CN105399816A - 一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法。具体地，本发明是以转基因脱脂乳汁为原料，综合了离心、过滤，与阳离子交换树脂进行搅拌吸附，用洗涤剂洗涤，用洗脱剂进行洗脱，以及过滤、浓缩等步骤。该方法适合工业化规模应用，具有更简单、省时、成本低、效率高、高纯度、高回收率等优点。

Description

一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法

技术领域

本发明属于乳制品分离领域，特别涉及一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法。

背景技术

乳铁蛋白分子的主体是一个相对分子质量约为80000的单肽链，并连接1-2个配糖体。乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中(包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞)，人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml，是牛乳中的10倍(牛乳中含量为0.02-0.35mg/ml)，占普通母乳总蛋白的20％，在泌乳期间，乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化，如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/ml，常乳期降至1mg/ml。

乳铁蛋白的主要作用功效是：

1.促进人体对铁的吸收。宝宝吮吸母乳后，在他的消化道内母乳中的乳铁蛋白会高亲和性地与铁结合，将铁运到小肠细胞内并释放出铁，以供给宝宝全身的需求。

2.乳铁蛋白另有一种特殊功能是具有抑菌、杀菌与抗病毒的作用，且对人体内的益生菌(如双歧杆菌)却并无害处。

3.乳铁蛋白还有促进和增强人体内的中性白细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的免疫作用，并且乳铁蛋白还对机体抗体的生成起调节完善作用，甚至有研究显示乳铁蛋白还可促进脑细胞和骨骼的生长，还有抗氧化的功能等等。

乳铁蛋白由于其强大的功能在婴幼儿配方产品、保健食品和发酵乳制品等领域的应用在许多发达国家已经为大家了解。乳铁蛋白作为食品添加剂在许多国家已被允许用于功能性食品中，并有试验证明其安全可靠，无副作用。美国食品药品管理局证实，乳铁蛋白不但可用于普通人群，而且可用于对牛奶过敏的特殊人群。

乳铁蛋白已经在一些发达国家如新西兰和澳大利亚实现工业化生产，通过运用超滤和冷冻干燥等技术，可以得到乳铁蛋白纯度超过90％的产品，同时保持产品的生物活性且不会有苦涩的味道，使之能够成功应用于保健食品和功能性食品中。

目前关于提纯乳铁蛋白(LF)的报道较多，最常用的方法是阳离子交换层析法，将奶制品离心脱脂，酸化脱酪或是凝乳酶脱酪，过层析柱，或用合适浓度的盐洗脱。然而各个方法结果之间有较大差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速有效、成本低、纯度高、回收率高，从转基因山羊乳汁中工业化分离人乳铁蛋白的方法。

在本发明的第一方面中，提供了一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法，包括步骤：

(1)对转基因山羊乳汁进行离心处理和过滤处理，从而得到脱脂乳清；

(2)对步骤(1)得到的脱脂乳清与弱酸性阳离子交换树脂进行搅拌吸附，从而得到吸附在该阳离子交换树脂上的脱脂乳清；

(3)对步骤(2)得到的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗涤剂洗涤，从而得到经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清；

(4)对步骤(3)得到的经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗脱剂进行洗脱，从而得到含人乳铁蛋白的洗脱液；

(5)对步骤(4)得到的含人乳铁蛋白的洗脱液进行过滤，收集滤液；

(6)对步骤(5)得到的滤液进行浓缩。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的离心处理为在45-60℃下，8000-10000r/min，离心15-30分钟；和/或步骤(1)中，所述的过滤处理为用纱布过滤。

在另一优选例中，所述的离心处理为在50-60℃下，8000-10000r/min，离心15-30分钟。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂为724树脂；和/或步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂和脱脂乳清的重量比为1：3－1：1；较佳地，为3：7。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的搅拌吸附进行4-8小时；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在4-20℃下进行；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在50-200r/min的转速下进行。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/LNaCl溶液；较佳地，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/LNaCl磷酸盐缓冲液。

在另一优选例中，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/LNaCl磷酸盐缓冲液，pH7.4。

在另一优选例中，步骤(3)中，在用洗涤剂洗涤之前，先用纯水对步骤(2)得到的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清进行洗脱，至溶液澄清。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述洗涤剂为1-5倍(优选为3倍)于树脂体积的0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.4。

在另一优选例中，步骤(3)中，洗脱1-5次；较佳地，洗脱4次。

在另一优选例中，步骤(3)中，每次洗脱10-60分钟；较佳地，每次洗脱30分钟。

在另一优选例中，步骤(4)中，所述洗脱液为8％±4％NaCl溶液或5％±2％硫酸铵溶液；较佳地，所述洗脱液为8％±4％NaCl磷酸盐缓冲液或5％±2％硫酸铵水溶液。

在另一优选例中，步骤(4)中，所述洗脱液为等树脂体积的8％NaCl磷酸盐缓冲溶液或等树脂体积的5％硫酸铵水溶液。

在另一优选例中，步骤(4)中，洗脱1-5次；较佳地，洗脱4次。

在另一优选例中，步骤(4)中，每次洗脱10-60分钟；较佳地，每次洗脱40分钟。

在另一优选例中，步骤(5)中，对步骤(4)得到的含人乳铁蛋白的洗脱液先用0.22微米的滤膜过滤，再用截留分子量为30000D的膜超滤，收集超滤液。

在另一优选例中，步骤(6)中，对步骤(5)得到的滤液进行浓缩脱盐。

在另一优选例中，在步骤(6)之后，还包括步骤：将对浓缩后的产品进行冻干。

在另一优选例中，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括对弱酸性阳离子交换树脂的预处理步骤：对弱酸性阳离子交换树脂依次经水、碱性溶液、酸性溶液、碱性溶液以及磷酸盐缓冲液处理。

在另一优选例中，所述碱性溶液为0.5-5％(较佳地，为3％或4％)的NaOH水溶液。

在另一优选例中，所述酸性溶液为1-5％(较佳地，为4％)的HCl水溶液。

在另一优选例中，所述磷酸缓冲液为0.05-0.5mol/L(较佳地，为0.2mol/L)的磷酸盐缓冲液，pH＝6.5。

在另一优选例中，所述磷酸缓冲液包括：0.2mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，pH＝6.5。

在另一优选例中，对弱酸性阳离子交换树脂依次进行如下处理：

先用水洗；

再用0.5-5％(较佳地，为3％)的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗涤至流出液的pH值7.5±0.2；

再用1-5％(较佳地，为4％)的HCl水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗涤至流出液的pH值5.5±0.2；

再用0.5-5％(较佳地，为4％)的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗涤至流出液的pH值7.5±0.2；和

最后用0.05-0.5mol/L(较佳地，为0.2mol/L)的磷酸盐缓冲液，pH＝6.5，处理1h。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为从转基因山羊乳汁中工业化提取人乳铁蛋白的工艺流程示意图。

图2为实施例2中，724树脂分离过程的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为上样脱脂脱酪乳清；2是724树脂吸附后的洗脱液；3是用5％硫酸铵溶液洗脱后的洗脱液；泳道4是超滤后纯化的rhLF。

图3为对比例1中，732树脂纯化过程的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1是上样脱脂脱酪乳清；泳道2是732树脂吸附后的洗脱液；泳道3是用5％硫酸铵溶液洗脱后的洗脱液；泳道4是人乳铁蛋白纯品(购自sigma)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种分离人乳铁蛋白的方法，其以转基因山羊乳汁为原料，综合采用了以下步骤：离心法去除杂质和脂肪、在吸附罐中与724树脂搅拌吸附和洗脱技术以及膜分离技术，从而从转基因山羊乳汁中分离得到纯度为90％以上的人乳铁蛋白。在此基础上，发明人完成了本发明。

本发明的分离方法优选可如图1所示，主要包括以下步骤：

1、脱脂、除杂：

将转基因山羊分泌的乳汁分装到离心瓶中，在一定温度(如50-60℃)下离心，8000-10000rpm，15-30分钟。离心后，用纱布过滤，去除沉淀(主要包括杂质和脂肪等)，收集脱脂乳清。

2、吸附、洗脱：

2.1724树脂的预处理：树脂需经过酸碱处理转型才能使用。

以树脂和脱脂乳清的总重量计算，按一定的重量比例(例如树脂：脱脂乳清＝1：1至1：3)称取724树脂，先用纯水洗，去杂质；

再用0.5％-5％的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；

用1％－5％的HCl水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近5.5；

再用0.5％-5％NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；

最后用0.05－0.5mol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝6.5，处理1h。

724树脂是一种大孔弱酸性的阳离子交换树脂。这种树脂价格低廉，在工业生产上已经用于鸡蛋溶菌酶的提取。

所述的磷酸盐溶液可选自下组：pH6.5，40mM磷酸盐缓冲液：用31.5体积的40mMNa₂HPO₄添加68.5体积的40mMNaH₂PO₄混合后配置而成。

2.2脱脂乳清与724树脂的搅拌吸附：

将步骤1得到的脱脂乳清和步骤2.1处理好的724树脂加入到搅拌吸附罐中，搅拌吸附4-8h。

该吸附罐设有搅拌功能、制冷功能等。该制冷功能可保证所有的反应在低温(如4－15℃)下进行。

该吸附罐设有pH电极，以方便测试溶液的酸碱度；该吸附罐还设置有固液相分离功能。

2.3杂蛋白的洗脱：

搅拌吸附后，用纯水洗脱多次，直到溶液澄清为止；再使用3倍树脂体积的0.1-0.5mol/LNaCl溶液，洗脱3次，每次30分钟。所述的NaCl溶液用40mmol/L磷酸盐溶液，pH7.4，配制。

所述的磷酸盐溶液可选自下组：pH7.4，40mM磷酸盐缓冲液：用81体积的40mMNa₂HPO₄添加19体积的40mMNaH₂PO₄混合后配置而成。

2.4洗脱人乳铁蛋白：

用等树脂体积的8％±4％NaCl溶液(优选为NaCl的磷酸盐溶液)或5％±2％硫酸铵溶液(优选为硫酸铵水溶液)洗脱被树脂吸附的人乳铁蛋白，洗脱4次，每次40分钟，收集每次的洗脱液。其中，所述的NaCl溶液可用40mmol/L磷酸盐溶液，pH7.4，配制。所述的磷酸盐溶液可选自下组：pH7.4，40mM磷酸盐缓冲液：用81体积的40mMNa₂HPO₄添加19体积的40mMNaH₂PO₄混合后配置而成。所述硫酸铵溶液可用去离子水配制。

3、超滤：

步骤2.4收集的洗脱液先用0.22微米的滤膜过滤，再用截留分子量为30000D的膜超滤，使乳铁蛋白与分子量小于30kD的小分子蛋白分离，去除杂蛋白，收集超滤液。所述超滤液是指被膜截留的液体，而不是透过膜的液体。

4.超滤液经浓缩脱盐后，冷冻干燥。

所述的浓缩可以是超滤浓缩，例如用截留分子量为5000Da的膜进行超滤浓缩。

干燥得到的产品可以经多种测试方法检测其产品成分、纯度、分子量等，例如可经SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定其组分的分子量。

本发明的主要优点包括：

本发明的分离方法主要是针对乳制品中提取乳铁蛋白所设计的，该方法操作简单、成本低，适合工业化生产。

与以脱脂脱酪为原料相比，本发明的方法更简单、省时。本发明的方法采用与弱酸性阳离子大孔交换树脂的搅拌吸附和解吸附更有利于从转基因山羊乳汁中分离得到纯度为90％以上的人乳铁蛋白。

此发明方法适合工业化规模应用，具有成本低、效率高、高纯度、高回收率等优点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试剂与原料

取新鲜转基因山羊分泌的乳汁(来自上海杰隆生物工程股份有限公司所制的人乳铁蛋白转基因山羊)100L，经测定，其中，人乳铁蛋白含量为0.8g/L。

实施例1重组人乳铁蛋白的分离(724树脂法)

1、脱脂、除杂：

将乳汁加热到55℃，用蝶式离心机(宜兴市海德分离机械有限公司，型号NRLDH5，转鼓速度为8000rpm)脱脂，用纱布过滤，去除沉淀(主要包括杂质和脂肪等)，脱脂奶冷却到4℃，共得到脱脂乳清85L。

2、在吸附罐中与724树脂搅拌吸附和洗脱技术

2.1724树脂的预处理：树脂需经过酸碱处理转型才能使用。

称取36.4kg724树脂(购自上海树脂厂有限公司，一种弱酸性阳离子交换树脂)，先用纯水洗去杂质；再用3％的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；用4％的HCl水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近5.5；再用4％的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；最后用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝6.5，处理1h。

2.2脱脂乳清与724树脂的搅拌吸附：

将步骤1得到的85L脱脂乳清和步骤2.1处理好的724树脂加入到搅拌吸附罐(购自新乡市力欧机械有限公司)中，在4-15℃下，搅拌吸附6h。

2.3杂蛋白的洗脱：

搅拌吸附后，用纯水洗脱多次，直到溶液澄清为止；再使用3倍于树脂体积的0.1mol/LNaCl溶液，该0.1mol/LNaCl溶液用40mmol/L磷酸盐溶液(0.1mol/NaCl,0.04mol/LNa₂HPO₄,pH7.4)，pH7.4配制，洗脱3次，每次30分钟。

2.4终洗脱液洗脱人乳铁蛋白：

使用等树脂体积的8％NaCl溶液洗脱被树脂吸附的人乳铁蛋白，洗脱4次，每次40分钟，收集每次的洗脱液160L。该8％NaCl溶液用40mmol/L磷酸盐溶液(用81体积的40mMNa₂HPO₄添加19体积的40mMNaH₂PO₄混合后配置而成)，pH7.4，配制。

3、膜超滤技术分离杂蛋白：

步骤2.4收集的160L洗脱液过0.22微米的滤膜过滤，用截留分子量为30000D的膜超滤，得超滤液液2L，将2L的超滤液浓缩脱盐，并冷冻干燥，得产品61.05g。

经Western-blot测定，该产品为人乳铁蛋白，而不是羊乳铁蛋白。

经SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，结果显示所得人乳铁蛋白组份为单一条带，相对分子质量为80kD。

经对SDS-PAGE电泳图各条带进行灰度扫描，测定人乳铁蛋白纯度为90％，人乳铁蛋白回收率为68.68％。

实施例2重组人乳铁蛋白的分离(724树脂法)

1、脱脂、除杂：

将乳汁加热到55℃，用蝶式离心机(同上)脱脂，用纱布过滤，去除沉淀(主要包括杂质和脂肪等)，脱脂奶冷却到4℃，共得到脱脂乳清85.5L。

2、在吸附罐中与724树脂搅拌吸附和洗脱技术

2.1724树脂的预处理：树脂需经过酸碱处理转型才能使用。

称取36.6kg724树脂(同上)，先用纯水洗去杂质；再用3％的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；用4％的HCl水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近5.5；再用4％的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；最后用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝6.5，处理1h。

2.2脱脂乳清与724树脂的搅拌吸附：

将步骤1得到的85L脱脂乳清和步骤2.1处理好的724树脂加入到搅拌吸附罐(同上)中，在4-15℃下，搅拌吸附6h。

2.3杂蛋白的洗脱：

搅拌吸附后，用纯水洗脱多次，直到溶液澄清为止；再使用3倍于树脂体积的0.1mol/LNaCl溶液，该0.1mol/LNaCl溶液用40mmol/L磷酸盐溶液(0.1mol/NaCl,0.04mol/LNa₂HPO₄,pH7.4)，pH7.4配制，洗脱3次，每次30分钟。

2.4终洗脱液洗脱人乳铁蛋白：

使用等树脂体积的5％硫酸铵溶液洗脱被树脂吸附的人乳铁蛋白，洗脱4次，每次40分钟，收集每次的洗脱液160L。该5％硫酸铵溶液用去离子水配制。

3、膜超滤技术分离杂蛋白：

步骤2.4收集的160L洗脱液过0.22微米的滤膜过滤，用截留分子量为30000D的膜超滤，得超滤液液2L，将2L的超滤液浓缩脱盐，并冷冻干燥，得产品63.05g。

经Western-blot测定，该产品为人乳铁蛋白，而不是羊乳铁蛋白。

经SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，结果显示所得人乳铁蛋白组份为单一条带，相对分子质量为80kD，如图2所示。

经对SDS-PAGE电泳图各条带进行灰度扫描，测定人乳铁蛋白纯度为90％，人乳铁蛋白回收率为70.93％。

对比例1重组人乳铁蛋白的分离(732树脂法)

1、脱脂、除杂：

将乳汁加热到55℃，用蝶式离心机(同上)脱脂，用纱布过滤，去除沉淀(主要包括杂质和脂肪等)，脱脂奶冷却到4℃，得到脱脂乳清85.5L。

2、在吸附罐中与732树脂搅拌吸附和洗脱技术

2.1732树脂的预处理：树脂需经过酸碱处理转型才能使用。

称取36.6kg732树脂(购自上海树脂厂有限公司)，先用纯水洗去杂质；再用3％的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近9.0；用4％的HCl水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近5.5；再用4％的NaOH水溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近9.0；最后用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝6.5，处理1h。

2.2脱脂乳清与732树脂的搅拌吸附：

将步骤1得到的85.5L脱脂乳清和步骤2.1处理好的732树脂加入到搅拌吸附罐(同上)中，在4-15℃下，搅拌吸附6h。

2.3杂蛋白的洗脱：

搅拌吸附后，用纯水洗脱多次，直到溶液澄清为止；再使用3倍于树脂体积的0.1mol/LNaCl溶液，该0.1mol/LNaCl溶液用40mmol/L磷酸盐溶液(0.1mol/NaCl,0.04mol/LNa₂HPO₄,pH7.4)，pH7.4配制，洗脱3次，每次30分钟。

2.4终洗脱液洗脱人乳铁蛋白：

使用等树脂体积的5％的硫酸铵溶液洗脱被树脂吸附的人乳铁蛋白，洗脱4次，每次40分钟，收集每次的洗脱液160L。该5％的硫酸铵溶液用去离子水配制。

3.将步骤2.4得到的洗脱液经SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，结果显示所用732树脂没能得到724树脂的纯化效果，人乳铁蛋白蛋白几乎没能获得有效纯化(见图3)。

比较结果可知，本发明的纯化工艺对人乳铁蛋白的纯化效率显著提高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)对转基因山羊乳汁进行离心处理和过滤处理，从而得到脱脂乳清；

(2)对步骤(1)得到的脱脂乳清与弱酸性阳离子交换树脂进行搅拌吸附，从而得到吸附在该阳离子交换树脂上的脱脂乳清；

(3)对步骤(2)得到的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗涤剂洗涤，从而得到经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清；

(4)对步骤(3)得到的经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗脱剂进行洗脱，从而得到含人乳铁蛋白的洗脱液；

(5)对步骤(4)得到的含人乳铁蛋白的洗脱液进行过滤，收集滤液；

(6)对步骤(5)得到的滤液进行浓缩。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的离心处理为在45-60℃下，8000-10000r/min，离心15-30分钟；和/或步骤(1)中，所述的过滤处理为用纱布过滤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂为724树脂；和/或步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂和脱脂乳清的重量比为1：3－1：1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的搅拌吸附进行4-8小时；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在4-20℃下进行；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在50-200r/min的转速下进行。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/LNaCl溶液；较佳地，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/LNaCl磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述洗脱液为8％±4％NaCl溶液或5％±2％硫酸铵溶液；较佳地，所述洗脱液为8％±4％NaCl磷酸盐缓冲液或5％±2％硫酸铵水溶液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，对步骤(4)得到的含人乳铁蛋白的洗脱液先用0.22微米的滤膜过滤，再用截留分子量为30000D的膜超滤，收集超滤液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，对步骤(5)得到的滤液进行浓缩脱盐。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)之后，还包括步骤：将对浓缩后的产品进行冻干。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括对弱酸性阳离子交换树脂的预处理步骤：对弱酸性阳离子交换树脂依次经水、碱性溶液、酸性溶液、碱性溶液以及磷酸盐缓冲液处理。