CN113402604A - 快速检测病毒的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测病毒的试剂盒及其制备方法。本发明筛选获得特异性识别呼吸道合胞病毒F抗原单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制备获得抗体荧光量子点快速检测试纸，同时针对呼吸道合胞病毒P蛋白的基因序列进行分析，选取保守区设计RPA引物和探针，并制备成为相应的检测试纸条；将两个检测方法进行组合使用，能够进一步提高检测的准确性，从而及早诊断，利于患者尽快治疗，适于大规模推广使用。

Description

快速检测病毒的试剂盒及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物检测领域,并且更具体地涉及快速检测病毒的试剂盒及其制备方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是属于副粘病毒科，肺炎病毒属的单股负链RNA病毒，被认为是引起婴幼儿急性下呼吸道感染的最主要的病原体，也是世界范围内1岁以下婴儿的主要死亡原因之一。在世界不同地区每年因RSV感染而需住院治疗的患儿为1％-5％，住院患儿病死率为1％-3％。RSV可通过多种途径传播，主要通过咳嗽或打喷嚏释放含病毒颗粒的飞沫或间接接触感染病人的呼吸道分泌物后擦拭眼或鼻。不同年龄的人感染RSV后的主要临床症状可能不同，婴幼儿感染RSV后，多出现高热、鼻炎、咽炎及喉炎等症状，还可能为细支气管炎及肺炎等较严重的下呼吸道疾病，更严重者可能发展为神经性疾病，少数患者伴有中耳炎、胸膜炎及心肌炎等并发症；大龄儿童和成人感染RSV后，主要表现为上呼吸道感染症状。对于有基础疾病的患者，如本身有心肺疾病(先天性心脏病或肺发育不良等)、免疫抑制或缺陷等，感染RSV后更易转为重症患者。
RSV病毒的基因组约有15191-15226个核苷酸(nt)，可编码11种蛋白质。其中G、F、SH蛋白为RSV跨膜糖蛋白，其中F和G蛋白可介导病毒与细胞、细胞间的黏附和穿膜入胞。F蛋白相对保守，G蛋白高度可变，根据G蛋白基因的不同，RSV主要分为RSV-A、RSV-B两个抗原亚型。M、M2-1、M2-2为基质蛋白，N、P和L三种蛋白相互作用构成核衣壳，NS1、NS2为非结构蛋白。
RSV感染的病例多表现为发热、咳嗽和流涕等呼吸道感染症状，会与其他呼吸道相关病毒混淆，所以从临床症状上来判断患者是否被RSV感染并不可靠，建立一种高效快速、准确的检测方法就显得尤为重要。对于RSV早期准确诊断不仅对于临床管理很重要，也能够起到防范和控制RSV传播的作用。
目前RSV的检测方法主要有病毒分离培养、免疫学检测和病原学检测。病毒培养需要有活病毒存在才能实现，操作繁琐且耗时长。病原学检测精准性高、检测时间短，但是设备昂贵，检测费用高，易出现假阳性。免疫免疫学方法检测时间短，但灵敏度低，对于低浓度感染样本的检测效果不理想。因此，现有方法的临床敏感性不是十分理想。
申请内容
为了更好规避以上缺陷,为患者提供尽早、准确的诊断结果，提供了一种制备简单、成本低廉、使用方便、不需要高精尖仪器、更为准确、高效的检测试剂盒。所述试剂盒通过核酸-抗体双重检测方法对呼吸道合胞病毒进行检测，能更有效检测呼吸道合胞病毒及其基因分型(即是否携带毒素B基因),从而及早诊断，利于患者尽快治疗，并且避免过度治疗。
本申请提供以下技术方案：
本申请提供一种特异性结合呼吸道合胞病毒F抗原的单克隆抗体R309，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示。
另一方面，本申请提供一种特异性结合呼吸道合胞病毒F抗原的单克隆抗体R309，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。
在一些实施方案中，本申请所述的抗呼吸道合胞病毒F抗原的单克隆抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本申请的抗体可以是全长抗体，所述全长抗体包含恒定区，所述全长抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述全长抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM序列。
在一些实施方式中，本申请的抗呼吸道合胞病毒F抗原的单克隆抗体是由上述的抗呼吸道合胞病毒抗体或抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。
本申请另外提供一种呼吸道合胞病毒荧光量子点快速检测试纸，其中将R309单克隆抗体标记量子点配制备而成。
本申请提供另外一种用于快速检测呼吸道合胞病毒P蛋白基因的试纸条RPA(LFDRPA)检测试剂盒，含有侧流层析试纸条，以及有一对引物和一条探针，其中所述上游引物序列如SEQ ID NO:9所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO:10所示，所述探针的序列如SEQ IDNO:11所示。
具体的，上游引物(SEQ ID NO:9)：
CAAGATTAGATAGGATTGATGAAAAATTAAG
下游引物(SEQ ID NO:10)：
Biotin-CACTTTCCTCATTCCTGAGTCTTGCCATAGC
探针序列(SEQ ID NO:11)：
FAM-GGCAAGTGCAGGACCTACATCTGCTCGGGATGGTATAAGAGATGCCATGAT
在一些实施例中，本申请的探针在中间距5’端35bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端34bp和36bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。
在一些实施例中，如上所述的核酸探针，所述荧光基团可替换为TAMARA，所述淬灭基团可替换为BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3’端的C3Spacer修饰可替换为磷酸基团或其他阻断基团。
所述试纸条带有检测线，检测线上固定有分子A；
序列如SEQ ID NO.10所述的引物，其末端带有特异性结合前述分子A的分子B。所述分子A是生物素配体，分子B是生物素。
在本申请所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
本申请提供的试纸条法，RPA探针中间位置的两个胸腺嘧啶核苷酸上分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，两个基团之间设计一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被具有3'-5'外切酶活性的核酸外切酶III识别、切割，游离荧光基团，从而发出荧光信号随后被荧光检测的仪器；同时留下可延伸3’-OH，DNA聚合酶以探针为“正向引物”继续延伸合成DNA，与反向引物(带亲和标记，例如生物素)一起扩增出一种带有双重标记(荧光基团标记、亲和标记)的扩增产物；该产物在侧向流检测试纸中层析，遇到可识别亲和标记的试纸区域(通常为一条线，即“检测线”，带有链霉亲和素)时，则被富集，表现出线形荧光信号。试纸条法由于不依赖荧光定量PCR仪，成本和适用范围更广。
本申请进一步的，提供一种呼吸道合胞病毒的检测方法，它是使用前述引物和探针对样品进行扩增，再用核酸检测试纸条检测扩增产物即可。结果检测：结合试纸条进行显色，上述扩增产物吸取5μL-25μL，用缓冲液1×PBST稀释10倍-50倍，用相应标记的试纸条进行检测。结果判读：同时出现T线和C线为阳性(+)，仅出现C线为阴性(-)，只出现T线需考虑试纸条是否有效性。
在一些实施方式中，本申请提供一种核酸-抗体双重检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测呼吸道合胞病毒核酸的RPA试剂盒以及特异性检测呼吸道合胞病毒的含有抗RSV F抗原单克隆抗体的试纸条；所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO:9和10的引物以及SEQ ID NO:11的探针；所述含单克隆抗体的试纸条为将抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体R309标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条；其中，所述抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体R309包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
在一些实施方式中，本申请提供一种核酸-抗体双重检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测呼吸道合胞病毒核酸的RPA试剂盒以及特异性检测呼吸道合胞病毒的含有抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的试纸条；所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO:9和10的引物以及SEQ ID NO:11的探针；所述单克隆抗体的试纸条为将抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体R309标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条；其中，所述抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体R309单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示,轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。
一种检测呼吸道合胞病毒试剂盒的应用，所述试剂盒通过体外测定来自受试者的生物试样中是否存在呼吸道合胞病毒及其含量。
在一些实施方式中，本申请所述的生物试样为鼻咽分泌物，如鼻咽拭子或鼻腔冲洗液样本。
有益效果
本申请通过针对呼吸道合胞病毒的RNA序列进行分析获得了特异性针对呼吸道合胞病毒的RPA引物和探针，并制备出呼吸道合胞病毒检测试剂；同时针对呼吸道合胞病毒F抗原筛选并获得效果较好的单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制备获得呼吸道合胞病毒荧光量子点快速检测试纸，将以上两个检测方法进行组合使用，用于呼吸道合胞病毒患者的诊断，能够进一步提高检测的准确性，从而及早诊断，利于患者尽快治疗，适于大规模推广使用。
附图说明
附图用来提供对本申请的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请，并不构成对本申请的限制。
图1所示为抗呼吸道合胞病毒抗体反应性检测。
图2所示为抗呼吸道合胞病毒抗体亚型鉴定结果。
图3所示为抗呼吸道合胞病毒抗体中和测定。
图4A-4B所示为呼吸道合胞病毒的RPA反应灵敏度检测结果。其中图4A所示为RSVA型抗原的RPA反应灵敏度检测结果；图4B所示为RSV B型抗原的RPA反应灵敏度检测结果。
具体实施方式
以下结合附图对本申请的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本申请，并不用于限定本申请。
实施例1.制备重组RSV F抗原及RSV感染细胞
制备重组RSV F抗原：通过亚克隆将RSV F抗原胞外区(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，并在F抗原上添加6X-His标签或其他本领域技术人员常用标签。将对应于人类VκI信号肽的前导序列引入到氨基末端以促进分泌。构建产生pcDNA3.1-F ECD表达载体。按照厂商说明书，对重组RSV F蛋白胞外区进行表达和纯化。简言之，将表达载体转染293F细胞进行表达。72h后收集培养液上清并蛋白纯化。将5mL规格Ni柱(预装柱)连接于于纯化仪通路上，并用30mL体积Binding buffer平衡柱子，流速1mL/min，同时将收集盘收集体积设置为2mL/tube。将培养液上清5mL从仪器上样孔上样，流速0.5mL/min，待样品流穿柱体后，分别用30mL的Washing buffer和Elution buffer进行洗涤、洗脱，收集洗脱液，经超滤管脱盐浓缩，测得浓度并分装储存于-80℃备用。
制备感染RSV的细胞：研究表明RSV感染过的细胞表面有大量的F蛋白，因此制备感染RSV的细胞作为抗原。采用RSV感染HEp-2细胞，培养48h后，使用细胞刮板收集细胞，离心去除MEM培养基。用500μL1XPBS重悬细胞沉淀，现制现用。
实施例2.原位ELISA检测
培养Hep2细胞，待其生长至铺满90％的培养皿时，更换培养基，每个10cm培养皿留2mL培养基；从-80℃取出病毒菌种，置于37℃水浴锅中快速融化，每皿加入200μL病毒，晃动细胞培养皿使病毒与细胞充分接触；置于细胞摇床上孵育1h；每皿细胞加入10Ml MEM完全培养基，5％CO2，37℃培养24h。用胰酶消化感染后的Hep2细胞，离心收集细胞。将细胞重悬、吹成单个细胞后，计数，调整细胞浓度至5x105个/mL，将其加入96孔板中，每孔100μL。5％CO2，37℃培养24h至细胞完全贴壁；弃培养基，每孔加入50μL固定液，避光固定10min。弃固定液，每孔加入200μL PBS进行洗涤；每孔加入180μL封闭液，37℃封闭2h。弃封闭液，拍干后，加入待测抗体及相应二抗进行孵育，随后加入显色液、终止液完成显色过程，采用酶标仪读板，处理实验数据绘制成图。
实施例3.抗呼吸道合胞病毒F抗原抗体制备
采用实施例1纯化的重组RSV F蛋白作为抗原，免疫BALB/c雌性小鼠。重组蛋白与弗氏佐剂等体积(1mL：1mL)混合，用注射器法充分乳化，尾静脉注射法免疫小鼠，免疫剂量为100μg/只，共免疫3周。3周后，取实施例1制备的感染RSV的细胞，进行加强免疫。即取50μL实施例1中制备的感染RSV的细胞悬液进行脾脏免疫。3天后，取免疫后的BALB/c小鼠脾脏研磨并分离脾细胞，使用PEG法将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用20％1640HT培养基重悬，加入1％氨基蝶呤，然后均匀铺于96孔板内，37℃，5％CO2培养。融合后的细胞在培养一周左右后进行半量换液，换液3天后，取培养上清，用实施例2所述的原位ELISA方法进行阳性克隆的检测。采用有限稀释法，将筛选出的阳性克隆进行克隆化培养。同样以原位ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株并将其命名为R309。扩大培养后，冻存杂交瘤细胞。
实施例4.单克隆抗体的纯化
取BALB/c小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，经腹腔注射降植烷，0.5ml/只。1周后，每只小鼠经腹腔接种约1X106个杂交瘤细胞；7～10d后，收集腹水。将腹水经10000×g离心30min后，弃沉淀，用50％硫酸铵盐析粗提,PBS溶解，流水透析5h；用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析平衡过夜；上样，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱杂蛋白，用不同pH值的柠檬酸盐洗脱液洗脱，分段收集洗脱峰，浓缩后，得到纯化后的抗呼吸道合胞病毒抗体R309。
实施例5.抗呼吸道合胞病毒抗体反应性检测
采用原位ELISA方法，即使用RSV感染后的Hep2作为抗原，经固定液处理后，对抗RSV F蛋白单克隆抗体与细胞表面的F蛋白的结合活性进行初步检测。将起始浓度为10μg/mL的抗RSV单克隆抗体按1：10的比例倍比稀释，稀释6个梯度。结果如图1所示，R309抗体以剂量依赖性方式结合RSV F蛋白。
实施例6.抗呼吸道合胞病毒抗体亚型鉴定
根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例4中纯化的抗呼吸道合胞病毒抗体R309样品加入样品孔中，每孔50μL，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μL，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显色液，每孔100μL，室温避光显色15min。加入100μL终止液，终止显色反应。结果如图2所示，本申请的单克隆抗体为IgG2b亚型。
实施例7.单克隆抗体序列确定
从液氮中取出R309杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μL，加入1.0μL oligo(dT)(10μM)，加入1μL dNTPs(10mM)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μL RT buffer(5×)，1.0μL DTT(100mM)，1μL Ribonuclease Inhibitor及1μL逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。其中，引物序列的设计按照文献(Bodo Brocks.Species-Crossreactive scFv Against the Tumor Stroma Marker“Fibroblast Activation Protein”Selected by Phage Display From an ImmunizedFAP-/-Knock-Out Mouse)进行。
测序结果显示,本申请所述的抗呼吸道合胞病毒抗体R309的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；该抗体的重链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；轻链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
实施例8.抗RSV抗体中和测定
将密度为5x105个/mL的Hep2细胞加入96孔板中，每孔100μL。5％CO2，37℃培养。将浓度为100μg/mL的抗RSV单克隆抗体按1：10的比例倍比稀释，并与等体积的RSV A型病毒或RSV B型病毒混合(MOI＝2)，37℃孵育1h。1h后，取100μL病毒与抗RSV F蛋白抗体的混合液，加入含有细胞的96孔板中，37℃孵育24h。24h后，使用多功能酶标仪读取荧光强度。使用GraphPad软件分析数据，计算样品的中和效价，以IC50值表示。结果如图3所示，抗RSV F蛋白抗体R309既可以中和RSV A型病毒，又可以中和RSV B型病毒，为广谱抗体；其中抗体R309中和RSV A型病毒的IC50值约为0.02319μg/mL，中和RSV B型病毒的IC50值约为0.03533μg/mL。
实施例9.抗呼吸道合胞病毒多克隆抗体的制备
采用实施例1纯化的重组RSV F蛋白作为抗原，免疫雌性家兔。重组蛋白与弗氏佐剂等体积(1mL：1mL)混合，用注射器法充分乳化，尾静脉、背部多点注射法免疫兔子，免疫剂量为500μg/只。此后采用弗氏不完全佐剂与重组F抗原等体积混合，采用尾静脉、背部多点注射法免疫，免疫剂量为500μg/只，共免疫3周。3周后，取实施例1制备的感染RSV的细胞，进行加强免疫。即取200μL实施例1中制备的感染RSV的细胞悬液进行脾脏免疫。末次免疫后一周心脏采血，采集的血清先在室温静置2h后转移至4℃静置过夜，4000rpm离心15min，收集上清分装于5mL离心管，-80℃备用。取部分血清进行血清效价检测。剩余血清自-80℃取出后室温融解，准确取0.5m L血清用平衡液1:20稀释为10mL后，经0.45μL滤器过滤于新离心管。将Protein A预装柱连接入纯化仪通路，取10mL平衡液以1mL/min的流速平衡柱子。取处理后的血清上样，流速0.5mL/min。同时点击开启收集盘，将收集体积设置为1.5mL/tube。分别用10mL的平衡液和洗脱液进行洗涤、洗脱，同时向收集盘收集管内添加300μL/tube的中和液，以免纯化抗体在酸性洗脱液中变性、降解。纯化结束后将洗脱液汇总，经过超滤管超滤脱盐浓缩，得到抗呼吸道合胞病毒F蛋白的多克隆抗体，检测抗体浓度并分装储存于-80℃备用。
实施例10.呼吸道合胞病毒荧光量子点快速检测试纸的制备
取1mL羧基修饰荧光量子点，18000rpm离心20min，沉淀用0.1mol/L MES溶液重悬后离心2次，加入5mmol/L EDC和2mmol/L NHS活化反应30min，活化后加入0.5mg实施例4纯化的抗RSV F蛋白单克隆抗体R309，37℃恒温箱反应3h，加入5％BSA封闭剩余的活化位点并反应30min；标记好的抗体经离心纯化并用含1％BSA的PBS溶液重悬，4℃保存。将羊抗鼠IgG用PBS缓冲液配制为0.5mg/mL，将实施例9纯化的抗RSV F蛋白多克隆抗体用PBS缓冲液配制为1mg/mL，包被硝酸纤维素膜。将羊抗鼠IgG喷涂在质控线(C线)位置，将包被抗体喷涂在检测线(T线)位置，37℃干燥4h。将干燥后的硝酸纤维素膜与玻璃纤维垫、吸水纸、PVC背板组装，裁切后得到检测用RSV快速检测试纸。检测时将量子点标记抗RSV F蛋白抗体1∶100倍稀释，取20uL与40uL样品混合后滴加到RSV快速检测试纸的加样端，反应15min后用荧光免疫层析检测仪检测。若T线和C线均出现荧光条带，判定为阳性；若C线出现荧光条带，T线无条带，判定为阴性；若C线无条带，无论T线是否有条带均判定该试纸条无效。
实施例11.呼吸道合胞病毒荧光量子点快速检测试纸的特异性评价用实施例10中制备的试纸条，分别检测阴性参考品腺病毒(HAdV)、甲型流感病毒(IFVA)、乙型流感病毒(IFVB)、副流感病毒1(PIV1)、副流感病毒2(PIV2)、副流感病毒3(PIV3)，以及不同亚型的阳性参考品RSV A型和RSV B型。通过观察结果分析试纸条的特异性。
检测结果如表1所示，结果表明呼吸道合胞病毒荧光量子点快速检测试纸与HAdV、IFVA、IFVB、PIV1、PIV2和PIV3的结果均为阴性，与RSV A型和RSV B型的反应结果为均为阳性，表明本申请制备的试纸条具有良好的特异性，且能同时检测A型和B型呼吸道合胞病毒，具有良好的广谱性。
表1
样品名称 T线 C线
HAdV - +
IFVA - +
IFVB - +
PIV1 - +
PIV2 - +
PIV3 - +
RSV A型 + +
RSV B型 + +
实施例12.RPA特异性检测引物的设计
对多种亚型的呼吸道合胞病毒的基因序列进行比对，最终选择保守型较高的P基因作为靶基因扩增区域。根据RPA引物设计原则在P基因区域手工设计引物，借助Oligo等相关生物学软件进行初步评估，并利用RPA凝胶反应体系进行引物筛选，最后确定扩增效率高和特异性好的引物作为选定的引物。在设计好的引物扩增片段序列内部，根据RPA探针设计原则手工设计RPA探针，并使用Oligo等相关分子生物学软件进行评估，引物和探针的合成和HPLC纯化由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
检测呼吸道合胞病毒P基因的RPA引物、探针组序列如下所示：
上游引物(SEQ ID NO:9)：
CAAGATTAGATAGGATTGATGAAAAATTAAG
下游引物(SEQ ID NO:10)：
Biotin-CACTTTCCTCATTCCTGAGTCTTGCCATAGC
探针序列(SEQ ID NO:11)：
FAM-GGCAAGTGCAGGACCTACATCTGCTCGGGATGGTATAAGAGATGCCATGAT
在探针中间距5’端35bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端34bp和36bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。
实施例13.呼吸道合胞病毒RNA提取
使用病毒RNA提取试剂盒(天根)进行临床标本的病毒RNA的提取，整个核酸提取过程严格按照试剂盒说明书操作进行，具体操如下:用移液器将560μL Carrier RNA工作液(为裂解液RV+与Carrier RNA溶液的混合液)加入一个干净的1.5ml离心管中。向离心管中加入140μL血浆/血清/淋巴液/无细胞体液/细胞培养上清液/尿液(样品需平衡至室温)，涡旋振荡15s混匀，室温孵育10min。加入560μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15s，瞬离，仔细将离心管中的630μL液体转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在2mL收集管中)，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃掉装有废液的收集管，将吸附柱放入一个新的2mL收集管中，重复2次。打开吸附柱盖子，加入500μL GD缓冲液，8000rpm离心1min，弃掉装有废液的收集管，将吸附柱放入一个新的2mL收集管中。加入500μLRW漂洗液，8000rpm离心1min，弃掉装有废液的收集管。将吸附柱放入一个新的2mL收集管中，12000rpm离心3min。将吸附柱放入一个RNase-Free超净离心管(1.5mL)中，向膜中央加入60μL RNase-Free ddH2O，盖上盖子，室温放置5min。8000rpm离心1min。
实施例14.RPA反应灵敏度检测
制备RSV A和RSV B阳性质粒标准品为模板，进行十倍梯度稀释，使稀释后的终浓度分别为104-100拷贝/反应，以无核酶水作为阴性对照，采用实施例12筛选的引物、探针组进行RPA反应。
RPA反应体系为50μL，其中，2μL正反向引物(10μM)，2μL反向引物(10μM)，0.6μL探针，25μL含重组酶、反转录酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV的缓冲液，1μL模板和17.9μL ddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μL的280mM醋酸镁，将反应管置于实时荧光PCR仪中38℃恒温反应30min；结果如图4A-4B所示，RSV A和RSV B实时荧光RT-RPA方法最低可分别检测到每反应10拷贝的含目的基因的重组质粒。
实施例15.呼吸道合胞病毒RPA检测试纸条的制备及特异性检测
链霉亲和素包被的纳米金颗粒的制备:取1ml纳米金颗粒溶液(0.15pmol/mL)，加入200mM的硼砂溶液,调整pH值至9.5。同时,在另一个试管中将2μL的链霉亲和素(2mg/ml)与398μL的硼砂溶液(2mM)混合；将稀释的链霉亲和素加入到前述的纳米金颗粒溶液中,以50μL的量递加，边加边搅拌。将混合物置室温放置45分钟,加入含有155.6μL含10％BSA的2mM硼砂溶液,继续将溶液在室温放置10分钟，4500g离心15分钟，吸弃液体，用1ml的洗涤液(含有10g/L BSA的2mM硼砂溶液)重悬沉淀，4500g离心15分钟,吸弃液体,将红色的沉淀重悬在250μL含有5％BSA、137mM NaCl和0.025％吐温-200的缓冲液中。按照此比例制备足量的链霉亲和素包被的纳米金颗粒,取250μL上述包被的纳米金颗粒滴加到7mm×300mm激光切割的玻璃纤维垫上,使之扩散均匀,在实验台上干燥过夜。
胶体金侧向流免疫层析试纸条的制备:用含有5％甲醇、2％蔗糖的100mM碳酸氢钠缓冲液将抗羧基荧光素抗体和生物素化的抗鼠IgG分别稀释到终浓度为0.5mg/ml和1.0mg/ml。所有抗体均用侧向流试剂分配器,分配器头的速度设定在1～3厘米/分钟,优选为2厘米/分钟,注射泵的流速设定在0.1～0.3ml/分钟,优选为0.1ml/分钟。当两种抗体在纸条上点样完成后,将试纸条在37℃干燥1小时。然后按照如下步骤进行试纸卡的装配:首先将一个17mm×300mm的吸收垫放在塑料支撑的硝酸纤维素膜的右手下游端,二者重叠2毫米；随后将一个7mm×300mm含有干燥金纳米颗粒的玻璃纤维垫放在硝酸纤维素膜的左手上游端,二者重叠2毫米；最后将一个12mm×300mm的玻璃纤维样品垫放在金纳米颗粒垫的左手端,二者重叠2毫米。装配完成后,将试纸卡立即裁成3mm宽的试纸条即得到胶体金侧向流免疫层析试纸条,密封、干燥保存。
此外，呼吸道合胞病毒的RPA试剂盒包括实施例12中设计的引物和探针、水解缓冲液、酶混合物、醋酸镁(280mM)、无核酸酶纯水以及侧向层析试纸条，试纸条带有检测线，检测线上固定有分子链霉亲和素，能够与引物SEQ ID NO:10末端的生物素特异性结合。
将所述的试纸条分别检测HAdV、IFVA、IFVB、PIV1、PIV2和PIV3基因组，以确定本申请RPA检测方法的特异性。RPA反应体系为50μL，其中，2μL正反向引物(10μM)，2μL反向引物(10μM)，0.6μL探针，25μL含重组酶、反转录酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV，1μL样品和17.9μL ddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μL的280mM醋酸镁。反应温度设为38℃的水浴锅中进行，反应时间设定为30min。结果表明，呼吸道合胞病毒RSV A和RSVB样本均同时出现T线和C线，其他病原体的样本仅出现C线，说明本申请的RPA试纸条试剂盒可以有效检测呼吸道合胞病毒，结果如下表2所示。
表2
样品 LFD RPA T线 LFD RPA C线
HAdV - +
IFVA - +
IFVB - +
PIV1 - +
PIV2 - +
PIV3 - +
RSV A型 + +
RSV B型 + +
实施例16.实际样品检测
取RSV A、RSV B患儿鼻咽分泌物物样本共310个，同时取阴性对照样本100个，样本均来源于山东大学齐鲁医院。
对上述样本分别采用荧光量子点快速检测试纸以及试纸条RPA进行检测，检测结果见表3。从表3结果可以看出，抗体荧光量子点试纸条和RPA试纸条的方法均可以较好的检测呼吸道合胞病毒A、B型阳性患者，荧光量子点快速检测试纸检测的阳性率为94.5％，试纸条RPA检测阳性率为93.8％，荧光量子点快速检测试纸检测与试纸条RPA联合检测呼吸道合胞病毒的阳性率达到为100％，两者联合检测高于其单独检测。因此荧光量子点快速检测试纸检测与试纸条RPA的联合应用进一步提高诊断的正确率。将呼吸道合胞病毒F抗原检测与P蛋白基因检测二者结合，可以起到良好的补充，加强检测结果的准确性。
表3
Figure BDA0003161764500000141
序列表
<110> 北京保图生物技术有限公司
<120> 快速检测病毒的试剂盒及其制备方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ala Arg Asp Lys
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Ile Asn Gly Cys Arg Thr Ala Asn Asn Pro Cys Lys Ile Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Ala Ser Pro Glu Asn Ile Asp Arg Gln Asp Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Ala Arg Pro Asp Thr Ile Asn Gly Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Ile Gly Pro Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Trp Pro Ile Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Lys Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Gly Cys Arg Thr Ala Asn Asn Pro Cys Lys Ile Val
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Ser Pro Glu Asn Ile Asp Arg Gln Asp Gly Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ile Phe Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Asn Ala Arg Pro Asp Thr Ile Asn Gly
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Leu Ile Gly Pro Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Val Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met
65 70 75 80
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Pro Ile Ser
85 90 95
Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagattaga taggattgat gaaaaattaa g 31
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cactttcctc attcctgagt cttgccatag c 31
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcaagtgca ggacctacat ctgctcggga tggtataaga gatgccatga t 51

Claims (9)

1.一种特异性结合呼吸道合胞病毒的单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3,其轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
2.一种特异性结合呼吸道合胞病毒单克隆的抗体，其特征在于:所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示,其轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。
3.一种检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有由权利要求1或2所述的单克隆抗体标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条。
4.一种核酸-抗体双重检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求3所述的试剂盒和一种试纸条RPA检测试剂盒，所述试纸条RPA检测试剂盒包括一对引物和一条探针，所述的一对引物的序列如SEQ ID NO:9和10所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:11所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的探针标记有荧光基团、荧光淬灭基团、脱碱基位点及阻塞基团。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述荧光基团为FAM、荧光淬灭基团为BHQ1、脱碱基位点为dSpacer修饰及阻塞基团为C3Spacer修饰。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述荧光基团为TAMARA、荧光淬灭基团为BHQ2、脱碱基位点为四氢呋喃修饰及阻塞基团为C3Spacer修饰。
8.如权利要求4-7任一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于RPA扩增反应在温度设定为38℃的水浴锅中进行，反应时间为30min。
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