CN102268418B - 一种从乳汁中纯化溶菌酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从乳汁中纯化溶菌酶的方法，具体地，本发明结合阳离子树脂和膜超滤技术，获得高纯度含溶菌酶的溶液。本发明方法适合规模化应用，具有成本低、高效率，获得的产品纯度和回收率高等优点。

Description

一种从乳汁中纯化溶菌酶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种快速、高效的从乳汁中纯化溶菌酶的方法。本发明方法可用于对乳汁中的溶菌酶进行大规模纯化，且纯化效率高、成本低、纯化产品纯度高，适合工业化生产。

背景技术

天然溶菌酶(lysozyme)是一种在动物界和植物界中广泛存在的糖苷酶。1922年Alexander Flemin发现了多种粘液组织和分泌物中存在能够溶解多种革兰氏阳性菌的物质，他将这种溶解因子称为溶菌酶。后来Flemin还发现，溶菌酶在软骨组织和胃的匀浆液、泪液、唾液、痰、鼻腔分泌物、病理性的尿液、血清和淋巴细胞中都存在，但是在健康的尿液、脑脊髓或汗液中没有溶菌酶。

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种碱性酶，能水解致病菌细胞壁中的黏多糖，它主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可以与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

人溶菌酶的分子量为14600kDa，对人的溶菌酶研究发现，它由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，其一级结构氨基酸序列与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。

溶菌酶作为一种存在于生物体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，目前已知的主要作用有：

(1)抗菌消炎作用：溶菌酶的溶菌活性使其在预防和治疗多种细菌性疾病中均有重要作用，如由链球菌家族微生物引起的耳炎、窦炎、腺炎等。它还可以结合并失活何种诱发症的酸性物质，能增强抗生素和其他药物的疗效等。

(2)抗病毒作用：溶菌酶的正离子特性使其可以结合带负电的病毒蛋白使其失活。

(3)增强免疫力：溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，可以改善和增强巨噬细胞的吞噬和消化能力，激活白细胞的吞噬功能，并改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少等。

(4)止血、镇痛等作用。

另外，溶菌酶作为一种无毒、无副作用的具有抗菌功能的蛋白质，可用作天然的食品防腐剂，现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。

目前溶菌酶的纯化方法多采用结晶法。在结晶法中，对预处理的含溶菌酶的溶液，通过改变溶液条件，使溶菌酶以结晶态析出。这种方法操作简单，但其生产周期较长，产率相对偏低，高纯度产品获取过程复杂，并且此方法不能用以分离微量的溶菌酶。此外还有高效液相色谱法溶菌酶，其分离过程虽然快速简便，但是由于其仪器设备价格昂贵，所以其应用范围受到很大限制。

综上所述，目前还没有一种快速、高效的大规模纯化溶菌酶的方法，因此本领域迫切需要开发一种快速、高效的大规模化生产溶菌酶的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种快速、高效、大规模分离纯化溶菌酶的方法。

本发明的另一目的是提供一种适用于本发明方法的溶菌酶分离纯化装置。

在本发明的第一方面，提供了一种分离纯化溶菌酶的方法，包括步骤：

(a)将含有溶菌酶的脱脂乳清与阳离子树脂混合，从而使所述树脂吸附溶菌酶；

(b)对吸附了溶菌酶的树脂进行洗涤，从而洗去未吸附的杂蛋白；

(c)对经洗涤的所述树脂进行洗脱，从而获得含溶菌酶的洗脱液；

(d)对所述含溶菌酶的洗脱液进行超滤处理，从而获得分子量大于20kDa蛋白的组分(i)、含溶菌酶的组分(ii)和分子量小于8kDa蛋白的组分(iii)。

在另一优选例中，步骤(a)所述的含有溶菌酶的脱脂乳清是将含溶菌酶的乳汁经离心获得的。

在另一优选例中，步骤(a)所述树脂与含溶菌酶的溶液的比例为2∶8-4∶6(按体积计)，较佳地3∶7(按体积计)。

在另一优选例中，步骤(a)所述的混合为搅拌吸附。

在另一优选例中，步骤(a)所述的混合温度为低温，较佳地0-4℃。

在另一优选例中，步骤(a)所述的混合时间没有特别限制，较佳地2-12h，更佳地4-8h。

在另一优选例中，步骤(b)所述的洗涤为先用纯水洗涤，再用磷酸缓冲液洗涤，较佳地磷酸缓冲液中包含0.1mol/L NaCl，40mmol/L磷酸盐，pH为6.5。

在另一优选例中，步骤(c)所述的洗脱液为硫酸铵溶液，硫酸铵浓度为0.5-10wt％，较佳地2-8wt％。

在另一优选例中，步骤(c)所述的洗脱液的体积与步骤(b)获得的吸附了溶菌酶的树脂体积之比为1.2∶0.8-0.8∶1.2，更佳地为1∶1。

在另一优选例中，步骤(d)所述的超滤处理为：将含溶菌酶的洗脱液进行第一次超滤，获得分子量大于20kDa蛋白的超滤液，即组分(i)和含溶菌酶的透过液，对所述透过液进行第二次超滤，获得分子量小于8kDa蛋白的透过液，即组分(iii)和含溶菌酶的超滤液，即组分(ii)。

在另一优选例中，步骤(d)所述的超滤处理为：将含溶菌酶的洗脱液进行第一次超滤，获得分子量小于8kDa蛋白的透过液，即组分(iii)和含溶菌酶的超滤液，对所述超滤液进行第二次超滤，获得分子量大于20kDa蛋白的超滤液，即组分(i)和含溶菌酶的透过液，即组分(ii)。

在另一优选例中，所述分离纯化溶菌酶的方法，还包括对含溶菌酶的溶液进行后处理，包括步骤：

对所述含溶菌酶的组分(ii)进行冷冻干燥处理，或

对所述含溶菌酶的组分(ii)进行结晶处理，获得溶菌酶固态产品。

在另一优选例中，所述分离纯化溶菌酶的方法，还包括树脂前处理步骤：

(i)洗涤树脂，得到无杂质的树脂；

(ii)对步骤(i)处理后的树脂，用NaOH溶液进行搅拌浸泡；

(iii)对步骤(ii)的经NaOH溶液搅拌浸泡的树脂，用纯水进行洗涤；

(iv)对步骤(iii)获得的树脂，用HCl溶液进行搅拌浸泡；

(v)纯水洗涤步骤(iv)得到的树脂；

(vi)对步骤(v)获得的树脂，用NaOH溶液进行搅拌浸泡；

(vii)纯水冲洗步骤(vi)获得的树脂；

(viii)用缓冲液处理步骤(vii)得到的树脂，获得待用的树脂。

在另一优选例中，步骤(ii)所述NaOH溶液的浓度为1-5wt％，较佳地3wt％。

在另一优选例中，步骤(ii)所述的NaOH溶液浸泡时间没有特别限制，较佳地4h-6h。

在另一优选例中，步骤(iii)中，纯水洗涤多次，至流出液pH值为7.5。

在另一优选例中，步骤(vi)所述HCl溶液中HCl的含量为3-10wt％，较佳地4wt％。

在另一优选例中，步骤(v)中，纯水洗涤多次，至流出液pH值为5.5。

在另一优选例中，步骤(vi)所述的NaOH浓度为3-6wt％，较佳地4wt％。

在另一优选例中，步骤(vi)所述NaOH的浸泡时间没有特别限制，较佳地4h-6h。

在另一优选例中，步骤(vii)中，纯水冲洗多次，至洗出液pH为7.5。

在另一优选例中，步骤(vii)所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

在另一优选例中，所述分离纯化溶菌酶的方法，还包括树脂再生步骤：

(a)HCl溶液搅拌浸泡用过的树脂；

(b)对步骤(a)得到的树脂，用纯水进行清洗；

(c)对步骤(b)得到的树脂，用NaOH溶液进行浸泡处理；

(d)对步骤(c)得到的树脂，用纯水进行清洗，获得再生树脂。

在另一优选例中，步骤(a)所述HCl溶液含量为2-6wt％，较佳地4wt％。

在另一优选例中，步骤(a)所述HCl搅拌浸泡的时间没有特别限制，较佳地4-6h。

在另一优选例中，步骤(c)所述NaOH溶液的浓度为2-6wt％，较佳地4wt％。

在另一优选例中，步骤(c)所述NaOH的浸泡时间没有特别限制，较佳地4h-6h。

在另一优选例中，所述树脂为724树脂。

在另一优选例中，所述的脱脂乳清来自奶牛、水牛、山羊、奶山羊、绵羊和兔。

在另一优选例中，所述的脱脂乳清来自转基因的奶牛、水牛、山羊、奶山羊、绵羊和兔。

在另一优选例中，所述的脱脂乳清来自转基因山羊。

在另一优选例中，所述溶菌酶选自人、牛、羊或鸡的溶菌酶，较佳地为人溶菌酶。

在本发明的第二方面，提供了一种适用于本发明方法的搅拌反应器，所述反应器包括制冷装置、罐体、罐盖和罐体内设置搅拌器。

在另一选例中，所述搅拌反应器还设有用于实时监测搅拌反应的pH电极。

在另一选例中，所述搅拌反应器还包括两相分离装置。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了从转基因山羊乳汁中大规模提取人溶菌酶的工艺流程。

图2显示了不同纯化程度的溶菌酶SDS-PAGE电泳鉴定结果。

泳道M为标准分子量蛋白Marker，从上到下分子量分别为250kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、36kDa、28kDa、17kDa和11kDa；

泳道1为脱脂乳清；

泳道2为树脂吸附后的洗脱样品；

泳道3为硫酸铵的洗脱液；

泳道4和泳道5为超滤后纯化的人溶菌酶(rhLYZ)样品。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，含溶菌酶的脱脂乳清用阳离子树脂吸附并洗脱后所获得的洗脱液，不仅洗脱液中溶菌酶的含量很高，而且杂质基本上为分子量远大于溶菌酶的大分子蛋白(主要为分子量约80±10kDa的蛋白杂质)以及少量极低分子量多肽杂质(分子量小于约2kDa的蛋白杂质)，因此通过与膜超滤技术相结合，即可快速、简便地去除杂质蛋白，从而获得的高纯度(90％以上)的溶菌酶产品，且回收率很高(达70％以上)。

溶菌酶及其生产方法

溶菌酶作为一种具有多种药理作用的蛋白质，存在于生物体正常体液及组织中，乳汁和胎盘是获得天然人溶菌酶的主要来源，然而由于这些材料相当有限，造成天然溶菌酶很难大量获得，溶菌酶的价格过于昂贵，不利于大规模应用。

来源于除人外的其他物种的溶菌酶会引起许多副作用，例如，蛋清来源的溶菌酶可引起过敏反应，牛源的溶菌酶具有传染疯牛病的威胁，其他动物来源的溶菌酶由于与人的同源性较低，不适合人用药物。

生物技术的发展为克服上述限制提供了有效途径，通过基因工程的手段，构建乳腺反应器，能够在哺乳动物的乳汁中大量获得人溶菌酶蛋白，本领域的技术人员可以使用通用的方法在哺乳动物中生产溶菌酶。

可用于本发明的溶菌酶没有特别限制，可以是天然溶菌酶，也可以是重组表达的溶菌酶，可以是哺乳动物(如人、牛、羊)的溶菌酶，也可以是鸡(如蛋清)等非哺乳动物的溶菌酶。

对于重组生产溶菌酶而言，可以使用原核或真核细胞宿主细胞，也可以构建乳腺反应器生产重组溶菌酶。

较佳地，采用乳腺反应器技术获得含重组人溶菌酶的乳汁。例如，在申请号为CN200510110772.1的中国发明专利中，提供了一种在山羊乳汁中高效表达人溶菌酶蛋白的方法：首先构建人溶菌酶(rLYZ)的乳腺特异性表达构件，所述构件包括但不限于：β乳球蛋白基因的5’调控序列、溶菌酶基因组DNA的全部序列。在另一优选例中，所述特异性表达构件还可以包括polyA加尾信号、抗性标记等。用含有hLYZ的转基因细胞作为供核，山羊的卵母细胞作为供质，进行细胞克隆。对成活的克隆羊进行PCR和Southern-Blot分析，确认是否为转基因溶菌酶的山羊。对获得的转基因山羊进行人工激素泌乳诱导，收集乳汁，从而获得含有溶菌酶的原料。

原料及初步处理

适用于本发明的含溶菌酶的原料没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：含溶菌酶的羊乳汁、含溶菌酶的牛乳汁。

含溶菌酶的原料一般需要进过初步处理以便获得含有溶菌酶的脱脂乳清。

对于乳汁原料来说，一般使用离心的方法进行初处理，离心条件没有特限制，在一个优选例中，0-4℃低温离心，8000-10000rpm条件下，离心15-30分钟，下层为杂质，中层为含有溶菌酶的脱脂乳清，上层为脂肪，取中层进行下一步处理。

离子交换法和阳离子树脂

离子交换法(ion exchange process)是液相中的离子和固相中离子间所进行的一种可逆性的化学反应，它是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术，具有简便、高效、成本低，且可自动化连续操作的优点。

阳离子树脂与溶菌酶的结合是一种典型的离子交换反应，阳离子树脂的反应基团包括但不限于：磺酸基(-SO₃H)、羧基(-COOH)等。适用于本发明的阳离子树脂可以是强酸性阳离子交换树脂(如-SO3H型)和弱酸性阳离子交换树脂(如-COOH，-OH型)。

一种优选的阳离子树脂是724树脂。724树脂是一种大孔弱酸性的阳离子交换树脂，主要成分为聚酰胺，含有-COOH基团，具有交换容量高、洗脱速度快、机械强度高、抗有机物污染能力强、再生能力好、价格低廉的特点。

724树脂使用前需要进行前处理，使用后可以进行再生。本发明提供了一种724树脂前处理方法，包括步骤：

(i)纯水洗涤树脂，得到无杂质的724树脂；

(ii)对步骤(i)处理后的树脂，用NaOH进行搅拌浸泡；

(iii)纯水洗涤步骤(ii)得到的树脂；

(iv)对步骤(iii)获得的树脂，用HCl进行搅拌浸泡；

(v)纯水洗涤步骤(iv)得到的树脂；

(vi)对步骤(v)获得的树脂，用NaOH进行搅拌浸泡；

(vii)纯水冲洗步骤(vi)获得的树脂；

(viii)用缓冲液处理步骤(vii)得到的树脂，获得待用的724树脂。

此外，本发明还提供了一种724树脂再生的方法，HCl溶液搅拌浸泡用过的724树脂，然后用纯水进行清洗，对得到的清洗后的树脂，用NaOH溶液进行浸泡处理，用纯水对NaOH处理后的树脂进行清洗，获得再生树脂。

膜超滤技术

超滤技术通过膜表面的微孔结构对大小不同的物质进行选择性分离。当液体混合物在一定压力下流经膜表面时，小分子溶质透过膜(称为超滤液)，而大分子物质则被截留，使原液中大分子浓度逐渐提高(称为浓缩液)，从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。

与传统分离方法相比，超滤技术具有以下特点：

1.分离过程是在常温下进行，过滤条件温和，不会破坏超滤液和透过液的成分，特别适宜对热敏感的物质，如药物、酶等的分离、分级、浓缩与富集。

2.分离过程不发生相的变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染。

3.超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。

4.超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。

分离纯化溶菌酶的方法

本发明的提供了一种分离纯化溶菌酶的方法，包括(但不限于)以下步骤：

将含有溶菌酶的溶液(如含溶菌酶的脱脂乳清)与阳离子树脂混合，从而使所述树脂吸附溶菌酶；对吸附了溶菌酶的树脂进行洗涤，从而洗去未吸附的杂蛋白；对经洗涤的所述树脂进行洗脱，获得含溶菌酶的洗脱液；对所述含溶菌酶的洗脱液进行超滤处理，从而获得三个组分：

组分(i)：分子量大于20kDa蛋白的组分；

组分(ii)：含溶菌酶的组分；和

组分(iii)：分子量小于8kDa蛋白的组分。

在另一优选例中，超滤可以选择两种方法：

方法(1)：将含溶菌酶的洗脱液进行第一次超滤，获得分子量大于20kDa蛋白的超滤液，即组分(i)和含溶菌酶的透过液，对透过液进行第二次超滤，获得分子量小于8kDa蛋白的透过液，即组分(iii)和含溶菌酶的超滤液，即组分(ii)。

方法(2)：将含溶菌酶的洗脱液进行第一次超滤，获得分子量小于8kDa蛋白的透过液，即组分(iii)和含溶菌酶的超滤液，对超滤液进行第二次超滤，获得分子量大于20kDa蛋白的超滤液，即组分(i)和含溶菌酶的透过液，即组分(ii)。

本发明方法还可以包括后处理步骤：对含溶菌酶的组分(ii)进行冷冻干燥处理，或对所述含溶菌酶的组分(ii)进行结晶处理等，获得溶菌酶固态产品。

本发明一个优选例的工艺流程见图1：将获得的转基因山羊乳汁原料低温离心，原料分离为3层，上层为脂肪，下层沉淀为杂质，中层为脱脂乳清，将脱脂乳清与经过前处理的724树脂搅拌吸附，洗脱杂蛋白，获得较纯的溶菌酶-树脂的结合产物，用硫酸铵将溶菌酶洗脱下来，获得含有高浓度溶菌酶的洗脱液，用30kDa大小的滤膜对洗脱液进行超滤，超滤液中的蛋白质分子量大于30kDa，透过液为溶菌酶和其他分子量小于30kDa的蛋白质，用大小为3kDa的滤膜对透过液进行超滤，获得含高浓度溶菌酶的超滤液，对超滤液进行冷冻干燥，得到溶菌酶干粉制品。

本发明纯化溶菌酶的方法主要优点包括：

(1)分离过程简单快速，只需5-8小时；

(2)纯化成本低、效率高；

(3)获得的溶菌酶产品纯度和回收率很高，分别达到90％和70％以上；

(4)适合大规模化的工业应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用方法

本领域技术人员可以使用通用的方法对溶菌酶的活性和纯度进行测定。

配置底物溶液：称取溶酶小球菌15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5～1ml，在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50ml，使悬浮液在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。

测定方法：精密量取底物悬浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A0，然后将含有溶菌酶的水溶液加入上述比色池中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒时再测定吸收度A1；同时精密量取磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.15ml，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数A0’及60秒的读数A1’。

酶活单位定义：在室温、pH值6.2时，在波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。

实施例1

原料初步处理

原料的初步处理的目的是除去杂质和脂肪。本是实施例采用离心法进行初步处理。

取转基因山羊乳汁100L(来自上海转基因研究中心)，测定人溶菌酶的含量，为1g/L。将转基因山羊分泌的乳汁分装到离心瓶中，4℃低温离心，8000-10000rpm，离心15-30分钟。离心后去除沉淀杂质和上层的脂肪，取中间层的脱脂乳，纱布过滤后即为脱脂乳清，共85L，低温冷藏备用。

实施例2

阳离子树脂的处理和再生

树脂类型：724树脂。

724树脂宜经过酸碱处理转型再使用，并且用过的树脂可再生后循环使用。方法如下：

树脂前处理：

(1)纯水去除杂质，再用3wt％NaOH溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；

(2)4wt％HCl溶液搅拌浸泡4-6h后纯水清洗多次直到流出液的pH值近5.5；

(3)用4wt％NaOH溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗多次直到流出液的pH值近7.5；

(4)最后用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝6.5，处理724树脂1h。

用过的树脂再生：

4wt％HCl溶液搅拌浸泡4-6h，纯水洗后，4wt％NaOH溶液搅拌浸泡4-6h，用纯水洗涤，得到再生树脂。

实施例3

1.脱脂乳清与724树脂的搅拌吸附

树脂使用量：按体积计，按30％的比例称取树脂，即724树脂∶脱脂乳清＝30∶70。

将待用的724树脂与脱脂乳清(85L)加入到一容器或反应器中，在约0-4℃条件下搅拌吸附6小时。

2.杂蛋白的洗脱

搅拌吸附后，用纯水洗脱多次，直到溶液澄清为止；再使用3倍树脂体积的0.1mol/L NaCl，40mmol/L磷酸盐溶液，pH6.5，洗脱3次，每次30分钟，使得杂蛋白去除。

3.终洗脱液洗脱溶菌酶

使用等树脂体积的5％硫酸铵溶液(40mmol/L磷酸盐溶液配制，pH6.5)洗脱被树脂吸附的溶菌酶，洗脱4次，每次40分钟，收集每次的洗脱液。按脱脂乳清85L计，共洗得140L收集液。

4.膜超滤技术分离杂蛋白

将140L的收集液过0.22μm的滤膜去除杂质与细菌。

使用30kDa的膜系统超滤，使溶菌酶与分子量大于30kDa的大分子蛋白分离，得到超滤液和含有溶菌酶的透过液，收集透过液，共300L。

将透过液用3kDa的超滤系统浓缩脱盐，得到含有高浓度溶菌酶的溶液。

5.将高浓度溶菌酶溶液冷冻干燥，得到溶菌酶制品76.23g，纯度为92％，溶菌酶回收率＞70％。

经SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)验证纯化效果，如图2所示。泳道M为标准分子量蛋白Marker，从上到下分子量分别为250kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、36kDa、28kDa、17kDa和11kDa；泳道1为上样脱脂脱酪乳清；泳道2是树脂吸附后的洗脱样品；泳道3是硫酸铵的洗脱液；泳道4和5是超滤后纯化的重组人溶菌酶(rhLYZ)样品。结果表明，所得溶菌酶组分显示为单一条带，相对分子质量为14kD，纯化效果很好。

实施例4

重复实施例3的工艺方法，再次分离纯化溶菌酶，不同点在于：在搅拌吸附中，将待用的724树脂与脱脂乳清按30∶70的体积比加入到一具有搅拌和制冷功能的并配有pH电极的搅拌吸附罐中，在约0-4℃条件下搅拌吸附6小时，并在搅拌过程中通过pH电极监测溶液的酸碱，搅拌反应器还包括两相分离装置。

将新鲜的转基因山羊乳汁100L(人溶菌酶含量为1g/L)，离心后得脱脂乳清85.5L。85.5L脱脂乳清与724树脂在搅拌罐中结合6h，磷酸盐溶液洗脱杂蛋白，5％的硫酸铵溶液洗脱得145L的收集液。将145L的收集液过0.22μm的滤膜过滤除杂质与细菌，使用30KDa的膜超滤系统超滤得透过液500L，将透过液用3kDa的超滤浓缩脱盐，冷冻干燥得人溶菌酶制品81.42g，纯度为约91％，人溶菌酶回收率为74.13％。

实施例5-6

重复实施例3，不同点在于，按表1所述的条件进行处理。

表1

结果见表1，用3wt％的硫酸铵溶液和8wt％的硫酸铵溶液作为洗脱液，都得到了良好的洗脱结果。当脱脂乳清中溶菌酶的含量越高时，获得溶菌酶产品的纯度越高。

实施例5中，溶菌酶的纯度达到93％，实施例6中，溶菌酶的纯度达到95％。本发明方法对不同溶菌酶浓度的原料都有很好的分离效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种分离纯化溶菌酶的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将含有溶菌酶的脱脂乳清与阳离子树脂混合，从而使所述树脂吸附溶菌酶；

(b)对吸附了溶菌酶的树脂进行洗涤，从而洗去未吸附的杂蛋白；

(c)对经洗涤的所述树脂进行洗脱，从而获得含溶菌酶的洗脱液；

(d)对所述含溶菌酶的洗脱液进行超滤处理，从而获得分子量大于20kDa蛋白的组分(i)、含溶菌酶的组分(ii)和分子量小于8kDa蛋白的组分(iii)；

并且，步骤(b)所述的洗涤为先用纯水洗涤，再用磷酸缓冲液洗涤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的磷酸缓冲液中包含0.1mol/L NaCl，40mmol/L磷酸盐，pH为6.5。

3.如权利要求1所述的分离纯化溶菌酶的方法，其特征在于，步骤（d）所述的超滤处理包括步骤：

将含溶菌酶的洗脱液进行第一次超滤，获得分子量大于20kDa蛋白的超滤液，即组分(i)和含溶菌酶的透过液；

对所述透过液进行第二次超滤，获得分子量小于8kDa蛋白的透过液，即组分(iii)和含溶菌酶的超滤液，即组分(ii)。

4.如权利要求1所述的分离纯化溶菌酶的方法，其特征在于，步骤（d）所述的超滤处理包括步骤：

将含溶菌酶的洗脱液进行第一次超滤，获得分子量小于8kDa蛋白的透过液，即组分(iii)和含溶菌酶的超滤液；

对所述超滤液进行第二次超滤，获得分子量大于20kDa蛋白的超滤液，即组分(i)和含溶菌酶的透过液，即组分(ii)。

5.如权利要求l所述的方法，其特征在于，还包括对含溶菌酶的溶液进行后处理：

对所述含溶菌酶的组分(ii)进行冷冻干燥处理，或对所述含溶菌酶的组分(ii)进行结晶处理，获得溶菌酶固态产品。

6.如权利要求l所述的方法，其特征在于，还包括树脂前处理步骤：

(i)洗涤树脂，得到无杂质的树脂；

(ii)对步骤(i)处理后的树脂，用NaOH溶液进行搅拌浸泡；

(iii)对步骤(ii)的经NaOH溶液搅拌浸泡的树脂，用纯水进行洗涤；

(iv)对步骤(iii)获得的树脂，用HCl溶液进行搅拌浸泡；

(v)纯水洗涤步骤(iv)得到的树脂；

(vi)对步骤(v)获得的树脂，用NaOH溶液进行搅拌浸泡；

(vii)纯水冲洗步骤(vi)获得的树脂；

(viii)用缓冲液处理步骤(vii)得到的树脂，获得待用的树脂。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括树脂再生步骤，其特征在于，包括步骤：

(a)用HCl溶液对用过的树脂进行搅拌浸泡；

(b)对步骤(a)得到的树脂，用纯水进行清洗；

(c)对步骤(b)得到的树脂，用NaOH溶液进行浸泡处理；

(d)对步骤(c)得到的树脂，用纯水进行清洗，获得再生树脂。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树脂为724树脂。

9.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的脱脂乳清来自奶牛、水牛、山羊、奶山羊、绵羊和兔。

10.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的脱脂乳清来自转基因的奶牛、水牛、山羊、奶山羊、绵羊和兔。

11.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶选自人、牛、羊或鸡的溶菌酶。

12.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶为人溶菌酶。

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