CN105601736A - 一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法，呼吸道合胞病毒中和抗体效价大于等于1:900。该制备方法包括：(1)筛选出呼吸道合胞病毒中和抗体效价不低于1:200的特免血浆；(2)将筛选出的高效特免血浆混合；(3)将上述混合血浆采用低温乙醇压滤法分离并结离子交换层析法纯化分离免疫球蛋白组分Ⅱ，经过滤、层析、超滤、配制、低pH孵放灭活病毒、纳米膜过滤去除病毒、分装得到纯度98％～100％的免疫球蛋白。该制备和生产方法得到的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的呼吸道合胞病毒进行治疗，具有安全、有效等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域的治疗用血液制品，特别是涉及一种呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)属副粘病毒科的肺炎病毒属，病毒颗粒呈不规则的表面粗糙的球形或丝状，直径约300-500mn，表面有脂蛋自组成的包膜，包膜内有直径13.5nm的螺旋样核衣壳，螺距6.5nm。RSV是2岁以下婴幼儿细支气管炎和病毒性肺炎的主要病原之一，并可诱发哮喘或使哮喘病情加重，也是老年慢性支气管炎病情加重和免疫功能低下者下呼吸道感染的重要病因。我国北方多见于冬春季，南方多见于夏秋季，常同气温骤降有联系，一旦气温上升，发病率即见下降。每年流行季节往往与婴幼儿下呼吸道感染发病率骤增的时间一致，当流行时，毛细支气管炎和肺炎在婴幼儿中的发病率也增高。我国RSV感染有以下特点：主要在婴儿中流行，1岁以下的婴儿发病率最高，随着年龄增大发病率下降，常出现流行性喘憋性肺炎，发病急、喘憋重；医源性感染增多。严重感染与宿主有关的危险因素有早产、年龄6个月以下、慢性肺疾患、先天性心脏病；环境因素有贫穷、人口密集、营养差、吸烟环境；增加感染频率的因素有年龄小、多胎、特应性家族史、父母缺乏教育、住房拥挤、同胞中有较大学龄儿、缺乏母乳喂养、日间托送、被动吸烟、9-12月份从新生儿重症监护室出院等。RSV感染病死率为l％，伴先天性心脏病、慢性肺疾患时病死率分别升至3.4％、3.5％。但是到目前为止，国内对RSV感染的预防和治疗既没有安全有效的疫苗，也没有特效药，国外治疗RSV感染常用RSV特异性免疫球蛋白(RSV-IVIG)和RSV单克隆抗体Palivizmuab。由于进口RSV-IVIG及Palivizmuab价格昂贵，因此研制国产RSV-IVIG有极大的实用价值和临床意义。
但是由于人免疫球蛋白制备过程中对于原料选择以及制备条件的要求比较苛刻，所以目前的人免疫球蛋白普遍存在效率低、性质不稳定等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种有效治疗呼吸道合胞病毒重症感染的人免疫球蛋白及其制备方法，使其应用于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,呼吸道合胞病毒中和抗体效价大于等于1∶900。
所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。免疫球蛋白的纯度为总蛋白的99％～99.8％。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.8％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
其中，PKA指激肽释放酶原激活剂，ACA指抗补体活性。
在制备该抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白时，原料血浆为呼吸道合胞病毒抗体效价不低于1∶200的血浆。
本发明所述抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白可以制成任意剂型，优选的剂型为液体制剂或冻干制剂。
本发明抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白可以用于治疗呼吸道合胞病毒重症感染，特异性好、高效、稳定、安全、可靠、保质期长等优点，可应用于工业化生产。
本发明还提供一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制备方法，包括以下步骤：
1)用中和试验法筛选出呼吸道合胞病毒不低于1:200的中和抗体效价滴度的原料血浆；
2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中呼吸道合胞病毒中和抗体效价滴度不低于1:500；
3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.1～0.2MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到成品。
进一步，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括如下：
(A)样品稀释：
血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释的样品液；
打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标明该板试验样本号、病毒性型号和代次；
在样品试验板的各样品孔中加入40μL细胞维持液,病毒回滴孔与阴性对照孔加入50μL细胞维持液；
将预先灭活的样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品10μL，每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为3％的胎牛血清的MEM液；
(B)攻击病毒：
攻击病毒液制备：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；
回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；
阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；
(C)细胞悬液的配制与添加：
细胞悬液的配制：取足够量的Vero细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(D)培养及观察统计：
将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
进一步，步骤(3)所述免疫球蛋白制备具体步骤包括如下：
(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度在1～4℃之间融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.0～7.4，加入浓度为54％的乙醇，使血浆中乙醇的最终浓度为7％～11％，使反应液的最终温度为-1～-3℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.9～6.0，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-2.0℃～-4.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；
(B)将上一步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4～6倍量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0～2.0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.10～5.20，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-4.5℃～-5.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；
向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.3～7.5，每升溶液补加2.8g氯化钠以提高反应液离子强度；加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9.0℃～-11.0℃，继续搅拌0.5小时，静置1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为呼吸道合胞病人免疫球蛋白的粗制品；
(C)将上一步加压过滤后的组分II用0～2℃注射用水溶解5～8小时，溶解温度控制在0℃～2.0℃；
将充分溶解的组分II过滤澄清，加入3％盐酸调节溶液的pH值至6.40～6.80之间，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30～1.50ms/m；
采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.40～6.80的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.40～6.80后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.40～6.80的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.70～4.00，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；
(D)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在2℃～6.0℃之间，蛋白浓度达到5％～8％(g/mL)时，加入2.0℃～6.0℃注射用水,使液蛋白浓度在2％～5％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定；透析过程中注意补加3％HCL适量以保持蛋白液pH在3.70～4.00；透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～8.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中；
(E)向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCL调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8～4.4，使最终制品中免疫球蛋白含量为50～55g/L，麦芽糖含量为8％～11％(g/mL)，抗体效价不低于1∶900，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活；
(F)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。
进一步，在加压过滤时，加入1％～2％(g/mL)的硅藻土做助滤剂，有利于提高过滤效果。
本发明所述抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1:900，可以针对性的对呼吸道合胞病毒进行治疗，是治疗呼吸道合胞病毒感染症的有效药物，具有较大的社会效益和经济效益。
本发明所述制备方法有以下优点：
(1)到目前为止，国内对RSV感染的预防和治疗既没有安全有效的疫苗，也没有特效药，国外治疗RSV感染常用RSV特异性免疫球蛋白(RSV-IVIG)和RSV单克隆抗体Palivizmuab。由于进口RSV-IVIG及Palivizmuab价格昂贵，因此研制国产RSV-IVIG有极大的实用价值和临床意义。本发明是国内首次对呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白特异性血浆筛选并进行工艺生产，同时对其工艺参数摸索优化，生产出的高效价呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白为国内首例，将填补国内缺乏该药物的市场空白。
(2)从健康人群中筛选出具有较高滴度的特异性原料血浆，其标准符合《中华人民共和国药典》2015版中“生物制品生产用血浆”规定，经低温乙醇压滤工艺结合柱层析纯化制备出高效价的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，是用于预防和治疗呼吸道合胞病毒所引起的婴幼儿细支气管炎和病毒性肺炎的有效药物，特异性高，对于提高患者的存活率具有重要的意义。
(3)采用中和试验法对原料及产品进行抗体效价的检测，该方法具有操作性强，灵敏度高、特异性好的优点。
(4)本发明在离心去除冷沉淀的基础上，进一步通过调节血浆pH至7.0～7.2，乙醇浓度至8％～10％，离心去除组分I沉淀，得到的组分I沉淀可以用来制作纤维蛋白原，提升的血浆的附加值，同时使后续制备的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白纯度更高，蛋白纯度达到100％。
(5)本发明对压滤后的组分III上清液通过摸索反应离子强度、pH和乙醇浓度，最终确定向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.55，按2.8g/L补加氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为25％，压滤分离组分II沉淀，该步反应最终确定反应液的离子强度、pH和乙醇浓度使得压滤得到的组分II沉淀量最大、免疫球蛋白纯度达到100％、效价不低于1:900。
(6)收集的特异性原料血浆，采用压滤机为主要分离设备，代替离心机进行静注人免疫球蛋白的生产，使分离的温度等条件容易控制，分离速度快，而且没有高速运转设备，生产安全性高；同时，采用离子交换层析法进行产品的进一步纯化，制备出的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制剂纯度达到100％，抗体效价不低于1∶900，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
各实施例中，细胞维持液为体积百分比3％的胎牛血清，购自Gibco；MEM细胞培养液购自Gibco。
Vero细胞，中文名称为非洲绿猴肾细胞，购自ATCC。
实施例1
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的呼吸道合胞病毒抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:200；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于56g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比3％胎牛血清,购自Gibco)的MEM细胞培养液(购自Gibco)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次，在样品板中每孔加入40μL细胞维持液，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液10μL/孔,每样品作竖向两孔平行。
(C)取呼吸道合胞病毒，用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，5％(体积分数)的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞悬液的配制和细胞悬加：
细胞悬液的配制：取足够量的Vero细胞(ATCC购买)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的MEM培养液(Gibco)，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:200；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价＝1:200；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:200。血浆样品以中和效价大于或等于1:200判为合格的高效价呼吸道合胞病毒特免血浆。
含较高滴度的特异性血浆在投产前进行混合检测，抗体滴度不低于1:900，连续三批混合血浆检测结果见表1-3。
表1第一批混合血浆检测结果
| 检测项目 | A(普通血浆) | B(高低度特异性血浆) |
| 蛋白含量 | 56.5g/L | 57.5g/L |
| RSV中和抗体效价 | 1:200 | 1:556 |
表2第二批混合血浆检测结果
| 检测项目 | A(普通血浆) | B(高低度特异性血浆) |
| 蛋白含量 | 56g/L | 57g/L |
| RSV中和抗体效价 | 1:220 | 1:566 |
表3第三批混合血浆检测结果
3.呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的制备：
(A)将1600名具有呼吸道合胞病毒抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为900L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:556；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆900L在温度在4℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.01，加入浓度为54％(v/v)的乙醇溶液158.3Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-2.1℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.93，加入浓度为95％(v/v)的乙醇溶液139.7Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-3.6℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂13.5Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀22.3Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入5倍量预冷的注射用水403Kg溶解，使反应温度控制在1.2℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.10，加入41Kg浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-5.2℃；
每吨血浆加入5.0kg硅藻土，搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.40，每升溶液补加2.8g氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(v/v)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-11.0℃，继续搅拌0.5小时，静置1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取80Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的粗制品。
(D)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用2℃注射用水溶解6小时，溶解温度控制在2℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％(m/v)盐酸调节溶液的pH值至6.59，用5％(m/v)氯化钠溶液调节溶液的电导为1.39ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.6的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.6后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.6的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.95，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(E)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在6℃，蛋白浓度达到7％(g/mL)时(100mL溶液中有7g)，加入6℃注射用水,使蛋白浓度达到3％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3％HCL适量以保持蛋白液pH在3.70～4.00。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～8.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(F)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.95，使最终制品中免疫球蛋白含量为55g/L，麦芽糖含量为10％(g/mL)，抗体效价为1∶1000，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法(用3％盐酸溶液滴定蛋白浓度为1％，滴定pH值至3.790-4.10)使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活。
(G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓上度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。
上述方法制备的抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,呼吸道合胞病毒中和抗体效价大于等于1∶900。免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。免疫球蛋白的纯度为总蛋白的99％～99.8％。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.8％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
该制备方法得到的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的呼吸道合胞病毒进行治疗，填补了国内对RSV感染的预防和治疗既没有安全有效的疫苗，也没有特效药，因此该发明有极大的实用价值和临床意义。
实施例2
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的呼吸道合胞病毒抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:200；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于56g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比3％胎牛血清,购自Gibco)的MEM细胞培养液(购自Gibco)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次，在样品板中每孔加入40μL细胞维持液，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液10μL/孔,每样品作竖向两孔平行。
(C)取呼吸道合胞病毒，用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，5％(体积分数)的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞悬液的配制和细胞悬加：
细胞悬液的配制：取足够量的Vero细胞(ATCC购买)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清(Gibco)的MEM培养液(Gibco)，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:200；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价＝1:200；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:200。血浆样品以中和效价大于或等于1:200判为合格的高效价呼吸道合胞病毒特免血浆。
3.呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的制备：
(A)将1660名具有呼吸道合胞病毒抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为1000L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:566；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆1000L在温度在1℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.4，加入浓度为54％(v/v)的乙醇溶液166.3Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-2.3℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.95，加入浓度为95％(v/v)的乙醇溶液145.5Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-2℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂14.8Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀82.5Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入6倍量预冷的注射用水495Kg溶解，使反应温度控制在0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.15，加入51Kg浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-4.5℃，按5.0Kg/吨血浆加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.50，每升溶液补加2.8g氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(v/v)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-10.5℃，继续搅拌0.5小时，静置1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取26.5Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的粗制品。
(D)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用0℃注射用水溶解5小时，溶解温度控制在0℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％(m/v)盐酸调节溶液的pH值至6.4，用5％(m/v)氯化钠溶液调节溶液的电导为1.35ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.4的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.4后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.4的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至4.00，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(E)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在4℃，蛋白浓度达到5％(g/mL)时(100mL溶液中有5g)，加入4℃注射用水,使蛋白浓度达到2％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3％HCL适量以保持蛋白液pH在3.70～4.00。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～8.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(F)配置：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为4.4，使最终制品中免疫球蛋白含量为50g/L，麦芽糖含量为8％(g/mL)，抗体效价为1∶1100，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法(用3％盐酸溶液滴定蛋白浓度为1％，滴定pH值至3.79-4.10)使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活。
(G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。
上述方法制备的抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,呼吸道合胞病毒中和抗体效价大于等于1∶900。免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。免疫球蛋白的纯度为总蛋白的99％～99.8％。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.8％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
该制备方法得到的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的呼吸道合胞病毒进行治疗，填补了国内对RSV感染的预防和治疗既没有安全有效的疫苗，也没有特效药，因此该发明有极大的实用价值和临床意义。
实施例3
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的呼吸道合胞病毒抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:200；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于56g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比3％胎牛血清,购自Gibco)的MEM细胞培养液(购自Gibco)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次，在样品板中每孔加入40μL细胞维持液，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液10μL/孔,每样品作竖向两孔平行。
(C)取呼吸道合胞病毒，用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，5％(体积分数)的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞悬液的配制和细胞悬加：
细胞悬液的配制：取足够量的Vero细胞(ATCC购买)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的MEM培养液(Gibco)，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:200；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价＝1:200；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:200。血浆样品以中和效价大于或等于1:200判为合格的高效价呼吸道合胞病毒特免血浆。
3.呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的制备：
(A)将1750名具有呼吸道合胞病毒抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为1100L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:545；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆1100L在温度在2℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.05，加入浓度为54％(v/v)的乙醇溶液178.5Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-2.5℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.92，加入浓度为95％(v/v)的乙醇溶液152.5Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-4℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂15.8Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀88.6Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4倍量预冷的注射用水540Kg溶解，使反应温度控制在2℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.2，加入58Kg浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-5.5℃，按5.0Kg/吨血浆加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.3，每升溶液补加2.8g氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(v/v)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9℃，继续搅拌0.5小时，静置1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取27.3Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的粗制品。
(D)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用1℃注射用水溶解8小时，溶解温度控制在1℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％(m/v)盐酸调节溶液的pH值至6.76，用5％(m/v)氯化钠溶液调节溶液的电导为1.36ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.76的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.76后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.76的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.7，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(E)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在2℃，蛋白浓度达到8％(g/mL)时(100mL溶液中有8g)，加入2℃注射用水,使蛋白浓度达到5％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3％HCL适量以保持蛋白液pH在3.70～4.00。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～8.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(F)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8，使最终制品中免疫球蛋白含量为54g/L，麦芽糖含量为11％(g/mL)，抗体效价为1∶900，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法(用3％盐酸溶液滴定蛋白浓度为1％，滴定pH值至3.79-4.10)使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活。
(G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。
上述方法制备的抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,呼吸道合胞病毒中和抗体效价大于等于1∶900。免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。免疫球蛋白的纯度为总蛋白的99％～99.8％。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.8％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
该制备方法得到的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的呼吸道合胞病毒进行治疗，填补了国内对RSV感染的预防和治疗既没有安全有效的疫苗，也没有特效药，因此该发明有极大的实用价值和临床意义。
质量检验
按上述工艺制备的抗呼吸道合胞病毒(RSV)人免疫球蛋白，其质量检验如下表4。
表4.抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白检验报告书
通过表4可以看出抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，各项指标均符合国家规定的标准，并且具有特异性好、安全、可靠等优点。具体使用时，可以采用静注或其他适合方式。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,其特征在于，呼吸道合胞病毒中和抗体效价大于等于1∶900。
2.根据权利要求1所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,其特征在于，所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。
3.根据权利要求1所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,其特征在于，免疫球蛋白的纯度为总蛋白的99％～99.8％。
4.根据权利要求1所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,其特征在于，所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.8％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
5.根据权利要求1所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,其特征在于，原料血浆为呼吸道合胞病毒抗体效价不低于1∶200的血浆。
6.根据权利要求1至5任一项所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白,其特征在于，剂型为液体制剂或冻干制剂。
7.一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用中和试验法筛选出呼吸道合胞病毒不低于1:200的中和抗体效价滴度的原料血浆；
2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中呼吸道合胞病毒中和抗体效价滴度不低于1:500；
3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.1～0.2MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到成品。
8.根据权利要求7所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制备方法,其特征在于，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括如下：
(A)样品稀释：
血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释的样品液；
打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标明该板试验样本号、病毒性型号和代次；
在样品试验板的各样品孔中加入40μL细胞维持液,病毒回滴孔与阴性对照孔加入50μL细胞维持液；
将预先灭活的样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品10μL，每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为3％的胎牛血清的MEM液；
(B)攻击病毒：
攻击病毒液制备：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；
回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；
阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；
(C)细胞悬液的配制与添加：
细胞悬液的配制：取足够量的Vero细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(D)培养及观察统计：
将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
9.根据权利要求7所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制备方法,其特征在于，步骤(3)所述免疫球蛋白制备具体步骤包括如下：
(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度在1～4℃之间融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.0～7.4，加入乙醇使血浆中乙醇的最终浓度为7％～11％，使反应液的最终温度为-1～-3℃，离心分离组分I，调节组分I上清液的pH到5.9～6.0，加入乙醇使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-2.0℃～-4.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；
(B)将上一步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4～6倍量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0～2.0℃,调节制品的pH值为5.10～5.20，加入乙醇使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-4.5℃～-5.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；
将组分III上清液中调节pH值为7.3～7.5，每升溶液补加2.8g氯化钠以提高反应液离子强度；加入乙醇使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9.0℃～-11.0℃，继续搅拌0.5小时，静置1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的粗制品；
(C)将上一步加压过滤后的组分II用0～2℃注射用水溶解5～8小时，溶解温度控制在0℃～2.0℃；
将充分溶解的组分II过滤澄清，调节溶液的pH值至6.40～6.80之间，并调节溶液的电导为1.30～1.50ms/m；
采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.40～6.80的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.40～6.80后上样，上样压力不超过1.5kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.40～6.80的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，调节溶液pH至3.70～4.00，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；
(D)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在2℃～6.0℃之间，蛋白浓度达到5％～8％(g/mL)时，加入2.0℃～6.0℃注射用水,使液蛋白浓度在2％～5％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定；透析过程中保持蛋白液pH在3.70～4.00；透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～8.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中；
(E)向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8～4.4，使最终制品中免疫球蛋白含量为50～55g/L，麦芽糖含量为8％～11％(g/mL)，抗体效价不低于1∶900，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活；
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10.根据权利要求9所述一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制备方法,其特征在于，在加压过滤时，加入1％～2％(g/mL)的硅藻土做助滤剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
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