的另一种使用。
如前所述，“另一种单克隆抗RSV抗体”是指能够与本发明的单克隆抗RSV抗体结合相同抗原、优选结合相同抗原的不同表位的抗体，其可以是本发明的单克隆抗RSV抗体，也可以不是本发明的单克隆抗RSV抗体。举例来说，在该用途中，当选择抗体RSV200作为标记抗体时，可以仍然选择RSV200作为包被抗体，但是优选选择另一种不同的单克隆抗RSV抗体作为包被抗体，例如，可以选择如前所述的抗体RSV101、RSV102或RSV300。
在一个优选的实施方案中，所述另一种单克隆抗RSV抗体与本发明的单克隆抗RSV抗体不同。
在一个优选的实施方案中，所述另一种单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。作为一个具体的示例，所述单克隆抗RSV抗体可以为RSV101或RSV102。
在又一个优选的实施方案中，对于所述另一种单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。作为一个具体的示例，所述单克隆抗RSV抗体可以为RSV101。
在一个进一步优选的实施方案中，所述另一种单克隆抗RSV抗体为是所述抗体的VL CDR3为QQYSNFPFT的单克隆抗RSV抗体，如RSV102。本发明人研究发现，当本发明的单克隆抗RSV抗体如RSV200与包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区以及由SEQ IDNO:4-6所示的轻链互补决定区的单克隆抗RSV抗体如RSV102结合使用时，无论是作为标记抗体还是包被抗体，在用于免疫层析反应如基于彩色乳胶微球和基于胶体金的免疫层析反应中均表现出显著的灵敏度。
在第七方面，本发明提供了一种用于免疫检测的单克隆抗RSV抗体组合，其包括作为标记抗体的第一单克隆抗RSV抗体和作为包被抗体的第二单克隆抗RSV抗体，其中所述第一单克隆抗RSV抗体和所述第二单克隆抗RSV抗体可以具体如下：
作为第一抗体组合，所述第一单克隆抗RSV抗体为本发明第一方面的单克隆抗RSV抗体，例如RSV200，所述第二单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个优选的实施方案中，对于所述第二单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
作为第二抗体组合，所述第一单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述第二单克隆抗RSV抗体为本发明第一方面的单克隆抗RSV抗体，例如RSV200。
在一个优选的实施方案中，对于所述第一单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
作为第三抗体组合，所述第一单克隆抗RSV抗体为本发明第一方面的单克隆抗RSV抗体，例如RSV200，所述第二单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，例如RSV101或RSV102。
在一个优选的实施方案中，所述第一单克隆抗RSV抗体为本发明第一方面的单克隆抗RSV抗体，如RSV200，所述第二单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VL CDR3为QQYSNFPFT，如RSV102。
在一个优选的实施方案中，对于所述第二单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
在第八方面，本发明提供了一种用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的单克隆抗RSV抗体以及用于指导如何检测呼吸道合胞病毒(RSV)的说明书。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还可以包括：包括重链可变区和轻链可变区的另一种单克隆抗RSV抗体，其中：
所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个优选的实施方案中，对于所述另一种单克隆抗RSV抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
作为一个具体的示例，所述单克隆RSV抗体可以为RSV300。
本发明的试剂盒可以用于即时检验(POCT)或电化学免疫测定系统。根据本发明的试剂盒和其任何示例性形式可以在自动化和半自动化系统中使用，并进行优化。
实施例
在下述实施例中，示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1：抗RSV F蛋白单克隆抗体的制备
抗原偶联和免疫：将纯化出的RSV F蛋白(SEQ ID NO:27)作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄、雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次，每次免疫间隔2周，免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将RSV F蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经背部皮下多点注射，后三次免疫将RSV F蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经腹腔注射。第四次免疫后7天，对小鼠断尾采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平，以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1：10000的小鼠进行细胞融合实验，在细胞融合实验前3天用不加佐剂的RSV F蛋白经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立：融合当天，在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1：5的比例融合，充分混匀，在与PEG融合前，洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500，轻轻振荡，以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中，并且在37℃、5％CO2条件下培养细胞。培养4至7天后，改用HT培养基进行培养，当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时，取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选：取RSV F蛋白，用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6，PBS)稀释，最终浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔板中，于4℃包被过夜；弃包被液，用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次，拍干；用含2％BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)底物，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下，检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1，以测定孔(RSV F蛋白)的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化：将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后，稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。6-7天后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，标记出单个克隆生长孔，取出细胞上清，进行ELISA检测(与上述融合检测相同)，选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得三株稳定分泌抗RSV抗体的细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株F2H11、B8H12和C5B7。
杂交瘤细胞F2H11于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45238。
杂交瘤细胞B8H12于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45239。
杂交瘤细胞C5B7于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45240。
细胞上清单抗的制备与纯化：将这三株细胞株用含15％血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养，当扩培至约4×107个/皿时，以800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml，转瓶培养。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到80％-90％时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml)，收取细胞悬液，以6000rpm高速离心20min，取上清，对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由F2H11杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作RSV101；将由B8H12杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作RSV200；将由C5B7杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作RSV300。
经微量分光光度计鉴定，RSV101、RSV200和RSV300单克隆抗体的浓度约为2-4mg/mL。将纯化后的单抗浓度测定，并分装(100μL/管，浓度为1mg/ml)，保存在4℃-8℃。
用SDS-PAGE电泳鉴定三种抗体(每孔上样5μg)，结果如图1所示。从该图中可以看出，这三种抗体均出现约51KD的抗体重链条带和约26KD的抗体轻链条带。
纯度检测：用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析上述三种单克隆抗体，在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比，纯度均达到大于98％。
实施例2：抗体与RSV F蛋白的结合能力
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释RSV F蛋白，使其浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干。用含2％BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗RSV F蛋白单克隆抗体RSV101、RSV200和RSV300抗体进行梯度稀释，抗体起始浓度为1.5ug/ml,依次按三倍进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板，于37℃孵育1h，洗涤3次，拍干。加入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自sigma)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干。TMB底物以100μL/孔加入，于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值，通过软件分析上述ELISA结果，获得RSV101抗体、RSV200抗体及RSV300抗体的EC50值，结果如图2所示。
从图2可以得出，RSV101抗体、RSV200抗体、RSV300抗体与RSV-F(strain A)结合的EC50值分别为8.514ng/ml、6.459ng/ml和6.035ng/ml。
实施例3：抗RSV抗体可变区序列的克隆和测序
从上述三株杂交瘤细胞株分离总RNA，通过反向转录制备cDNA，以从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列，并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行如下步骤的测定。
a.RNA的提取：参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录。
b.RNA反转录成为cDNA：参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit聚合美(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用。
c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，用通用重链引物Mu Ig VH 5′-A和Mu IgG VH 3′-2，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA；相似地，使用轻链引物Mu IgκVL 5′-A和Mu IgκVL 3′-1，通过PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA，将PCR产物进行回收；PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。
d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
对测序得到杂交瘤细胞株的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析，经分析，重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表1所示。
表1：抗体RSV101、RSV200和RSV300的重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
此外，本实施例还对各抗RSV抗体的重链和轻链可变区的序列进行了测序，结果如下：
抗体RSV101的重链可变区序列如SEQ ID NO:19所示，轻链可变区序列如SEQ IDNO:20所示；抗体RSV200的重链可变区序列如SEQ ID NO:21所示，轻链可变区序列如SEQ IDNO:22所示；抗体RSV300的重链可变区序列如SEQ ID NO:23所示，轻链可变区序列如SEQ IDNO:24所示。
实施例4：重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体，通过真核表达制备稳定表达抗阻断剂抗体的细胞株，并对其进行大规模培养纯化。
采用PCR方法，以反转录得到的cDNA为模板，扩增鼠单克隆抗体重轻链可变区基因(VH和VL)，并经测序确定序列。对抗体的VL和VH基因，用分子克隆的方法采用质粒pCDNA3.1构建重组抗体真核表达载体。将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞，电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20天后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG为二抗进行筛选，方法同上)，筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。
另外，对RSV101的轻链CDR3进行突变，将QQYSNFPCT突变为QQYSNFPFT，其余序列保持不变，以相同的方式构建重组抗体真核表达载体(同样采用质粒pCDNA3.1)。将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞，筛选出稳定表达的重组抗体细胞株，得到的重组抗体记作RSV102，其CDR如下表2所示：
表2：抗体RSV102的重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养，进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/ml接种于滚瓶中，1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO)，根据生产需求决定接种瓶数量，将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时，温度为37℃，二氧化碳为5％。培养7-9天后取样显微镜下观察，当细胞活率小于50％，离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体即为重组单克隆抗体。
根据实施例2所述方法，检测重组抗体RSV102与RSV F蛋白的结合能力，结果如图3所示。可以得出，RSV102抗体与RSV-F(strain A)结合的EC50值为7.9ng/ml。
实施例5：基于彩色乳胶微球的免疫层析测试
采用基于彩色乳胶微球的免疫层析方法对本发明的单克隆抗RSV抗体进行评价。
重组抗体标记乳胶微球，其包括如下步骤：
1.清洗微球：1mg微球加入一定量0.1M的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液pH 6.0，混匀后20000rpm离心20min，去上清；
2.活化：加入一定体积的MES缓冲液pH 6.0，超声混匀，加入12μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与12μg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，37℃反应15min，每5min混匀一次，离心20000rpm，20min弃上清；
3.偶联：加入一定体积的50mM pH＝8.0的硼酸缓冲液，超声混匀，加入0.2mg下表3中所列出的抗RSV F单克隆抗体a，37℃混匀反应过夜；
4.封闭：加入1ml BSA(5％)封闭1h，20000rpm离心20min，弃上清。
5.清洗：用0.1M pH8.5 Tris-HCl清洗2次，20000rpm离心20min，弃上清；
6.保存：加入25mM MES(pH＝7.4)0.5ml保存，用25mM MES(pH＝7.4)，1％BSA，0.1％Tween20稀释50倍后冻干密封备用。
重组抗体包被硝酸纤维素膜(NC膜)：包被抗RSV单克隆抗体b(如下表3中所列出的)，用10mM pH 7.4PBS，2％蔗糖稀释至终浓度1.0mg/ml包被到赛多利斯140的NC膜上作为检测线(T线)，37℃过夜后密封备用。
准备样品垫：使用10mM pH7.4 PBS处理样品垫，冻干备用。
免疫层析体系的组装：将上述已标记抗体的红色乳胶微球、包被有抗体的NC膜、样品垫、吸水纸、聚酯板按常规方式组装成免疫层析快速测试卡。
表3：本实施例中使用的抗RSV单克隆抗体a和b
| 抗体组合编号 | 标记抗体a | 包被抗体b |
| 1 | RSV101 | RSV101 |
| 2 | RSV101 | RSV102 |
| 3 | RSV101 | RSV200 |
| 4 | RSV101 | RSV300 |
| 5 | RSV102 | RSV101 |
| 6 | RSV102 | RSV102 |
| 7 | RSV102 | RSV200 |
| 8 | RSV102 | RSV300 |
| 9 | RSV200 | RSV101 |
| 10 | RSV200 | RSV102 |
| 11 | RSV200 | RSV200 |
| 12 | RSV200 | RSV300 |
| 13 | RSV300 | RSV101 |
| 14 | RSV300 | RSV102 |
| 15 | RSV300 | RSV200 |
| 16 | RSV300 | RSV300 |
免疫测试：分别检测不同稀释度(1：100、1:1000和1:10000)的病毒培养物的样本和含有不同浓度(1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml)的重组抗原的样本。具体地，将80μl待测样本滴加至快速测试卡，室温放置15分钟后，肉眼观察并判定结果。根据显色条带颜色的深浅，可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性，结果如表4所示，以厂家ARSV乳胶层析试剂作为对照。将显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较，选出最接近的颜色，将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性。如图4所示，色卡分为C1-C9九档，其中，C1为强阳性，表示单位活性最高，中间梯度递减，C9为最弱阳性，表示单位活性最低。另外，图中的B表示空白。
表4：基于彩色乳胶微球的免疫层析反应结果
结果表明，本发明的抗体在基于彩色乳胶微球的免疫层析检测中，当本发明采用不同的标记抗体和包被抗体时，无论是针对病毒培养物，还是针对重组抗原，均比厂家A类似产品灵敏度高一至二个等级，测试灵敏度可达纳克级。其中，抗体组合4、10、13和14表现出最高的灵敏度。
实施例6：胶体金免疫层析测试
胶体金制备：在三角烧瓶中加入200ml超纯水，加热至沸腾，加入1ml 2％氯金酸(Sigma-Aldrich公司，货号：16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加1ml 2％柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司，货号：6132-04-3)水溶液，继续搅拌沸腾10分钟，自然冷却备用。
标记胶体金偶合物：取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入120μl的0.2MK2CO3调节pH至7.0，继续搅拌10秒；加入100μg如上表3中所列出的抗RSV单克隆抗体a(标记抗体)，继续搅拌5分钟；加入0.1ml 10％BSA，继续搅拌5分钟；12000g离心10分钟，弃掉上清，将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB，150mM NaCl，0.2％BSA，0.1％TritonX-100，3％Sucrose，0.01％Proclin300)定容至1ml，作为抗RSV单克隆抗体胶体金复合物。
制备胶体金垫：将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(上海金标公司)，冻干，即制成金标垫。
硝酸纤维素膜(NC膜)包被：稀释如上表3中所列出的抗RSV单克隆抗体b(包被抗体)至1.5mg/ml，制成检测线工作液，用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，50℃干燥1小时，备用。
胶体金免疫层析测试试剂条的组装：将上述金标垫、包被有抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成胶体金免疫检测试剂条。
灵敏度检测：分别检测不同稀释度的病毒培养物和不同浓度的重组抗原的样本。具体地，将80μl待测样本滴加至样品垫处，室温放置15-30分钟，判定结果。根据显示条带颜色的深浅，可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较，选出最接近的颜色，将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性，结果如下表5所示，以厂家A的RSV胶体金层析试剂作为对照。结果表明，与厂家A的RSV胶体金层析试剂相比，当本发明采用不同的标记抗体和包被抗体时，本发明的抗体组合表现出相当的灵敏度，或者比厂家A的类似产品灵敏度高一至二个等级。其中，抗体组合4、10和13表现出最高的灵敏度。
表5：基于胶体金的免疫层析反应结果(重组抗原单位为ng/ml)
特异性检测：以厂家A的RSV胶体金层析试剂为对照，使用本发明的四种抗体制备的试剂条对30份健康人群的鼻咽拭子样品进行测试。结果显示，与厂家A试剂相同，本发明的四种抗体制备的试剂条无假阳性结果，特异性为100％。
实施例7：荧光微球免疫层析测试
将抗体分别包被NC膜(包被抗体)和时间分辨荧光微球(标记抗体)，制备层析产品，步骤如下：
1.标记时间分辨荧光微球：1mg微球加入一定量0.1M的MES缓冲液pH 6.5，混匀后20000rpm离心20min，去上清；加入一定体积的MES缓冲液pH 6.5，超声混匀，加入20μg EDC与40μg NHS，室温反应30min，每5min混匀一次，离心20000rpm，20min弃上清；加入一定体积的50mM pH＝8.0的硼酸缓冲液，超声混匀，加入0.05-0.1mg的如上表3所列出的抗RSV单克隆抗体a，室温混匀反应2小时；加入1mL 100mM Tris-HCl pH8.5含1％BSA封闭2小时，20000rpm离心20min，弃上清；用0.1M pH8.5 Tris-HCl清洗2次，20000rpm离心20min，弃上清；保存：加入25mM MES(pH＝7.4)0.5ml保存，用25mM MES(pH＝7.4)，1％BSA，0.1％Tween20稀释50倍后冻干密封备用。
2.包被NC膜：将上表3所列出的抗RSV单克隆抗体b用10mM pH 7.4PBS，2％蔗糖稀释至终浓度1.0mg/ml，包被到赛多利斯140的NC膜上，37℃过夜后密封备用。
3.样品垫准备：使用10mM pH7.4 PBS处理样品垫，冻干备用。
4.组装和测试：将上述已标记有抗体的时间分辨荧光微球、已包被有抗体的NC膜、样品垫组装成免疫层析快速测试卡，加入80μl随机临床样本，室温放置15分钟后，使用免疫荧光仪检测。
抗体对F蛋白重组抗原的灵敏度：
首先，检测了抗体组合4和10对不同浓度(0.1-500ng/ml)的F蛋白重组抗原的检测，结果如下表6及图5所示。如下表6所示，抗体组合4对于F蛋白重组抗原的检测结果表明，在抗原浓度为0.1ng/ml时，T/C值是不含F蛋白的检测组T/C值(0.52)的两倍以上，以此为标准，在荧光微球免疫层析体系中，重组抗体对F蛋白重组抗原灵敏度可达0.1ng/ml。以RSV N蛋白重组抗原为阴性对照进行同样的检测，发现随N蛋白浓度增加，T/C值无明显变化。
表6：抗体组合4对F蛋白重组抗原的灵敏度结果
接着，比较了本实施例的抗体组合2、4、8、10、15与厂家A的RSV乳胶层析试剂对于不同浓度的F蛋白重组抗原的检测结果，如表7所示。对比厂家A的RSV乳胶层析试剂，本发明的抗体对在荧光层析试剂可检出浓度为0.1ng/ml的F蛋白重组抗原，而厂家A的乳胶试剂对这一浓度的检测结果为阴性，这说明本发明的单克隆抗体的灵敏度高。
表7：抗体对病毒培养物和F蛋白重组抗原的灵敏度结果
抗体对病毒培养物的灵敏度：测试了抗体对稀释度为1：100至1：20000范围的病毒培养物的灵敏度，结果如表8所示。对比厂家A的RSV乳胶层析试剂，本发明的抗体对在荧光层析试剂可检出病毒培养物1：20000，而在1：20000稀释度下，厂家A的乳胶试剂检测结果为阴性，这说明本发明的单克隆抗体的灵敏度更高。
表8：本发明的抗体对病毒培养物的灵敏度结果
序列表
SEQ ID NO:1(VH CDR1)：GYSITSDY
SEQ ID NO:2(VH CDR2)：SYIGS
SEQ ID NO:3(VH CDR3)：TIRNYFDY
SEQ ID NO:4(VL CDR1)：SASQGISNYLN
SEQ ID NO:5(VL CDR2)：DTSSLHS
SEQ ID NO:6(VL CDR3)：QQYSNFPXT(其中，X为C或F)
SEQ ID NO:7(VH CDR1)：GFNIKDY
SEQ ID NO:8(VH CDR2)：DPENGN
SEQ ID NO:9(VH CDR3)：YGTSYWFPY
SEQ ID NO:10(VL CDR1)：KASQDINSYLS
SEQ ID NO:11(VL CDR2)：RANRLVD
SEQ ID NO:12(VL CDR3)：LQFDEFPYT
SEQ ID NO:13(VH CDR1)：GYTFSSN
SEQ ID NO:14(VH CDR2)：LPGSGS
SEQ ID NO:15(VH CDR3)：EELGYFDY
SEQ ID NO:16(VL CDR1)：RASQDINNYLN
SEQ ID NO:17(VL CDR2)：YTSRLHS
SEQ ID NO:18(VL CDR3)：QQGSTLPPT
SEQ ID NO:19(VH)：EVQLQQPGAELVKPGGSVKLSCKASGYSITSDYWVKQRPGRQLEWIGSYIGSKISLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARTIRNYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:20(VL)：DIVMTQTHKFMSTSVGDRVSLTCSASQGISNYLNWYQEKPGQSPKLLIYSDTSSLHSGVPARFTGTQSGTDFTFTISSVQAEDEALYFCQQYSNFPCTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:21(VH)：EVQLQQPGAELVKPGGSVKLSCKASGFNIKDYWVKQRPGRQLEWIGDPENGNKISLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYGTSYWFPYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:22(VL)：DIVMTQTHKFMSTSVGDRVSLTCKASQDINSYLSWYQEKPGQSPKLLIYSRANRLVDGVPARFTGTQSGTDFTFTISSVQAEDEALYFCLQFDEFPYTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:23(VH)：EVQLQQPGAELVKPGGSVKLSCKASGYTFSSNWVKQRPGRQLEWIGLPGSGSKISLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREELGYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:24(VL)：DIVMTQTHKFMSTSVGDRVSLTCRASQDINNYLNWYQEKPGQSPKLLIYSYTSRLHSGVPARFTGTQSGTDFTFTISSVQAEDEALYFCQQGSTLPPTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:25(C)：AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:26(C)：ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:27(RSV融合蛋白)：MELPILKANAITTILAAVTFCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKRSCRISNIETVIEFQHKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIEIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN。
Claims (10)
1.一种单克隆抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体，所述抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ IDNO:10-12所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
优选地，所述抗体是由于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏号为CGMCC No.45239的杂交瘤细胞生产的。
2.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2022年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45239。
3.一种表达载体，其包含编码单克隆抗RSV抗体的基因，其中所述单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:10-12所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
优选地，所述表达载体为质粒载体如pCDNA3.1、pEE12、pCAGGS。
4.一种表达细胞，其包含权利要求3所述的表达载体；优选地，所述表达细胞为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。
5.一种检测呼吸道合胞病毒(RSV)的方法，所述方法用于非诊断目的，包括使用权利要求1所述的单克隆抗RSV抗体的步骤。
6.权利要求1所述的单克隆抗RSV抗体在制备用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)的试剂中的用途。
7.根据权利要求5所述的方法或者根据权利要求6所述的用途，其中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的；优选地，所述免疫层析法包括荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法；ELISA如直接法、间接法、夹心法和竞争法。
8.根据权利要求5或7所述的方法或者根据权利要求6或7所述的用途，其中，在所述检测中还使用另一种单克隆抗RSV抗体，并且所述单克隆抗RSV抗体作为包被抗体和标记抗体中的一种使用，所述另一种单克隆抗RSV抗体作为包被抗体和标记抗体中的另一种使用；
优选地，所述另一种单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
更优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
9.一种用于免疫检测的单克隆抗RSV抗体组合，其包括作为标记抗体的第一单克隆抗RSV抗体和作为包被抗体的第二单克隆抗RSV抗体，其中，
所述第一单克隆抗RSV抗体为权利要求1所述的单克隆抗RSV抗体；
所述第二单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VHCDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
或者
所述第一单克隆抗RSV抗体为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗RSV抗体，其中所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VHCDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列；
所述第二单克隆抗RSV抗体为权利要求1所述的单克隆抗RSV抗体。
10.一种用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的单克隆抗RSV抗体以及用于指导如何检测呼吸道合胞病毒(RSV)的说明书；
优选地，所述试剂盒还包括：包括重链可变区和轻链可变区的另一种单克隆抗RSV抗体，其中：
所述重链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括具有分别由SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
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