CN102187935B - 一种制备酪蛋白磷酸肽与ace抑制肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，该方法以酪蛋白为原料，将酪蛋白加入到一级酶反应器中，采用单一或复配的第一蛋白酶进行一级酶解--超滤膜分离制备酪蛋白生物活性肽，用树脂层析方法从酪蛋白生物活性肽中分离CPP和CNPP，CPP部分通过纳滤浓缩脱盐，然后用喷雾干燥得到CPP粉末产品；将使用树脂层析法分离出的CNPP部分加入与超滤膜设备耦联的二级酶反应器中，采用单一或复配的第二蛋白酶进行二级酶解-超滤膜分离滤出ACE抑制肽，所得ACE抑制肽采用纳滤浓缩脱盐，然后用喷雾干燥得到ACE抑制肽粉末产品，采用本方法制备的酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽具有蛋白转化率高、工艺成本低、操作简单连续化、同时获得酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽两类产品。

Description

一种制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法

技术领域

本发明涉及生物活性肽技术领域，尤其涉及一种利用酶膜反应器与树脂层析集成所架构的系统来连续分离制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法。

背景技术

生物活性肽类食品是国际保健品行业研究和开发的热点之一，日本、美国和欧洲已率先推出具有各种功能的肽类食品及食品添加剂，形成了一种具有极大商品化前景的产业，新型功能性食品的开发有助于减少和控制与饮食有关的慢性疾病。

酪蛋白中富含多种生物活性肽，例如：酪蛋白磷酸肽、降血压肽、抗氧化活性肽、免疫活性肽、阿片活性肽、血管紧张素转化酶抑制剂、溶栓肽等多种功能肽，其中磷酸肽(CPP)是被研究和开发最早的一种，能与Ca²⁺、Fe²⁺等矿物质离子在小肠弱碱性环境形成可溶性络合物，具有显著促进矿物质吸收利用的生理活性，被誉为“矿物质载体”，并具有促进儿童骨骼和牙齿的发育，预防和改善中老年人骨质疏松症，促进骨折患者的康复，预防和改善缺铁性贫血，抗龋齿等多种功能。作为来自天然食品蛋白的磷酸肽CPP，使用安全可靠、易溶于水、不影响食品的风味、质地和透明度，从而更有益于改善人类钙缺乏而引起的多种疾病。

随着人们生活水平的提高，人们对缺钙缺铁的危险性认识也会随之提高，对补钙制剂以及补钙食品的要求也会日益提高，磷酸肽CPP将会被更多的应用到食品领域，这样市场对磷酸肽CPP的需求量会越来越大，而在国内除了广州轻工业研究所有少量的磷酸肽CPP产品上市，尚未见有工业化规模生产磷酸肽CPP的报道，因此研究一种可行的CPP生产工艺刻不容缓。让人欣喜的是，磷酸肽CPP正在被广泛的应用于食品行业中，石家庄维平功能食品科技有限公司研制出了添加有磷酸肽CPP的富钙富铁的梨汁。添加磷酸肽CPP的活性多肽啤酒也已经在山东中德啤酒有限公司研制成功。山东圣元乳业、龙丹乳业、伊利乳业都在其乳制品中添加磷酸肽CPP，恒寿堂研究开发的金乳钙中也添加有磷酸肽CPP，所以酪蛋白磷酸肽CPP的用途日益广泛。

非磷酸肽(CNPP)作为天然存在的且同时具有抗氧化活性和抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的物质，对高血压等疾病起到防治效果，且来源于食物蛋白质，完全可以克服药物治疗出现的副作用，进一步开发天然功能性生物活性肽产品将成为非药物治疗中的重要组成部分；酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白质，酶解产物复杂，结构多样性也使该类物质具有多种生理功能，是极具开发价值的一类生物活性物质。而如何完全实现工业化生产更是国内外学者的研究热点。

在现有技术中，已经出现利用乳源蛋白质制备生物活性肽方面的报道，如Mullally等(FitzGerald R J，Mullally M M，Meisel H.Identification of anovel angiotensin-i-converting enzyme inhibitory peptide corresponding to atryptic fragment of bovine beta-lactoglobulin.FEBS Letters，1997，402(2-3)：p.99-101)采用10KDa、3KDa和1KDa截流分子量超滤膜从β-乳球蛋白和乳清蛋白浓缩物的胰蛋白酶水解液中富集获得的ACE抑制肽，但未对酪蛋白来源的磷酸肽和非磷酸肽进行研究。

东北农业大学霍贵成教授等研究以酪蛋白为酶解底物，经蛋白酶C酶解后离心，上清液分别通过3KDa、10KDa的截留分子量超滤膜分离ACE抑制肽，证明了酪蛋白水解物中ACE抑制活性主要来源于小于3KDa的小分子量肽，其分子量主要集中在1500Da左右；但未报道可工业化连续生产并集分离纯化一体化得生产工艺。

江南大学王璋教授等(赵一明，酪蛋白非磷肽的制备及其ACE抑制活性的研究，江南大学硕士学位论文，2008年)对Alcalase酶解酪蛋白进行了较系统的研究，采用乙醇-氯化钙选择性沉淀法分离出CNPP，CPP的N/P摩尔比比为20～25，蛋白质得率35％以上，CNPP得率达到45％；并利用凝胶过滤色谱和RP-HPLC从CNPPs中分离得到一种ACE抑制肽；王璋教授等(胡俊刚，王璋，许时婴，谢良，杜东平.离子交换法制备酪蛋白磷酸肽.无锡轻工大学学报，2001，20(2)：113-116，121)还曾研究过CPP粗产品(N/P摩尔比为7.52)的分离纯化，采用大孔强碱性阴离子交换树脂CPP的回收率为：P为98.71％；N为82.78％；高纯度CPP产品的N/P摩尔比为5.441，并对阳离子树脂纯化CPP做了初步探讨，在pH 5.0的最优条件下，回收率P为81.85％，N为53.80％，N/P摩尔比为4.67。此外，王璋教授等(焦宇知，王璋.高N/P(摩尔比)酪蛋白磷酸肽生产工艺及初步分离纯化研究.食品科技，2006，1：27-30)研究了高N/P摩尔比CPP产品的生产，用纳滤工艺生产所得CPP的N/P摩尔比为24～32，灰分含量在6％；N和P的得率分别为85.46％和100％。该工艺以乙醇沉淀为初步分离工艺，在后继分离中采用过强碱性大孔阴离子树脂对CPP进行过纯化，并采用纳滤脱盐浓缩，其采用乙醇沉淀的工艺使得必须增加溶剂回收等工序，能耗相对较大。

天津大学齐崴等人(齐崴，何志敏，何明霞.酶解反应与膜分离耦合连续制备酪蛋白磷酸肽.化学工程，2006，34(4)：43～46，54)在其发明中提出酶解与膜滤集成连续制备酪蛋白生物活性多肽的工艺，使酶解反应转化率由50％增至80％，蛋白酶利用率提高1.5倍，工艺成本降低1倍。制得产品组成均一，安全无毒，应用前景广阔的活性多肽产品，但该工艺未对酶解产物中两类最主要的活性肽，即促钙吸收的磷酸肽CPP和具有降压作用的ACE抑制肽进行连续分离，限制了产品的应用和技术的推广实施。

天津大学乔文等人(乔文，齐崴，何志敏.离子交换树脂纯化酪蛋白磷酸肽研究，离子交换与吸附，2004，20(2)：144～151)研究了离子交换树脂法纯化粗品磷酸肽CPP(N/P摩尔比为12.722)的技术，CPP的收率60％以上，获得N/P摩尔比为5.362和N/P为8.681两种CPP产品，较之CPP粗品，含磷量及生理功效均有明显提高，该法也未能采用可连续实施的工艺，实现CPP和ACE抑制肽的同时生产。

CPP的N/P摩尔比在一定程度上反映了肽链中磷酸丝氨酰基的密集程度，N/P摩尔比越低，CPP中所含的磷酸丝氨酰基越多；通常N/P摩尔比在7.0～7.6的CPP制品被称为初级品，N/P摩尔比低于5.5的CPP制品称为高纯品；上述研究中有不少技术不能达到高纯CPP的生产，而研究表明CPP高纯品在阻止磷酸钙沉淀形成的效果上明显好于初级品。

目前，酪蛋白生物活性肽的生产工艺多采用间歇酶解-酸沉淀、钙-乙醇沉淀法制备，生产过程分批操作、酶耗大、蛋白转化率低、产物无法及时从反应体系中分离出去，造成底物浪费，工艺成本高，不能完全满足商品化市场需求。另有利用多级膜分离连续制备生物活性肽的工艺，但最终产品成分复杂，未能建立一套系统的连续分离纯化方案，无法达到工业化生产的目的。

发明内容

本发明的目的是，针对现有技术存在的问题提供一种利用酶膜反应器与树脂层析集成工艺来连续制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，具有蛋白转化率高、工艺成本低、操作简单连续化、同时获得酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽两类产品的特点。

本发明的技术方案如下：本发明以酪蛋白为原料，将酪蛋白加入到一级酶反应器中，采用单一或复配的第一蛋白酶进行一级酶解--超滤膜分离制备酪蛋白生物活性肽，用树脂层析方法从酪蛋白生物活性肽中分离磷酸肽CPP和非磷酸肽CNPP，CPP部分通过纳滤浓缩脱盐，然后用喷雾干燥得到CPP粉末产品；将使用树脂层析法分离出的CNPP部分加入与超滤膜设备耦联的二级酶反应器中，采用单一或复配的第二蛋白酶进行二级酶解-超滤膜分离滤出ACE抑制肽，所得ACE抑制肽采用纳滤浓缩脱盐，然后用喷雾干燥得到ACE抑制肽粉末产品；

本发明是按照下述技术方案实现的，其具体的工艺为：

(1)溶解：本发明采用甘肃华羚干酪素有限公司生产的食品级酪蛋白，在25℃～95℃条件下，将酪蛋白溶解在pH值6～12的碱溶液中，配制成质量浓度为2％～13％(w/w)的酪蛋白溶液。

(2)一级酶解反应与一次膜分离：该工艺是由一级酶反应器与不同截留分子量(如3KDa、5KDa或10KDa)的超滤膜设备耦联形成的一级酶反应器中进行；所述酶解反应为：将步骤1配制的浓度为2％～13％酪蛋白溶液加入至一级酶反应器，作为初始底物，并在搅拌状态下向一级酶反应器中加入第一蛋白酶，第一蛋白酶适宜温度控制在20～70℃与pH值6～11的条件下，第一蛋白酶与初始底物质量浓度之比为1∶10～40，所述的第一蛋白酶为胰蛋白酶(国药集团化学试剂)、胰酶(sigma公司产品)、ProteaseN(天野酶制剂公司产品)、Alcalase碱性蛋白酶(诺维信公司产品)、木瓜蛋白酶(sigma公司产品)中的一种或几种复配。

在上述酶解过程中，采用滴加NaOH溶液的方法维持体系pH值恒定在6～11之间，优选地控制在8.0～9.0之间，通过循环水浴加热维持体系温度恒定在20℃～70℃，在一级酶反应器中进行水解反应的同时，连续地由一级酶反应器罐底部将酶解液引入一级超滤设备中，通过该超滤设备及时滤出小分子目标肽，并将大分子底物和酶截留，所截留的回流液(第一回流液)返回一级酶反应器内循环酶解，从而提高蛋白的转化率及酶的利用效率；当有透过液(第一渗流液)流出至渗流液收集装置时，开启一级酶反应器的进料泵，进料速度相当于第一渗流液的流速，保证一级酶反应器罐液面维持不变，使整个装置进行连续酶解反应并不断的分离出目的产物，此处目的产物为酪蛋白生物活性肽。

(3)树脂层析：将上述一级酶解与膜分离出来酪蛋白生物活性肽在树脂层析柱上实现CPP与CNPP的连续分离纯化；由于CPP在一定pH值下带负电，容易被吸附到树脂上，而CNPP一般带正电，本发明的pH值控制在大于6时，即可保证CPP带负电，CNPP带正电；所以采用大孔阴离子交换树脂分离纯化CPP与CNPP时，CNPP可以直接被水洗脱，CPP可以直接用无机酸，如0.1M～0.5MHCl洗脱下来，从而达到分离二者的目的。

当上述酶解渗流液(第一渗流液)达到0.5～4个柱床体积时，以每小时0.5～3个床体积的流速上样至大孔阴离子交换树脂柱，并经220nm紫外检测收集水洗脱峰CNPP和酸洗脱峰CPP。本法制备的酪蛋白磷酸肽(CPP)N/P摩尔比达到3～14∶1，纯度高，且分子量均一稳定，溶解性达到100％，大幅度提高了CPP的质量，同时分离出的CNPP也可进一步分离制备ACE抑制肽、免疫活性肽、阿片活性肽、抗氧化肽等功能肽。

(4)二级酶解反应：将树脂层析分离的CNPP酶解产物加入与截留分子量为1KDa超滤膜设备耦联的二级酶反应器中，在搅拌状态下加入第二蛋白酶进行二次酶解，其中，二次酶解的第二蛋白酶与底物(CNPP酶解产物)质量比1∶10～40，维持二级酶反应器中反应体系温度恒定在20℃～70℃与pH值6.0～11的工艺条件。二次膜分离：连续由二级酶反应器底部将所述非磷酸肽酶解产物引入二级超滤设备中，滤出二级酶反应器第二渗流液，并将所截留的第二回流液返回二级酶反应器内循环酶解，所述第二渗流液为ACE抑制肽；二次膜分离这一步是通过酶的筛选和控制分子量范围来提高ACE抑制肽的活性，关键是在酶的选择和膜截留分子量的选择上。

所添加在二级酶反应器中进行二级酶解反应时的第二蛋白酶不同于所添加在一级酶反应器中进行一级酶解反应时所添加的第一蛋白酶，第二蛋白酶具有针对性，可以继续缩短肽链长度，循环酶解后不断滤出目标多肽，从而提高ACE抑制肽的活性。所述第二蛋白酶为胰蛋白酶(国药集团化学试剂)、Protease N(天野酶制剂公司产品)、复合风味蛋白酶(诺维信公司产品)、胃蛋白酶(国药集团化学试剂)中的一种或几种复配。

(5)纳滤浓缩与脱盐：对步骤(3)分离出的CPP与步骤(4)分离出的ACE抑制肽，以截留分子量为150～300Da的纳滤膜进行脱盐浓缩，得到高纯度的酪蛋白磷酸肽和ACE抑制肽。

(6)喷雾干燥：进出风温度分别为140℃～200℃和60℃～100℃，喷雾干燥得到的酪蛋白磷酸肽粉末和ACE抑制肽粉末。

上述工艺，制备酪蛋白磷酸肽的N/P摩尔比为3～14∶1，含原料80％以上的磷，蛋白得率10％～30％，脱盐后酪蛋白磷酸肽产品中灰分含量在8％以下。酪蛋白ACE抑制肽抑制活性达到水解液的3～7倍，酪蛋白转化率＞80％，脱盐后酪蛋白非磷酸肽中灰分含量在8％以下。

本发明集酶促水解反应、一级超滤膜分离、树脂层析分离、二级酶解-超滤膜分离、纳滤脱盐浓缩工序一体化，连续分离制备酪蛋白磷酸肽和ACE抑制肽；相比现有技术具有如下优点：

(1)采用单一或复配蛋白酶水解，建立了高效蛋白酶解工艺，原料利用率达到95％以上，同时分离出CPP与CNPP两类生物活性肽。

(2)采用超滤技术，及时分离出目标多肽、减少底物抑制作用、提高蛋白转化率及酶的利用效率，从而降低成本。

(3)本发明构建了一个完善的分离纯化体系，建立采用大孔弱碱性阴离子交换树脂分离纯化CPP与CNPP的方法，分离度高，操作简单，成本低廉，易于工业化生产。

(4)本发明采用弱碱性树脂分离度高，树脂的预处理简单，再生容易，吸附与解吸迅速，克服了强碱性树脂吸附性能强，解吸拖尾严重，再生能耗大，分离效果差等缺陷。

(5)采用二次酶解-超滤技术，进一步分离ACE抑制肽，使产品活性得到大幅度提高。

(6)采用纳滤脱盐脱苦浓缩工序，去除小分子肽、并提高产品纯度及功能特性。

(7)本发明工艺是酶解和多种分离方法集成，实现连续化操作制备酪蛋白磷酸肽和ACE抑制肽，易于监控及自动化操作。

(8)强化反应过程，大幅度延长有效反应时间，使酶解工艺适于大规模化连续化生产的要求。

(9)本发明制备的CPP与ACE抑制肽未引入任何有机试剂，且无有毒有害试剂污染环境，工艺严格，产品安全无毒，可广泛用于食品、保健品、化妆品等多个领域。

附图说明

图1酶膜反应器与树脂层析耦联制备CPP与ACE抑制肽的工艺流程图；

图2酶膜反应器与树脂层析耦联装置示意图

具体实施方式

本发明提供了一种制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。

本发明是基于图2所示的装置来连续制备CPP与ACE抑制肽产品，图2所示的设备名称为：

1：储料罐、2：一级酶反应器进料泵、3：pH计、4：恒温水浴、5：水浴出水管、6：水浴进水管7：一级酶反应器、8：强力搅拌器、9：超滤设备配套真空泵、10：进口压力计、11：切向流超滤膜堆(其中：真空泵9、进口压力计10、切向流超滤膜堆11组成一级超滤设备)、12：渗流液收集装置、13：回流压力计、14：树脂层析柱进料泵、15：离子交换树脂柱、16：紫外检测器、17：洗脱峰收集装置

实施例1

本实施1方案采用甘肃华羚干酪素有限公司生产食品级酪蛋白，蛋白质含量大于90％。称取酪蛋白1000g，加入10升水置于25L一级酶反应器(图2装置7)中，恒温水浴(图2装置4)进行水浴加热并开动强力搅拌器(图2装置8)充分搅拌，缓慢加入4mol/L的NaOH溶液溶解，配成pH值为8.0～8.5、浓度为10％左右的酪蛋白底物溶液，待温度恒定于50℃后，向一级酶反应器(图2装置7)中加入第一蛋白酶：45mL ALcaLase 2.4L酶液，从加酶开始到酶解反应结束，一级酶反应器(图2装置7)内一直处于均匀的搅拌状态。加酶后开始连续酶解反应并计时，酶解10分钟后，开启一级超滤循环装置(图2装置7～13)，超滤膜平均截留相对分子质量3KDa，使酪蛋白底物溶液以24～25L/h的循环流量，常压稳定循环10min，10min后调节切向流超滤膜堆(图2装置11)的超滤膜操作压力达到0.04～0.05Mpa。超滤过程中，大分子底物及酶(第一回流液)被膜截留返回到一级酶反应器(图2装置7)内继续循环降解，而小于超滤膜平均截留分子量的多肽通过膜组件形成第一渗透液(酪蛋白生物活性肽)，反应过程中通过向一级酶反应器(图2装置7)中流加2mol/L的NaOH溶液维持体系pH在8.0～8.5之间，通过水浴加热维持酶解体系(图2装置7)温度在50℃。当第一渗流液流出时，开启一级酶反应器进料泵(图2装置2)，补加浓度为5％的酪蛋白溶液，补加速度相当于渗流速度，保证一级酶反应器(图2装置7)内体积和酶的有效底物浓度恒定，每隔5h补加8mL酶液维持体系酶活力，使整个装置进行连续酶解反应并不断的分离出目的产物。当超滤膜渗透液流至渗流液收集装置(图2装置12)内并收集到15L时，开启树脂层析柱进料泵(图2装置14)，以每小时1个床体积(床体积约30L)的流速上样至大孔阴离子交换树脂柱(图2装置15)，柱温为45℃，上样体积15L；上样结束，直接水洗脱得到CNPP洗脱峰流至洗脱峰收集装置(图2装置17)内，然后采用0.2MHCl洗脱得到CPP洗脱峰流至洗脱峰收集装置(图2装置17)内。此工艺单元制备的酪蛋白磷酸肽N/P摩尔比达到7.4∶1，经分子量为300Da的纳滤膜脱盐浓缩，纳滤后酪蛋白磷酸肽蛋白质回收率达到80％以上，磷回收率在98％以上，N/P摩尔比达到5.8∶1，产品溶解性100％，脱盐后灰分含量在8％以下。在喷雾塔进出风温度为160℃～180℃和70℃～80℃的条件下，经喷雾干燥制得分子量低于3000的多功能酪蛋白生物活性肽；其中纳滤浓缩与脱盐和喷雾干燥流程中使用的设备(包括CPP和CNPP工艺过程)为业界熟知技术，所以此处附图未示出。

取上述经过洗脱峰收集装置(图2装置17)收集的CNPP部分直接转移到二级酶解超滤设备进行循环反应，层析分离出的CNPP 10L置于与1KDa截留分子量的超滤设备耦联的二级酶反应器中，控制水浴温度为50℃，添加第二蛋白酶：加入6.7g胰蛋白酶酶解，pH维持8.0恒定，同时开启超滤设备连续酶解分离ACE抑制肽，反应过程不断补加酶解底物CNPP，维持二级酶反应器液面恒定(注：二级酶解超滤设备同一级酶解超滤设备一致，只是膜包截留分子量变为1000Da，所以二级酶解超滤设备在图2中未示出，此处省略)。超滤过程中，大分子肽段及酶(第二回流液)回流至二级酶反应器中循环酶解，小分子目标肽透过膜形成第二渗流液。第二渗流液经截留分子量为150Da的纳滤膜脱盐浓缩，此工艺制备的ACE抑制肽活性达到酶解液初始活性的6倍，脱盐过程中灰分含量6％。在进出风温度为160℃～180℃和70℃～80℃的条件下，经喷雾干燥制得分子量低于1000的多功能酪蛋白ACE抑制肽。

实施例2

采用平均截留相对分子质量为10KDa的超滤膜与树脂层析耦合制备酪蛋白磷酸肽和ACE抑制肽，在25L一级酶反应器(图2装置7)中，称取1500g酪蛋白；配制底物浓度为10％的酪蛋白底物溶液15L，升温至50℃，用4mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.0～8.5，向一级酶反应器(图2装置7)中添加45mL Alcalase 2.4L酶液，反应过程中维持体系温度为40℃，pH值为8.0～8.5恒定不变。其他酶解反应及膜分离、树脂层析工艺同实施例1，制得酪蛋白磷酸肽产品N/P比5.4∶1，产品的溶解性100％，纳滤蛋白回收率82％，磷回收率99％，脱盐后灰分为7.5％。ACE抑制肽活性达到酶解液活性的3.5倍，产品的溶解性100％，脱盐后灰分在5.6％。蛋白质的转化率85％。经喷雾干燥制得分子量低于10000的酪蛋白磷酸肽和分子量低于1000的ACE抑制肽。

实施例3

采用平均截留分子量为5KDa的超滤膜与树脂层析耦合制备酪蛋白磷酸肽和ACE抑制肽。称取3000g酪蛋白；在30L一级酶反应器(图2装置7)中，配制底物浓度为10％的酪蛋白底物溶液20L，升温至50℃，用4mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.5，加入第一蛋白酶：胰蛋白酶15g，开始连续酶解反应并计时，酶解30分钟后，再次调节pH8.5，加入复配第一蛋白酶：20mL Alcalase 2.4L，保持10min，开启超滤循环装置(图2装置7～13)，反应过程中维持体系温度为40℃，pH值为8.5恒定不变。树脂层析工艺同实施例1，二次酶解-膜分离操作选用Protease N，加酶量10g，浴温度恒定40℃，pH值维持在7.0左右，超滤膜包截留分子量1KDa。其他工艺同是实施例1，制得酪蛋白磷酸肽产品N/P比5.0∶1，产品的溶解性100％，纳滤蛋白回收率84％，磷回收率98.5％，脱盐后灰分7.8％。ACE抑制肽活性达到酶解液活性的4倍，产品的溶解性100％，脱盐后灰分4.5％，蛋白质的转化率88％。经喷雾干燥制得分子量低于5000的酪蛋白磷酸肽和分子量低于1000的ACE抑制肽。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

步骤A、将酪蛋白加入到一级酶反应器中，在所述一级酶反应器中添加单一或复配的第一蛋白酶进行一级酶解--超滤膜分离制备酪蛋白生物活性肽；采用树脂层析方法从所述酪蛋白生物活性肽中分离磷酸肽和非磷酸肽；

步骤B、将步骤A中分离出的磷酸肽部分通过纳滤浓缩脱盐，然后用喷雾干燥得到磷酸肽粉末产品；

步骤C、将步骤A中分离出的非磷酸肽部分加入到二级酶反应器中，在所述二级酶反应器中添加单一或复配的第二蛋白酶进行二级酶解-超滤膜分离滤出ACE抑制肽，所得ACE抑制肽采用纳滤浓缩脱盐，然后用喷雾干燥得到ACE抑制肽粉末产品。

2.根据权利要求1所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括如下处理步骤：

步骤A1、溶解：在25℃～95℃条件下，将酪蛋白溶解在pH值7～12的碱溶液中，配制成质量浓度为2％～13％w/w的酪蛋白溶液；

步骤A2、一级酶解：将步骤A1配制的浓度为2％～13％酪蛋白溶液加入至所述一级酶反应器作为初始底物，在搅拌状态下向所述一级酶反应器中加入所述第一蛋白酶，采用滴加NaOH溶液的方法维持所述一级酶反应器内的所述第一蛋白酶pH值恒定在6～11之间并维持温度恒定在20℃～70℃，所述第一蛋白酶与所述初始底物质量浓度之比为1∶10～40，经一级酶解后形成所述酪蛋白水解液；

步骤A3、一次膜分离：连续由所述一级酶反应器底部将所述酪蛋白水解液引入一级超滤设备中，滤出第一渗流液，并将所截留的第一回流液返回所述一级酶反应器内循环酶解，所述第一渗流液为酪蛋白生物活性肽；

步骤A4、树脂层析：将所述酪蛋白生物活性肽在树脂层析柱上连续分离纯化，采用大孔阴离子交换树脂通过水洗液分离得到所述非磷酸肽，通过酸洗液分离得到所述磷酸肽。

3.根据权利要求1所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤B具体包括如下处理步骤：

步骤B1、纳滤浓缩与脱盐：所述磷酸肽以截留分子量为150～300Da的纳滤膜进行脱盐浓缩，得到酪蛋白磷酸肽；

步骤B2、喷雾干燥：进出风温度分别为140℃～200℃和60℃～100℃，喷雾干燥得到酪蛋白磷酸肽粉末。

4.根据权利要求1所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述步骤C具体包括如下处理步骤：

步骤C1、二级酶解：将所述非磷酸肽酶解产物加入二级酶反应器中，在搅拌状态下加入第二蛋白酶进行二次酶解，所述第二蛋白酶与非磷酸肽酶解产物质量比1∶10～40，并维持所述二级酶反应器内反应体系温度恒定在20℃～70℃与pH值6～11条件；

步骤C2、二次膜分离：连续由二级酶反应器底部将所述非磷酸肽酶解产物引入二级超滤设备中，所述超滤设备中超滤膜截留分子量为1000Da～3000Da的，滤出第二渗流液，并将所截留的第二回流液返回二级酶反应器内循环酶解，所述第二渗流液为ACE抑制肽；

步骤C3、纳滤浓缩与脱盐：所述ACE抑制肽以截留分子量为150～300Da的纳滤膜进行脱盐浓缩，得到ACE抑制肽；

步骤C4、喷雾干燥：进出风温度分别为140℃～200℃和60℃～100℃，喷雾干燥得到ACE抑制肽粉末产品。

5.根据权利要求1或2所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，第一蛋白酶为胰蛋白酶、胰酶、Protease N、Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或几种复配。

6.根据权利要求1或4所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，第二蛋白酶为胰蛋白酶、Protease N、复合风味蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或几种复配，所述步骤C所添加在二级酶反应器中的第二蛋白酶不同于所述步骤A所添加在一级酶反应器中的第一蛋白酶。

7.根据权利要求2所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述酸洗液为无机酸。

8.根据权利要求2所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，当所述第一渗流液达到0.5～4个柱床体积时，以每小时0.5～3个床体积的流速上样至所述大孔阴离子交换树脂柱，并经220nm紫外检测收集水洗脱峰非磷酸肽CNPP和酸洗脱峰磷酸肽CPP。

9.根据权利要求8所述制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述磷酸肽N/P摩尔比达到3～14∶1，含原料80％以上的磷，蛋白得率10％～30％，脱盐后酪蛋白磷酸肽产品中灰分含量在8％以下。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述ACE抑制肽抑制活性达到水解液的3～7倍，酪蛋白转化率＞80％，脱盐后非磷酸肽中灰分含量在8％以下。

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